JP2012120534A - 同種の分析物検出 - Google Patents

同種の分析物検出 Download PDF

Info

Publication number
JP2012120534A
JP2012120534A JP2012012830A JP2012012830A JP2012120534A JP 2012120534 A JP2012120534 A JP 2012120534A JP 2012012830 A JP2012012830 A JP 2012012830A JP 2012012830 A JP2012012830 A JP 2012012830A JP 2012120534 A JP2012120534 A JP 2012120534A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
dna
binding
binding pair
item
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2012012830A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Adams
アダムス トーマス
Edward Jablonski
ヤブロンスキー エドワード
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iris International Inc
Original Assignee
Iris Molecular Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37570907&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2012120534(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Iris Molecular Diagnostics Inc filed Critical Iris Molecular Diagnostics Inc
Publication of JP2012120534A publication Critical patent/JP2012120534A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/10—DNA staining
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/101—Homogeneous assay format, e.g. one pot reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/131—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a member of a cognate binding pair, i.e. extends to antibodies, haptens, avidin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

【課題】生物学的サンプル中および臨床サンプル中に存在する、感度の高い、大型かつ／もしくは複合体の分析物の検出のための、同種の方法の提供。
【解決手段】同種の、感度の高い分析物の検出のために有用な核酸検出マーカーを含む、所定のかつ限定的な安定性である、新規な結合対組成物を提供する。分析物（特に、臨床関連の分析物）の感度の高い同種の検出のための方法もまた、提供される。第１核酸に結合した第１特異性分子を含む第１結合メンバー、および第２核酸に結合した第２特異性分子を含む第２結合メンバーを有する結合対を提供し、ここで、該第１核酸および該第２核酸は、所定のかつ限定された安定性の二本鎖を形成する。
【選択図】図１

Description

（発明の分野）
本発明は、サンプル中の分析物の存在もしくは濃度を決定するための方法、組成物およびキットに関連する。
（発明の背景）
臨床科学の分野において、疾患の診断およびモニタリングの目的のために、生物学的流体中のタンパク質、薬物、生物および他の分析物の濃度を決定することへの要求が存在する。例えば、心筋梗塞の間、タンパク質は、心臓から放出される。このようなタンパク質の存在、濃度および放出の時間経過を検出することは、心臓発作の診断を補助し得る。
生物学的流体中で現在検出されている、臨床的に関連しているタンパク質のほとんどは、１ｐｇ／ｍｌより高い濃度で存在している。例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺疾患の検出において有用な血清タンパク質であり、これは、男性において通常約０〜４ｎｇ／ｍｌの濃度で存在している。４ｎｇ／ｍｌを超えるＰＳＡレベルは、前立腺疾患（特に前立腺癌）の疑いがある。この濃度範囲は、従来のイムノアッセイ技術によって容易に検出される。しかし、前立腺除去の後、ＰＳＡの濃度は、従来技術によって検出不可能なレベルまで低下する。前立腺除去を受けた癌患者におけるＰＳＡレベルの上昇は、再発を表す。これらの患者をモニタリングするために、ｆｇ／ｍｌの感度を有するアッセイが必要である。
約３５，０００の遺伝子および５００，０００もの多くのタンパク質が、ヒト種に存在すると推定される。このタンパク質 対 遺伝子の大きな相違は、転写後改変（例えば、スプライシング）および翻訳後改変（例えば、リン酸化、グリコシル化）に起因し得る。このような改変は、タンパク質の機能を有意に変更し得る。したがって、僅かな相違でさえ、臨床的に関連し得る。２９０のタンパク質のみが、ヒト血漿中で同定されているが、２Ｄゲルにおいて何千もの点が存在する。ヒト血漿プロテオームは、何十万のタンパク質を含み得、これらは、現在の技術によって検出するには低すぎる濃度で存在する。これらのタンパク質の大部分を検出する方法は、現在利用可能ではない。
低濃度の特定の分析物を検出する困難性は、臨床的アッセイにおいて使用され得る比較的少量のサンプルと抱き合わせである。したがって、タンパク質分析物のための多くのイムノアッセイは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）のような異種方法論に依存している。ここでは、抗体が結合した分析物は、未結合の分析物から物理的に分離される。異種検出方法は、複雑であり、結合分析物を未結合分析物から分離するために多数の工程（例えば、固相への結合工程および反復的な洗浄工程）を必要とする。これらの工程は、非特異的結合をもたらし、そして感度を低下させる；これらは、費用がかかり得、かつ時間がかかり得る。従って、非特異的結合を避ける、高感度の同種アッセイについての需要が存在する。
同種イムノアッセイ（結合した種および遊離の種の物理的分離を必要としないイムノアッセイ）は、低分子（例えば、薬物）について記載されている。これらのアッセイとしては、とりわけ、以下が挙げられる：ＳＹＶＡ’ｓ ＦＲＡＴ（登録商標）アッセイ、ＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ、酵素チャネリングイムノアッセイおよび蛍光エネルギー移動イムノアッセイ（ＦＥＴＩ）（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）；酵素インヒビターイムノアッセイ（Ｈｏｆｆｍａｎ ＬａＲｏｃｈｅ ａｎｄ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）：蛍光偏光イムノアッセイ（Ｄａｎｄｌｉｃｋｅｒ）。これらの方法の全ては、限定的な感度を有し、そしてＦＥＴＩおよび酵素チャネリングを含むいくつかのみしか、大型の多重エピトープ性分析物に適さない。
従って、生物学的サンプル中および臨床サンプル中に存在する、感度の高い、大型かつ／もしくは複合体の分析物の検出のための、同種の方法の需要が存在する。
（発明の要旨）
本発明は、第１核酸に結合した第１特異性分子を含む第１結合メンバー、および第２核酸に結合した第２特異性分子を含む第２結合メンバーを有する結合対を提供し、ここで、該第１核酸および該第２核酸は、所定のかつ限定された安定性の二本鎖を形成する。
特定の実施形態において、この第１特異性分子および第２特異性分子は、レセプターであっても、リガンドであっても、または抗体であってもよい。特異性分子は、互いに同一であっても異なっていてもよい。１つの実施形態において、本発明の特異性分子は、１つの細胞上の２つのレセプターと相互作用する。別の実施形態において、第１特異性分子および第２特異性分子の両方は、モノクローナル抗体であり、これらは、同じ抗原上の異なるエピトープと相互作用し得、従ってサンドイッチ対を含み得る。
この結合対の第１核酸および第２核酸は、代表的に、一本鎖核酸であり、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであり得るが、部分的二本鎖核酸であってもよく、またはそのアナログであってもよい。本発明の特定の実施形態において、少なくとも１つの核酸は、キメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子である。本発明の核酸は、その５’末端もしくはその３’末端を介して結合され得る。本発明の１つの局面において、結合対の１つの核酸は、その５’末端を介して結合し、そして他方の核酸は、その３’末端を介して結合する。核酸間の二本鎖は、核酸の末端の間で形成され得るか、または内部核酸配列を含み得る。好ましい実施形態において、この核酸は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、もしくはＴＭＡによる増幅に適する。
本発明はまた、結合メンバーを用いて分析物を検出するための方法を提供する。１つの実施形態に従い、上述の結合対は、分析物と接触させられて、複合体を形成する。この結合対核酸は、次いで、解離させられ、次いで、再会合させられる。再形成された二本鎖（主に分析物が結合した結合対において見出される）の３’末端の発現の後、この再形成された二本鎖が、代表的にはＰＣＲによる核酸増幅（二本鎖を含む）によって、検出され得る。ＰＣＲプライマーが再形成された二本鎖の３’末端を伸長することによって生成された部位のみに結合し、結合メンバー自体の核酸には結合しない場合、バックグラウンドは有意に低下し得る。
この増幅産物は、種々の方法のいずれかによって検出され得る。これらの方法としては、臭化エチジウムに始まって、銀染色、オートラジオグラフィー、ドットブロッティング、スロットブロッティング、サザンブロッティング、ならびに蛍光分子、蛍光消光分子、化学発光化合物、化学発光消光分子、生物発光化合物もしくは蛍光ヌクレオチドの取り込みが挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、結合対核酸の１つはキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子であり、そして他方の核酸はＤＮＡ分子であり、ここで、この２つの核酸の間で形成される二本鎖は、短いＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド領域および長いＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド領域を有する。この実施形態のインタクトな二本鎖は、安定的であるが、ＲＮＡｓｅによる消化によって不安定化させられ得、これは、分析物に結合していない結合メンバーに起因するバックグラウンドをさらに低下する。
本発明の種々の実施形態は、臨床的に関連するタンパク質、ウイルスおよび細胞の検出のための同種アッセイを作製するために合わせられ得、このアッセイは、特異的でありかつ高感度である。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
以下：
第１核酸に結合する第１特異性分子を含む第１結合メンバー；および
第２核酸に結合する第２特異性分子を含む第２結合メンバー
を含む結合対であって、ここで、該第１核酸および該第２核酸は、所定のかつ限定的な安定性の二本鎖を形成する、結合対。
（項目２）
前記第１特異性分子および前記第２特異性分子が、レセプター、リガンドおよび抗体からなる群から各々独立して選択される、項目１に記載の結合対。
（項目３）
前記第１特異性分子は第１抗体であり、前記第２特異性分子は第２抗体である、項目２に記載の結合対。
（項目４）
前記第１抗体および前記第２抗体が、モノクローナル抗体である、項目３に記載の結合対。
（項目５）
前記第１抗体および前記第２抗体は、独立して、同じ抗原上のエピトープと相互作用する、項目４に記載の結合対。
（項目６）
前記第１抗体および前記第２抗体は、サンドイッチ対を含む、項目４に記載の結合対。
（項目７）
前記第１特異性分子および前記第２特異性分子が、異なる分子と相互作用する、項目２に記載の結合対。
（項目８）
前記異なる分子が、１つの細胞上の２つのレセプターである、項目７に記載の結合対。
（項目９）
前記第１核酸および前記第２核酸が、一本鎖核酸である、項目１に記載の結合対。
（項目１０）
前記第１核酸が配列番号１を含み、そして前記第２核酸が配列番号２もしくは配列番号３を含む、項目１に記載の結合対。
（項目１１）
前記第１核酸および前記第２核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から各々独立して選択される、項目１に記載の結合対。
（項目１２）
前記第１核酸および前記第２核酸のうちの少なくとも１つが、キメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子である、項目１に記載の結合対。
（項目１３）
前記第１特異性分子が前記第１核酸の５’末端に結合し、そして前記第２特異性分子が前記第２核酸の５’末端に結合する、項目９に記載の結合対。
（項目１４）
前記二本鎖は、前記第１核酸の末端の３’末端と前記第２核酸の３’末端との間に形成される、項目１３に記載の結合対。
（項目１５）
前記第１特異性分子が前記第１核酸の５’末端に結合し、そして前記第２特異性分子が前記第２核酸の３’末端に結合する、項目９に記載の結合対。
（項目１６）
前記二本鎖は、前記第１核酸の末端の３’末端と前記第２核酸の内部配列との間に形成される、項目１５に記載の結合対。
（項目１７）
前記核酸ハイブリッドは、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、もしくはＴＭＡによる増幅に適する、項目１に記載の結合対。
（項目１８）
分析物を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）分析物を提供する工程；
（ｂ）結合対を提供する工程であって、該結合対は、以下：
（ｉ）第１核酸に結合した第１特異性分子を含む第１結合メンバー；および
（ｉｉ）第２核酸に結合した第２特異性分子を含む第２結合メンバーを含み、ここで、該第１核酸および該第２核酸は、所定のかつ限定的な安定性の二本鎖を形成する工程；
（ｃ）該結合対を該分析物と接触させ、それによって複合体を形成させる工程；
（ｄ）該二本鎖を解離させる工程；
（ｅ）該第１核酸と該第２核酸とを再会合させ、それによって二本鎖を再形成する工程；（ｆ）該再形成した二本鎖の３’末端を伸長する工程；ならびに
（ｇ）該再形成した二本鎖を検出し、それによって該分析物を検出する工程
を包含する方法。
（項目１９）
前記工程（ｄ）は、前記二本鎖の溶解温度よりも高い温度まで前記複合体を加熱する工程を包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記複合体は、塩を含有する水溶液中で形成され、そして前記工程（ｄ）は、該水溶液の塩濃度を低下させる工程を包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記工程（ｄ）は、該複合体を希釈する工程をさらに包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記工程（ｇ）は、前記再形成した二本鎖を含む核酸分子の増幅および該増幅の産物の検出を包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記増幅は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、もしくはＴＭＡによって達成される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記増幅は、前記工程（ｆ）における前記再形成した二本鎖の３’末端を伸長することによって産生される部位にのみ結合するプライマーを用いるＰＣＲによって達成される、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記増幅の前記産物は、臭化エチジウムによる染色、銀染色、オートラジオグラフィー、ドットブロッティング、スロットブロッティングおよびサザンブロッティングからなる群から選択される方法によって検出される、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記再形成された二本鎖を検出する工程は、第１の一本鎖核酸、第２の一本鎖核酸、前記結合対の二本鎖領域、および前記増幅産物のうちの少なくとも１つに、検出分子を組み込むことによって達成される、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記検出分子は、蛍光分子、蛍光消光分子、化学発光化合物、化学発光消光分子、生物発光分子、放射性分子および蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記第１核酸および前記第２核酸のうちの少なくとも１つは、キメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子であり、前記工程（ｃ）の複合体は、前記工程（ｄ）において前記二本鎖を解離させる前にＲＮＡｓｅによって消化される、項目１８に記載の方法。
（項目２９）
ＰＳＡの検出のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１一本鎖核酸に結合した、前立腺特異的抗原上の第１エピトープを指向するモノクローナル抗体を含む第１結合メンバー、および第２一本鎖核酸に結合 した、前立腺特異的抗原上の第２エピトープを指向するモノクローナル抗体を含む第２結合メンバーを提供する工程であって、該第１一本鎖核酸は、該第２一本 鎖核酸にハイブリダイズし、それによって核酸二本鎖を介して結合する結合対を形成する工程；
（ｂ）該結合対をサンプルに接触させる工程であって、該サンプルは、溶液中にＰＳＡを含み、それによって結合対−ＰＳＡ複合体を形成する工程；
（ｃ）該結合対−ＰＳＡ複合体を加熱して、核酸二本鎖を解離させる工程；
（ｄ）該結合対−ＰＳＡ複合体を、ＰＳＡに結合した結合メンバーの再会合を可能にするが、該溶液中の過剰な遊離の結合メンバーの実質的な再会合を可能にしない条件下でインキュベートする工程；
（ｅ）結合対二本鎖を検出し、それによってＰＳＡを検出する工程
を包含する方法。
（項目３０）
前記第１モノクローナル抗体および前記第２モノクローナル抗体が、共に、ＰＳＡに対するモノクローナル抗体のサンドイッチ対を形成する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプルもしくは組織サンプルからなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記第１一本鎖核酸は、配列番号１を含み、そして前記第２一本鎖核酸は、配列番号２もしくは配列番号３を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記工程（ｃ）は、４５℃で実施され、そして前記工程（ｄ）は、室温で実施される、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記検出工程は、前記二本鎖領域の増幅を包含する、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記増幅は、以下：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼによって前記二本鎖の３’末端を伸長する工程であって、該伸長は、少なくとも１つのプライマー結合部位を生成する工程；および
（ｂ）工程（ａ）の少なくとも１つのプライマー結合部位に相補的である少なくとも１つのプライマーを用いて、該伸長した二本鎖においてポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程を包含する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
細胞の検出のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの細胞を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）第１一本鎖核酸に結合した、該細胞上のエピトープを指向する抗体を含む第１結合メンバー、および第２一本鎖核酸に結合した、該細胞上のエピトープを 指向する抗体を含む第２結合メンバーを提供する工程であって、該第１一本鎖核酸は、該第２一本鎖核酸にハイブリダイズして、それにより核酸二本鎖を介して 結合する結合対を形成する工程；
（ｃ）該結合対をサンプルと接触させ、それによって結合対−細胞複合体を形成する工程；
（ｄ）該核酸二本鎖を解離させる工程；
（ｅ）該二本鎖を、該細胞に結合した結合メンバーの再会合は可能にするが、過剰な遊離の結合メンバーの実質的な再会合を可能にしない条件下でインキュベートし、それによって再形成した二本鎖を生成する工程；
（ｆ）該再形成した二本鎖を含む核酸を検出し、それによって該細胞を検出する工程を包含する方法。
（項目３７）
前記細胞は、細菌細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記動物細胞は、ヒト細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ヒト細胞は、疾患を有する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記第１一本鎖核酸は、配列番号１を含み、そして前記第２一本鎖核酸は、配列番号２もしくは配列番号３を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記第１一本鎖核酸および前記第２一本鎖核酸は、ポリクローナル抗体である、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記第１抗体および前記第２抗体は、同じポリクローナル抗体のアリコートである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記工程（ｄ）は、前記溶液を加熱する工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
前記加熱する工程は、約４５℃で実施される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記加熱工程は、前記二本鎖の溶解温度よりも高い温度で実施される、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記工程（ｅ）は、前記複合体を希釈する工程、および該希釈した複合体を室温でインキュベートする工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目４７）
前記複合体は、少なくとも１０倍希釈される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記複合体は、少なくとも１００倍希釈される、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記工程（ｆ）は、前記再形成した二本鎖を含む核酸を増幅する工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目５０）
増幅は、以下の工程：
（ａ）前記二本鎖の３'末端をポリメラーゼで伸長する工程であって、ここで、伸長は、
少なくとも１つのプライマーのための結合部位を生成する工程；および
（ｂ）工程（ａ）において生成した該結合部位に相補的である少なくとも１つのプライマーを用いて、該伸長した二本鎖におけるポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程
を包含する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記少なくとも１つのプライマーは、配列番号４もしくは配列番号５を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記第１核酸は、その３’末端を介して前記第１抗体に結合し、そして前記第２核酸は、その５’末端を介して前記第２抗体に結合する、項目３６に記載の方法。
（項目５３）
前記第１核酸および前記第２核酸のうちの少なくとも１つは、スペーサーを介してそれぞれの抗体に結合する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
分析物の検出のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）分析物を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）第１一本鎖核酸に結合した、該分析物と相互作用する抗体を含む第１結合メンバーであって、該第１一本鎖核酸は、５’ＤＮＡ配列および３’ＲＮＡ配列を含み、該第１一本鎖核酸は、その５’末端を介して該結合メンバーに結合する工程；
（ｃ）第２一本鎖核酸に結合した、該分析物と相互作用する抗体を含む抗体を含む第２結合メンバーを提供する工程であって、該第２一本鎖核酸は、その３’末 端を介して該結合メンバーに結合するＤＮＡを含み、ここで該第２一本鎖核酸は、該第１一本鎖核酸にハイブリダイズして、それにより、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ リッドおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの両方の領域からなる核酸二本鎖を介して結合する結合対を形成する工程；
（ｄ）該結合対を該サンプルと接触させ、それによって結合対−分析物複合体を形成する工程；
（ｅ）該複合体をＲＮａｓｅで消化する工程；
（ｆ）該核酸二本鎖を解離させる工程；
（ｇ）溶液を、該分析物に結合した結合メンバーの再会合は可能にするが、過剰な遊離の結合メンバーの実質的な再会合を可能にしない条件下でインキュベートし、それによって再形成した二本鎖を生成する工程；
（ｈ）該再形成した二本鎖の３’末端を伸長する工程であって、ここで、該伸長は、少なくとも１つのＰＣＲプライマー結合部位を生成する工程；
（ｉ）該再形成した二本鎖を含む核酸を、工程（ｈ）において生成された少なくとも１つのＰＣＲプライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する工程；ならびに
（ｊ）工程（ｉ）の該増幅された核酸を検出することによって、細胞を検出する工程
を包含する方法。
図１は、結合対についての内容、構成および一般的結合スキームを図示する。 図２は、配列番号１および配列番号２を含む核酸対の二本鎖形成、３’伸長およびＰＣＲ増幅についての一般的スキームを提供する。 図３は、配列番号１および配列番号３を含む核酸対の二本鎖形成、３’伸長およびＰＣＲ増幅についての一般的スキームを提供する。 図４は、９塩基対重複オリゴヌクレオチド鎖および１５塩基対重複オリゴヌクレオチド鎖の両方の実時間ＰＣＲ増幅（ホットスタート）を示す。 図５は、同種のＮＡＤＩＡＴＭの概略図を示す。 図６は、核酸対の方向および二本鎖形成を示し、ここでオリゴヌクレオチドの１つ（配列番号１）は、その３’末端に結合したスペーサーを介して結合しており、そして他方のオリゴヌクレオチド（配列番号３）は、その５’末端を介して直接結合している。 図７は、分析物検出におけるキメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドの使用のためのプロセスを図示する。「Ｒ」は、リボヌクレオチド塩基の位置を示し、「Ｄ」は、デオキシリボヌクレオチド塩基の位置を示し、そして「Ｓ」は、スペーサー分子の位置を示す。 図８は、同種のＮＡＤＩＡＴＭによるＰＳＡの検出のグラフを示す。
（発明の詳細な説明）
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明でしかなく、特許請求されている本発明を制限するものではないことが理解される。本明細書中で使用される場合、特にそうでないことが言及されない限り、単数形の使用は複数を含む。本明細書中で使用される場合、そうでないことが言及されない限り、「または（ｏｒ）」は、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および他の語形（「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）の使用は、限定ではない。
本明細書中で使用される章の表題は、構成目的のみのためのものであり、記載される内容を限定すると解釈されるべきではない。本出願に引用される全ての文献もしくは文献の部分（特許、特許出願、記事、書籍、手引書および論文が挙げられるが、これらに限定されない）は、本明細書によってその全体があらゆる目的のために明白に参考として援用される。
（定義）
本発明の特定の実施形態の説明をさらに進める前に、多くの用語が定義され詳細に記載される。
特別な定義が提供されない限り、本明細書に関連して使用される用語、ならびに本明細書に記載の実験室手順、技術および方法は、それらが属する分野の当業者に公知である。標準的な化学記号および略語は、このような記号により表される正式名と交換可能に使用される。したがって、例えば、用語「水素」および「Ｈ」は、同一の意味を有することが理解される。標準的な技術が、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方、送達、および患者の処置のために使用され得る。標準的な技術が、組換えＤＮＡ方法論、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養などのために使用され得る。当該分野において一般的に達成されるか、または本明細書に記載されるように、反応および精製技術が、例えば、製造者の明細書にしたがってキットを使用して、実行され得る。上記の技術および手順は、当該分野において周知の従来の方法にしたがって、ならびに本明細書の全体に亘って引用および議論される種々の一般的な参考文献およびより特別な参考文献に記載されるように、一般的に実行され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８））（これらは、あらゆる目的のために参考としてこれらの全体において本明細書に援用される）を参照のこと。
「結合メンバー」は、本明細書中で使用される場合、特異性分子と核酸との間に形成される結合体を意味する。結合メンバーと核酸との間に形成された、所定かつ限定的な安定性の二本鎖によって結合した２つの結合メンバーを含む組成物は、「結合対」と呼ばれる。結合対は、分析物と結合して、結合対−分析物複合体を形成し、この複合体は、本明細書中で単に「複合体」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、用語「分析物」とは、アッセイにおいて検出することが望ましく、かつサンプル中に存在し得るあらゆる物質をいう。分析物は、限定せずに任意の物質であってもよい。本発明の好ましい実施形態において、分析物は、天然に存在する抗体のための物質または抗体を調製し得るための物質を含む。この分析物は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ハプテン、炭水化物、脂質、薬物、細胞、細胞小成分（ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）もしくは小器官（例えば、リソソーム（ｌｙｓｏｚｏｍｅ）、ミトコンドリア）または任意の他の種々の生物学的分子もしくは非生物学的分子、それらの複合体もしくは組み合わせであり得る。別の実施形態において、この分析物は抗体である。なお別の実施形態において、この分析物は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびこれらの混合物である核酸またはヌクレオチド誘導体もしくはアナログを含む核酸）である。
本発明の組成物、方法およびキットを使用して検出され得る多価リガンド分析物は、通常、ポリ（アミノ酸）（すなわち、ポリペプチドおよびタンパク質）、多糖類、核酸、およびそれらの組み合わせである。このような組み合わせとしては、細胞成分、組織、細菌、ウイルス、細胞壁、細胞膜、細胞小器官、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、および核などが挙げられる。本発明の一局面にしたがって、特定の分析物は、核酸を含まない。
広範な種類のタンパク質分析物は、本発明の方法を使用して有利に検出され得る。このようなタンパク質分析物は、ファミリー（ｆａｍｉｌｙ）（各々のファミリーは、類似の構造的特徴、生物学的機能、および特定の微生物（特に、疾患原因微生物）への関連性などを有する）にしたがって分類され得る。本発明に関して特に関心のあるタンパク質ファミリーとしては、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカー、組織特異的抗原、および生物兵器（ｂｉｏｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔ）が挙げられる。これらのタンパク質分析物は、血液、血清、血漿、脊髄液、関節液、唾液、尿、精液、人工関節の流体（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、細胞または組織中に存在し得る。
以下は、構造で関連するタンパク質分析物のクラスの例であり、これらは、本発明の組成物、方法およびキットを使用して検出され得る：
プロタミン
ヒストン
アルブミン
グロブリン
硬タンパク質
リン酸化タンパク質
ムコタンパク質。
以下の例は、ヒト血漿で見出される、臨床的に重要なタンパク質であり、これらは、本発明の組成物、方法およびキットを使用して検出され得る：
α１−リポタンパク質
α１−アンチトリプシン
トランスコルチン（ｔｒａｎｓｃｏｒｔｉｎ）
４．６Ｓ−ポストアルブミン（ｐｏｓｔａｌｂｕｍｉｎ）
貧トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｐｏｏｒ）
α１−糖タンパク質
α１χ−糖タンパク質
チロキシン結合グロブリンインターαトリプシンインヒビター（Ｉｎｔｅｒ−α−ｔｒｙｐｓｉｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）
Ｇｃ−グロブリン
（Ｇｃ１−１）
（Ｇｃ２−１）
（Ｇｃ２−２）
ハプトグロビン
（Ｈｐ１−１）
（Ｈｐ２−１）
（Ｈｐ２−２）
セルロプラスミン
コリンエステラーゼ
α２−リポタンパク質
ミオグロビン
Ｃ反応性タンパク質
α２−マクログロブリン
α２−ＨＳ−糖タンパク質
Ｚｎ−α２−糖タンパク質
α２−ニューラミノ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｏ）−糖タンパク質
エリスロポエチン
β−リポタンパク質
トランスフェリン
ヘモペキシン
フィブリノーゲン
プラスミノーゲン
β２−糖タンパク質Ｉ
β２−糖タンパク質ＩＩ
免疫グロブリンＧ
（ＩｇＧ）またはγＧ−グロブリン
分子式：γ２ｋ２またはγ２λ２
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）またはγＡ−グロブリン
分子式：（α２ κ２）ｎまたは（α２ κ２）ｎ
免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）またはγＭ−グロブリン
分子式：（μ２κ２）５または（μ２ λ２）５
免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）またはγＤ−グロブリン（γＤ）
分子式：（．ｄｅｌｔａ．２κ２）または，ｄｅｌｔａ．２λ２）
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）またはγＥ−グロブリン（γＥ）
分子式：（ε２κ２）または（ε２ λ２）
遊離のκ軽鎖およびλ軽鎖
補体因子：
Ｃ’１
Ｃ’１ｑ
Ｃ’１ｒ
Ｃ’１ｓ
Ｃ’２
Ｃ’３
β１Ａ
α２Ｄ
Ｃ’４
Ｃ’５
Ｃ’６
Ｃ’７
Ｃ’８
Ｃ’９。
本発明の組成物、方法およびキットを使用して検出され得る重要な血液凝固因子としては、以下の表に列挙される例が挙げられる。
Figure 2012120534
 本発明の組成物、方法およびキットを使用して検出され得る重要なタンパク質ホルモンとしては、以下が挙げられる：
ペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモン
副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｒｏｍｏｎｅ）
チロカルシトニン（ｔｈｙｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）
インスリン
グルカゴン
リラキシン
エリスロポエチン
メラノトロピン（ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ）（メラニン細胞刺激ホルモン；インターメジン）
ソマトトロピン（成長ホルモン）
コルチコトロピン（副腎皮質刺激ホルモン）
チロトロピン
濾胞刺激ホルモン
黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン）
黄体乳腺栄養ホルモン（ｌｕｔｅｏｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）（ルテオトロピン（ｌｕｔｅｏｔｒｏｐｉｎ）、プロラクチン）
ゴナドトロピン（絨毛性ゴナドトロピン）
組織ホルモン
セクレチン
ガストリン
アンギオテンシンＩおよびＩＩ
ブラジキニン
ヒト胎盤ラクトゲン
サイトカイン
ＩＬ １
ＩＬ ２
ＩＬ ４
ＩＬ ６
ＩＬ ８
ＩＬ１０
ＥＧＦ
ＴＮＦ
ＮＧＦ
癌抗原
ＰＳＡ
ＣＥＡ
αフェトプロテイン
酸性ホスファターゼ
ＣＡ１９．９
ＣＡ１２５
組織特異的抗原
アルカリホスファターゼ
ミオグロビン
ＣＰＫ−ＭＢ
トロポニン
ＢＮＰ
Ｐｒｏ−ＢＮＰ
カルシトニン
ミエリン塩基性タンパク質
神経下垂体由来のペプチドホルモン
オキシトニン
バソプレッシン
放出因子（ＲＦ）ＣＲＦ、ＬＲＦ、ＴＲＦ、ソマトトロピン−ＲＦ、ＧＲＦ、ＦＳＨ−ＲＦ、ＰＩＦ、ＭＩＦ
リシン
ジフテリア毒素
ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｓｍ ｔｏｘｉｎ）
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ。
細菌およびウイルスもまた、本発明の組成物、方法およびキットを使用して検出され得る分析物である。これらの生物学的分析物に含まれるものは、特に以下のものである：
コリネバクテリウム
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
肺炎球菌
Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
レンサ球菌
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｕｓ
ブドウ球菌
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ
ナイセリア
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ
腸内細菌科
大腸菌型
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
サルモネラ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｏｓａ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
赤痢菌
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｃｈｍｉｔｚｉｉ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｒａｂｉｎｏｔａｒｄ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
他の腸内桿菌
Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ
Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ
Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）群
Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｙｉ
Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓ
Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｅ
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｅｓｔｉｓ
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓ
Ｂｒｕｃｅｌｌａｅ
Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ
Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ
Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ
好気性胞子形成桿菌
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ
嫌気性胞子形成桿菌
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔｉｃｕｍ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ
マイコバクテリア
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
放線菌類（真菌様細菌）
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓａｅｌｉ
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｂｏｖｉｓ
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ
Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ
Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
スピロヘータ
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ
Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ
Ｔｒｙｐａｎａｓｏｍｅｓ
マイコプラズマ
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
他の病原体
リケッチア（細菌様寄生生物）
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ
クラミジア（分類不能寄生細菌／ウイルス）
クラミジア因子（命名未定）
真菌
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ
Ｈｉｓｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ
Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
Ｍｕｃｏｒ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ （Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ
）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕａ
Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ
Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｃｈｅｎｋｉｉ
Ｆｌｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ
Ｆｏｎｓｅｃａｃｅａ ｃｏｍｐａｃｔ
Ｆｏｎｓｅｃａｃｅａ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ
Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ
Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｍｙｃｅｔｏｍｉ
Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓｅａ
Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ
Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ
Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｊｅｌｌｏｉ
Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ
Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｄｏｕｉｎｉ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ
ウイルス
アデノウイルス
ヘルペスウイルス
Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ
Ｖａｒｉｃｅｌｌａ（水疱）
Ｈｅｒｐｅｓ Ｚｏｓｔｅｒ（帯状疱疹）
Ｖｉｒｕｓ Ｂ
サイトメガロウイルス
ポックスウイルス
Ｖａｒｉｏｌａ（天然痘）
ワクシニア
ウシポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｂｏｖｉｓ）
パラワクシニア
伝染性軟属腫
ピコルナウイルス
ポリオウイルス
コクサッキーウイルス
ＥＣＨＯウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）
ライノウイルス
ミクソウイルス
パラインフルエンザ（１−４）
流行性耳下腺炎ウイルス
ニューカッスル病ウイルス
麻疹ウイルス
リンダーペストウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ）
イヌジステンパーウイルス
ＲＳウイルス
風疹ウイルス
アルボウイルス
東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）
西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）
シンドビスウイルス
チクングニヤウイルス
セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ）
マヨラウイルス（Ｍａｙｏｒａ Ｖｉｒｕｓ）
セントルイス脳炎ウイルス
発疹チフスリケッチア
カリフォルニア脳炎ウイルス
コロラドダニ熱ウイルス
黄熱病ウイルス
デング熱ウイルス
レオウイルス
レオウイルス１〜３型
レトロウイルス
ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ（ＨＩＶ）
ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩおよびＩＩ（ＨＴＬＶ）
肝炎
Ａ型肝炎ウイルス
Ｂ型肝炎ウイルス
Ｃ型肝炎ウイルス
腫瘍ウイルス
ラッシャー白血病ウイルス
グロスウイルス
マロネー白血病ウイルス（Ｍａｌｏｎｅｙ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）
ヒトパピローマウイルス。
さらに、患者の正常な組織もしくは細胞または罹患した組織もしくは細胞を検出することが望ましくあり得る。特定の循環する癌または他の細胞の存在または不在は、例えば、疾患のための診断になり得る。したがって、ヒト患者の内因性細胞は、本発明の組成物、方法およびキットを使用して有利に検出され得る分析物である。
用語「サンプル」は、本明細書中で使用される場合、物質（多くの場合、生物学的材料に由来する水溶液もしくは水性懸濁液）のアリコートを意味する。本発明の方法によって分析物の存在についてアッセイされるサンプルとしては、例えば、細胞、組織、ホモジネート、溶解物、抽出物、精製されたタンパク質もしくは部分的に精製されたタンパク質および他の生物学的分子ならびにその混合物が挙げられる。代表的に本発明の方法において使用されるサンプルの非限定の例としては、以下が挙げられる：ヒトおよび動物の体液（例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液、痰、気管支洗浄液、気管支吸引物、尿、リンパ液ならびに気管、腸管および生殖管の種々の外部分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫など）；細胞培養物上清のような生物学的流体；組織標本（固定されていても固定されていなくてもよい）；ならびに細胞標本（固定されていても固定されていなくてもよい）。
本発明の方法において使用されるサンプルは、アッセイ形式、およびアッセイされる組織、細胞、抽出物、または他の材料（特に生物学的材料）の性質に基づいて変動する。細胞もしくは他のサンプルから、例えば、ホモジネートおよび抽出物（例えば、タンパク質抽出物）を調製するための方法は、当該分野で周知であり、そして、本発明に適合性であるサンプルを得るために容易に適合され得る。
用語「接触」は、本明細書中で使用される場合、一般に、成分、試薬、分析物もしくはサンプルの、他への接近を提供することをいう。例えば、接触は、結合対を含む溶液と分析物を含むサンプルとを混合することを包含し得る。１つの成分、試薬、分析物もしくはサンプルを含む溶液はまた、他の成分もしくは試薬（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくは界面活性剤）を含み得、これらは、混合、相互作用、組み込み、または成分、試薬、分析物および／もしくはサンプルの間の接触に有利である他の物理現象もしくは化学現象を促進し得る。本発明の１つの実施形態において、接触は、送達装置（例えば、ピペットベースのデバイスもしくはシリンジベースのデバイス）を用いて、結合対を含む溶液を、分析物を含むサンプルに添加することを包含する。
本明細書中で使用される用語「検出」は、所定の分子の存在を評価する任意の方法をいう。これを達成するために使用される技術としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：ＰＣＲ、ヌクレオチド配列決定、ＰＣＲ配列決定、分子ビーコン技術、ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびその後のＰＣＲ、蛍光、放射性標識、リン光および吸光度。検出のために使用され得る試薬の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性標識、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、蛍光、リン光、生物発光、化学発光、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンもしくはストレプトアビジン）および当業者に周知である他の試薬。
本明細書中で使用される場合、用語「識別可能」は、異なるマーカー、種もしくは分析物の間を実験的に識別する能力を意味する。本発明の特定の実施形態において、本発明の結合対もしくはアッセイは、多数の分析物を検出するために使用され得る。特定のこれらの実施形態において、長さおよび配列の両方において同一である配列を構成する核酸マーカーは存在しない。２種のマーカーは、同一のコア配列を有し得るが、これらのマーカーは、大きさおよび／または異なる配列に基づいて識別可能である。好ましい実施形態において、検出産物は、長さにおいて異なる。他の実施形態において、マーカーは、異なる配列特異的プローブに結合する配列を有する。これらの実施形態は限定ではなく、そして他の実施形態が、本発明によって使用されることが想定され得る。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸（分子）」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいうために、交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそのアナログを含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、そして既知もしくは未知の任意の機能を果たし得る。用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖分子、二本鎖分子および三重螺旋状分子を含む。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸（代表的にはＤＮＡ）の、５と約１００との間のヌクレオチドのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーもしくはオリゴとしても知られ、そして遺伝子から単離され得るか、または当該分野で公知の方法によって、（例えば、化学的にもしくは酵素学的に）合成され得る。「プライマー」は、通常は一本鎖の、酵素媒介型核酸合成の開始のための３’−ヒドロキシル末端を提供する、オリゴヌクレオチドを意味する。以下は、ポリヌクレオチドの非限定の実施形態である：遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。核酸分子はまた、改変核酸分子（例えばメチル化核酸分子および核酸分子アナログ）を含み得る。プリンおよびピリミジンのアナログは、当該分野で公知であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アジリジニルシトシン（ａｚｉｒｉｄｉｎｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−マルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、プソイドウラシル、５−ペンチルニルウラシルおよび２，６−ジアミノプリン。デオキシリボ核酸におけるチミンの代替としてのウラシルの使用もまた、ピリミジンの類似形態とみなされる。
糖改変（例えば、２’−ｏ−メチル、２−フルオロなど）およびリン酸骨格改変（例えば、モルホリノ、ＰＮＡ’、チオアート、ジチオアートなど）は、単独で、もしくは組み合わせて、本発明の核酸分子に組み込まれ得る。１つの実施形態において、例えば、本発明の核酸は、改変された糖および改変されたリン酸骨格を含み得る。別の実施形態において、本発明の核酸は、糖、塩基およびリン酸骨格への改変を含み得る。
用語「核酸マーカー」とは、核酸増幅反応（例えばＰＣＲ反応）において適切に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用される場合に予測されたサイズもしくは他の選択された特性の検出産物を産生する核酸分子を意味する。当業者は、ＰＣＲのための適切なオリゴヌクレオチドプライマーの設計をよく知っており、そして本発明の局面を容易にするプログラムは、購入可能であり、そしてインターネットを通じて利用可能である（例えば、以下のｈｔｔｐサイトを参照のこと：ｂｉｂｉｓｅｒｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｇｅｎｅｆｉｓｈｅｒ）。核酸マーカーは、直鎖状であっても、環状であってもよい。好ましい実施形態において、核酸マーカーは、選択されたプライマーについての結合部位（各末端もしくはその近くに位置する）を有する、所定の直鎖状核酸配列を含む。環状ＤＮＡ分子において、プライマーは、末端に存在するよりむしろ内部に存在し、そして（例えば、ローリングサークル増幅のために）１つのプライマーが使用される。増幅されたＤＮＡは、任意の利用可能な方法を用いて検出され得る。これらの方法としては、実時間ＰＣＲ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ染色もしくは臭化エチジウム染色のような技術が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の他の実施形態において、増幅プライマーのための結合部位は、所定の長さの規定されないＤＮＡ配列、もしくは規定されない配列に加えて別の同定可能な特性（例えば検出可能な配列）を含むＤＮＡ配列の、両側に位置する。いくつかの実施形態において、核酸マーカーは、増幅された配列の大きさもしくは質量によって識別可能である；従って、プライマーの間のＤＮＡ配列は、正確な配列として規定される必要はなく、塩基の数として規定されるだけでよい。あるいは、分子ビーコン（後出）への結合部位の長さが供給される限り、核酸マーカー全体の大きさおよび／または配列は、規定される必要はない。さらなる実施形態において、プライマー結合部位の間に位置するＤＮＡ配列は、ＰＣＲ反応の間に検出され得る「特性同定配列」を含む。蛍光シグナル生成は、例えば、配列特異的（分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、蛍光発生プライマー（例えば、ＬＵＸＴＭプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．））または質量依存的（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、臭化エチジウム）であり得る。提供された例は、当業者が本発明の方法における使用のための適切な代替マーカーであることを認識するような、可能性のある核酸検出スキームの徹底的な列挙であることを意味しない。
用語「特異性分子」は、本明細書中で使用される場合、別の分子に特異的に結合可能である任意の分子をいう。１つの実施形態において、特異性分子は、抗体である。本発明の他の実施形態において、特異性分子としては、限定されないが、以下が挙げられる：生物学的レセプター分子（例えば、インスリンレセプター）；レセプターに対するリガンド（例えば、インスリンレセプターについてのインスリン）；抗原（例えば、抗体に結合するための抗原）、ならびに、別の分子（例えば、ビオチンおよびアビジン）に対して親和性を有する、生物学的分子、化学分子または他の分子。本発明の特異性分子は、天然に存在する分子の全体を含む必要はなく、天然に存在する分子の一部分、フラグメントもしくはサブユニットのみから構成され得る（例えば、抗体のＦａｂフラグメント）。特異性分子は、当該分野で公知の任意の方法によって生成され得る。例えば、抗体は、ハイブリドーマ組織培養物上清もしくは腹水から調製される抗血清において見出され得るか、または、当該分野で周知であるように、組換え発現系に由来し得る。例えば、抗体、レセプターもしくは他の種のフラグメント、部分もしくはサブユニットは、化学的手段、酵素的手段もしくは他の手段によって生成され得、例えば、周知の分子（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’）もしくは新規な分子を生じ得る。本発明はまた、特異性分子が、組換え分子、キメラ分子およびハイブリッド分子（例えば、ヒト化抗体および霊長類化抗体、ならびに他の天然に存在しない抗体形態）を含み得ることを企図する。当業者は、抗体の種々の形態を記載する上記の非限定の例はまた、他の特異性分子にも拡張され、従って、非抗体分子の例えば組換え形態、キメラ形態、ハイブリッド形態および短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態が、本発明の方法において使用され得ることを、理解する。
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」および「特異的な結合」により、抗体または他の分子（特に、本発明の親和性分子）が、本発明の特定の条件下で、他の分子に結合する親和性よりも大きな親和性で、標的（例えば、抗原、リガンドまたは他の分析物）に結合することが意味される。当該分野で公知であるように、抗体または抗体フラグメントは、他の分子（例えば、抗原）に結合することができる領域を含むポリペプチド分子である。本発明の種々の実施形態において、「特異的に結合する」とは、抗体または他の親和性分子が、標的分子に無関係な分子に結合する親和性よりも、少なくとも約１０６倍大きな親和性、好ましくは少なくとも約１０７倍大きな親和性、より好ましくは少なくとも約１０８倍大きな親和性、および最も好ましくは少なくとも約１０９倍大きな親和性で、標的分析物分子に結合することを意味し得る。代表的に、特異的な結合とは、非特異的結合よりも、約１０６倍〜約１０９倍高い範囲の親和性をいう。いくつかの実施形態において、特異的な結合は、非特異的結合よりも１０９倍高い親和性により特徴付けられ得る。「１〜１０」のように、本明細書に範囲が現れる場合にはいつでも、この範囲は、限定することなく、所定の範囲での各々の整数または尺度の単位をいう。したがって、１〜１０により、各々の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０およびこの間の任意の下位単位（ｓｕｂｕｎｉｔ）が意味される。
「ポリクローナル抗体」または「ＰＡｂ」は、抗原またはその抗原性の機能性誘導体で免疫化した動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、宿主動物（例えば、ウサギ、マウスおよびヤギ）は、必要に応じてアジュバントを補充した、抗原またはハプテン−キャリア結合体での注射により、免疫化され得る。ポリクローナル抗体は、抗血清中の他の種から精製されていなくても、精製されても、部分的に精製されてもよい。ポリクローナル抗体 の調製および精製のための技術は、当該分野において周知であり、種々の一般的な参考文献およびより特別な参考文献（Ｋａｂａｔ＆Ｍａｙｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版（Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ（１９６１））；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８））；およびＷｅｉｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９６））が挙げられるが、これらに限定されない）に記載される。
「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」（これらは、特定の抗原に対する抗体の均質な集団である）は、抗体分子の生成を提供する任意の技術（例えば、細胞株の連続培養）により取得され得る。これらの技術としては、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７（１９７５）ならびに米国特許第４，３７６，１１０号のハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−３０（１９８３））；ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７７−９６（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラスを含む）であり得る。本発明のＭＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。インビボでの高力価のＭＡｂの生成は、現在好ましい生成方法である。
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともに適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプラシングすることによる「キメラ抗体」の生成のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−５４（１９８５））が使用され得る。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスＭＡｂに由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するもの）であり得る。
あるいは、一本鎖抗体の生成に関して記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−８３（１９８８）；および、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５４４−４６（１９８９））は、本発明での使用に適する遺伝子−一本鎖抗体を生成するために適合され得る。一本鎖抗体は、代表的に、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを連結し、一本鎖ポリペプチドを生じることによって形成される。
特異的なエピトープを認識する抗体は、公知の技術により生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、
Ｆａｂ発現ライブラリが構築され得（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−８１（１９８９））、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定が可能になる。
本明細書で使用される場合、用語「ハプテン」とは、抗体により認識され得る、小さなタンパク質様抗原決定基または非タンパク質性抗原決定基をいう。代表的に、ハプテンは、より大きな種の一部を除いて、動物において抗体形成を誘発しない。例えば、小さなペプチドハプテンは、抗ハプテン抗体応答を生成するために、しばしばキャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン）に連結される。「抗原」は、動物において抗体応答を生成し得、生じる抗体によって認識され得る高分子である。抗原およびハプテンの両方が、少なくとも１つの抗原決定基または「エピトープ」を含み、これは、抗体に結合する抗原またはハプテンの領域である。代表的に、ハプテン上のエピトープは、その分子全体である。
「サンドイッチ対抗体」または「サンドイッチ抗体対」との用語は、本明細書において使用される場合、サンドイッチ型イムノアッセイにおいて使用されるのに適切な、代表的には、単一特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体）のペア（対）をいう。このペアの抗体の各々は、同一分子上の異なるエピトープに結合し、この対の抗体の両方ともが、同時にその抗原に結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて適切な抗体の対を同定する方法は、当業者にとって周知である。当業者はまた、多様な他の分子がサンドイッチ対として使用され得ることを認識している。例えば、レセプター被検体は、そのレセプターに対するリガンドとそのリガンドの結合には関係ないレセプター上のエピトープに結合する抗体との間に挟まれる。したがって、抗体とリガンドは、レセプター被検体のためのサンドイッチ対として使用され得る。
「レセプター」または「生物学的レセプター」とは、代表的に、細胞内または細胞表面上の分子構造をいい、これは、特異的な物質（例えば、「リガンド」）に選択的に結合し、その結合に付随する特異的な生理的効果を生じることにより特徴付けられる。レセプターの例としては、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体フラグメントおよび免疫グロブリンに対する細胞表面レセプター、ならびにステロイドホルモンに対する細胞質レセプターが挙げられる。しかしながら、本明細書で使用される場合、レセプターは、代表的に単離および精製され得、そして生理的効果も他の生物学的効果も必ずしも生じないか、または生じ得ない。本発明の方法は、特異的な物質へのレセプターの選択的な結合を利用する。
用語「リガンド」とは、一般的にレセプターに結合する分子をいう。代表的に、リガンドは、ホルモンまたは神経伝達物質のような小さな可溶性分子である。
用語「固体支持体」とは、例えば、分析物、抗体または複合体を固定化するために使用され得る任意の固相をいう。適切な固体支持体は当該分野において周知であり、これらとしては以下が挙げられる：反応トレイ（例えば、マイクロタイタープレート）のウェルの壁、試験管の壁、ポリスチレンビーズ、常磁性ビーズもしくは非磁性ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ラテックス粒子のような微粒子、およびヒツジ（または他の動物）赤血球。固体支持体のための代表的な材料としては、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン、セルロース、ナイロン、ラテックスおよびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、固体支持体は、所望の分子（例えば、分析物）の付着を促進するか、および／または、非特異的結合もしくは他の望ましくない相互作用を阻止するために、コーティング、誘導体化またはその他の方法で改変され得る。特定の「固相」を選択することは常に重要であるとは限らず、これは、使用されるアッセイに依存して、当業者により選択され得る。したがって、ラテックス粒子、微粒子、常磁性ビーズもしくは非磁性ビーズ、メンブレン、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスチップまたはシリコンチップ、および赤血球は全て適切な固体支持体である。便利なように、固体支持体は、種々の検出方法に適合するように選択され得る。例えば、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートが、例えば、ロボットワークステーション（ｒｏｂｏｔｉｃ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）により自動化されるか、および／または、例えば、プレートレーダーを使用して検出されるアッセイに使用され得る。フィルムベースの可視化を利用するオートラジオグラフィー検出工程または化学発光検出工程を含み得る本発明の方法に関して、この固体支持体は、ニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレンのような薄いメンブレンであり得る。サンドウィッチ免疫アッセイ（ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が実行される本発明の一実施形態にしたがって、代表的に、反応トレイのウェルの壁が使用される。本発明の代替の実施形態において、常磁性ビーズが固体支持体として使用され得る。固相上に分子を固定化するために適切な方法としては、イオン性相互作用、疎水性相互作用および共有結合性相互作用など、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。しかしながら、固定化法は、概して重要ではなく、特徴付けられていない吸着機構を含み得る。したがって、本明細書で使用される「固体支持体」とは、不溶性であるか、続く反応により不溶性にされ得る任意の材料を言及し得る。固体支持体は、捕捉試薬を誘引および固定化するその固有の能力に関して、選択され得る。あるいは、この固相は、捕捉試薬を誘引および固定化する能力を有するさらなるレセプターを保持し得る。このさらなるレセプターは、捕捉試薬それ自体またはこの捕捉試薬に結合体化された荷電物質のいずれかに対して、反対に荷電されている物質を含み得る。本発明のなお別の実施形態において、さらなるレセプター分子は、固相に固定化（結合）され、特異的な結合反応を介して捕捉試薬を固定化する能力を有する、任意の特異的な結合メンバーであり得る。このさらなるレセプター分子は、このアッセイの実行前または実行中に、固相への捕捉試薬の間接的な固定化を可能にする。したがって、この固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｌａｓｔｉｃ）、常磁性金属もしくは非磁性金属、試験管のガラス表面もしくはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、または当業者に公知な他の形態であり得る。
「ペプチド」とは、一般的に、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短い鎖をいう。代表的に、ペプチドは、約２〜１００アミノ酸、より代表的には約４〜５０アミノ酸、最も一般的には約６〜２０アミノ酸のアミノ酸鎖を含む。一般的に、「ポリペプチド」とは、代表的にペプチドよりも長い個々の直鎖配列または分枝鎖配列のアミノ酸をいう。「ポリペプチド」は、通常、少なくとも約１００〜１０００アミノ酸長、より代表的には少なくとも約１５０〜６００アミノ酸、そしてしばしば少なくとも約２００〜約５００アミノ酸を含む。「タンパク質」としては、単一のポリペプチド、および複数のポリペプチド鎖の複合体が挙げられ、これらのポリペプチド鎖は同一であり得るか、または異なり得る。タンパク質内の複数の鎖は、二次構造、三次構造および四次構造ならびに一次アミノ酸配列構造によって特徴付けられ得、例えば、ジスルフィド結合によってともに保持され得、そして合成後改変（例えば、限定せずに、グリコシル化、リン酸化、切断または他のプロセシング）を含み得る。ＩｇＧタンパク質のような抗体は、例えば、ジスルフィド結合によってともに保持される４本のポリペプチド鎖（すなわち、２本の重鎖および２本の軽鎖）から構成される。さらに、タンパク質は、さらなる成分（例えば、付随する金属（例えば、鉄、銅、および硫黄）、または他の部分）を含み得る。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の定義としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：生物学的に活性な形態および不活な形態；変性形態およびネイティブな形態；ならびに、これらの変異体形態、改変された形態、切断形態、ハイブリッド形態およびキメラ形態。本発明のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の供給源に由来し得るか、または任意の方法（天然に存在する組織または他の材料からの抽出；宿主生物（例えば、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞）での組換え生成；および、当業者に周知の方法を使用する化学合成が挙げられるが、これらに限定されない）によって取得され得る。
本明細書で使用される用語「結合体」とは、ともに共有結合されているか、またはその他の方法でともに連結されている２つの分子をいう。一実施形態において、核酸結合体は、核酸をタンパク質、ポリペプチドまたは他の親和性分子に共有結合させることにより生成される。本発明の好ましい実施形態において、タンパク質、ポリペプチドまたは他の親和性分子は、連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）を介して核酸に共有結合され、結合体を形成する。
本発明の方法によって、サンプル中の分析物の存在を検出するための「キット」は、例として、その中に配置される、選択された分析物に特異的な結合対（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｉｒ）を有する少なくとも１つの収容手段を含み得る。キットは、少なくとも１つの以下のものを含む他の容器をさらに含み得る：分析物の検出を実行するために必要な緩衝液、溶液または他の試薬および材料；結合対の核酸プローブ成分を増幅させることができる試薬；ならびに、増幅後に核酸の存在を検出することができる試薬。好ましくは、このキットは、使用説明書をさらに含む。診断上の使用が意図される場合、キットはまた、ＦＤＡに認可された使用の通知およびそのための説明書も含み得る。
詳細には、区分化されたキットは、試薬が別個の容器に含まれる任意のキットを含む。このような容器としては、小さなガラス容器、プラスチック容器またはプラスチック細片もしくは紙の細片が挙げられる。このような容器は、一方の区画から他方の区画への試薬の効率的な移行を可能にし、サンプルと試薬とが相互に混入せず、そして各々の容器の因子または溶液を、定量的な様式で一方の区画から他方の区画に添加することができる。このような容器は、以下を含み得る：試験サンプルを受容する容器、アッセイで使用されるプローブまたはプライマ−を含む容器、緩衝液および試薬（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、およびＴｒｉｓ緩衝液など）を含む容器、ならびに、マーカー核酸、および増幅された産物などを検出するために使用される試薬を含む容器。当業者は、事前に形成された結合対および／または材料、結合対を調製するために必要とされる供給品および試薬が、当該分野で周知の確立されたキット様式に容易に取り込まれ得ることを容易に認識する。
本発明の方法によって抗体または他の親和性分子へＤＮＡをカップリングさせるためのキットは、その中に配置される、凍結乾燥され活性化されたＤＮＡを有する少なくとも１つの収容手段を含み得る。このキットは、１つ以上の以下のものを含む他の容器をさらに含み得る：反応後に核酸の存在を検出することができる試薬、緩衝液および因子。好ましくは、このキットは使用説明書をさらに含む。本明細書に記載の分析物を単離およびアッセイするための新規な組成物および方法を作製または使用するためのキットは、既成の微粒気泡または微粒気泡を生成するために使用される薄膜を含み得る。同様に、キットの微粒気泡は、既に付着した親和性分子を含んでも含まなくてもよい。キットは、１つ以上の以下のものを含む他の容器をさらに含み得る：微粒気泡を作製することができるか、または、親和性単離、精製、濃縮などの方法に微粒気泡を活用するのに有用な試薬、緩衝液および因子。好ましくは、このキットは、使用説明書をさらに含む。当業者は、本発明に記載される組成物および方法が、当該分野で周知の確立されたキット様式に容易に取り込まれ得ることを容易に認識する。
（同種分析物検出アッセイ）
本発明は、一般に、分析物の検出（特に同種の感度の高い分析物検出）のための所定の条件下で所定のかつ限定的な安定性である、新規な核酸標識された結合対の使用のための、組成物、方法およびキットを提供する。
（結合対）
１つの実施形態において、本発明は、分析物の検出のために有用である結合対を提供する。本発明の結合対は、２つの結合メンバーの間に形成され、各々のメンバーは、核酸に結合した特異性分子を有する（図１に示す）。結合メンバーの核酸成分は、その長さの少なくとも一部分にわたって相補的であり、そして二本鎖を形成し得、この二本鎖を介して結合対の２つのメンバーが結合する（図１参照）。
（結合対の特異性分子成分）
各結合対の特異性分子は、この対の所望の分析物に対する相互作用を指向する。本発明の特異性分子は、上で記載されたように、別の分子（例えば分析物）と相互作用可能な任意の分子であり得る。好ましい実施形態において、特異性分子は、高い特異性および親和性で分析物と相互作用する。
本発明の１つの局面において、特異性分子は、レセプターである。別の局面において、特異性分子は、リガンドである。本発明のなお別の局面において、特異性分子は、抗体である。
結合対の個々の特異性分子は、同じ型の分子であってもよく、または異なる型の分子であってもどちらでもよい。１つの実施形態において、対における特異性分子の両方は、レセプターである。別の実施形態において、対における特異性分子の両方は、リガンドである。別の実施形態においては、どちらも抗体である。なお別の実施形態においては、どちらも抗原である。なお別の実施形態において、１つの特異性分子は、リガンドであり、そして他の特異性分子は、レセプターである。なお別の実施形態において、結合対における特異性分子の１つもしくは両方は、核酸である。この実施形態の１つの局面において、標的分析物は、相補的核酸である。この実施形態に別の局面において、標的分析物は、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質であるか、またはこれらの複合体の成分である。この実施形態のなお別の局面において、標的分析物は、核酸とタンパク質とを含む複合体であり、そして結合対の特異性分子の１つは、標的分析物の核酸成分に相補的である核酸であり、そして結合対の他の特異性分子は、標的分析物のタンパク質成分に特異的に結合するタンパク質（すなわち、抗体、抗原、リガンド、レセプターなど）である。好ましい実施形態において、結合対の少なくとも１つの特異性分子は、抗体である。
抗体は、特異性分子として特に有用である。上で記載された全ての型の抗体は、結合対に対する特異性を付与するために有用であり、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、短縮型抗体、単鎖抗体など。
結合対を形成するために２つの抗体が使用される場合、この２つの抗体は、同じかもしくは異なる特異性を有し得る。本発明の１つの実施形態において、この２つの抗体は同じエピトープを認識し、そしてこのエピトープは、１つの分析物中に多数回存在する。例えば、結合対における抗体の両方が、細胞の表面上に多くのコピー数で存在する。別の実施形態において、この抗体は、１つの分析物分子において異なるエピトープを認識する。本発明の特定の局面において、両抗体は、１つの分析物分子に同時に結合し得る。本発明のこの局面のいわゆる「サンドイッチ対」抗体は、当該分野で周知である。
（結合対の核酸成分）
結合対における各特異性分子は、核酸分子と結合され、すなわち、核酸分子で「標識される」（すなわち、核酸マーカー）。本発明の１つの局面に従って、この核酸は、一本鎖である。別の局面において、この核酸は、部分的に一本鎖である。なお別の実施形態において、この核酸は、全てＤＮＡであるか、全てＲＮＡであるか、またはＤＮＡとＲＮＡとの混合である。他の実施形態において、ヌクレオチドアナログもしくはヌクレオチド誘導体が、使用され得る。別の実施形態において、核酸の一部もしくは全てとして、ＰＮＡが使用される。特異性分子は、核酸の３’末端もしくは５’末端のいずれかと結合され得る。本発明の１つの実施形態において、結合対における２つの核酸の末端の自由な端は、相補的であり、それにより、これらは、ハイブリダイズして、限定的かつ所定の安定性の二本鎖核酸領域を形成し得る。この実施形態の１つの局面において、二本鎖を形成する末端の自由な端は、核酸の３’末端である。別の局面において、結合対の１つの核酸の末端の自由な端は、この１つの核酸の末端以外の点で、この結合対の他の核酸の配列と相補的である。本発明の１つの局面において、第１核酸の３’末端は、第２核酸の内部配列と二本鎖を形成する。特定の実施形態において、この核酸は、１つ以上のリンカーもしくはスペーサーを介して、特異性分子と結合する。
本発明の核酸のヌクレオチド配列は、これらが果たすことを必要とされる機能的役割よりも重要ではない。従って、結合対の核酸成分が、これらが果たすことを必要とされる機能的役割をなお果たし得る限り、核酸の配列および結合対の核酸成分の長さは、かなり変動し得る。重要なことには、結合対の核酸の配列および長さは、本明細書中に開示される例示的な結合対の正確な配列および長さに限定されない。結合対の核酸は、従って、異なる長さの核酸または異なる配列の核酸であり得る。本発明の結合対の核酸成分の重要な機能は、分析物検出のための非常に感度の高い標識を提供することである。１つの実施形態において、この核酸は、分析物濃度の指標として、増幅され、そして検出される。この核酸は、非常に確立された方法を用いて増幅され得る。例示的な増幅方法としては、種々の米国特許に記載されている方法が挙げられ、これらの内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される：ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号参照）、ＴＭＡ（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号参照）；ＳＤＡ（例えば、米国特許第５，２７０，１８４号参照）、およびＬＣＲ（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号参照）。
広範な種々のヌクレオチド配列が、増幅のために使用され得る。同様に、核酸の長さは、かなり変動し得る。１つの実施形態において、本発明の核酸は、増幅され得る効率を上昇させるために、分子内ヘアピン形成を避けることが望ましい。本発明の特定の局面において、核酸は、非特異的な介入性（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）を用いて検出される。この実施形態に従って、検出シグナルの強度は、検出される核酸の長さの関数である。
核酸二本鎖の安定性は、この二本鎖中の核酸鎖の間の相補的な領域の長さに部分的に依存することが、周知である。核酸の間のより長い相補的領域、すなわち「重複」は、形成される二本鎖の安定性を増大する。逆にいえば、より短い重複は、より安定性の低い二本鎖をもたらす。本発明の核酸は、長さ、温度、溶媒および他の条件を変えることによって操作し得るような、所定の安定性を有するように設計される。ハイブリッドの安定性に影響する因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸標識化結合対の濃度、塩濃度、温度、有機溶媒（例えば、エタノール）、ＤＭＳＯ、テトラメチルアンモニウムイオン（ＴＭＡ＋）、塩基対ミスマッチなど。
本発明の１つの局面において、核酸は、内部結合対二本鎖を形成するように設計される。本発明の別の局面において、結合対の核酸二本鎖は、所定の条件下で解離され得、従って、特定の条件下で限定的な安定性を有する。
本発明の実施形態において、反応条件は、その各々の標的分析物に結合した結合対のメンバーの間の二本鎖形成を最大にし、一方、標的分析物に結合していない結合対のメンバーの間の二本鎖形成を最小にするように設計される。別の実施形態において、この二本鎖は、分析物に結合している間は安定性を維持するが、アッセイの実施者によって選択的に解離され得るか、溶解され得る。
これらの条件下において、熱力学的条件は、未結合対がハイブリダイズしないようにする。本発明の特定の実施形態において、分析物に結合しない結合対は、約１％未満である。他の実施形態において、分析物に結合しない結合対は、約０．１％、０．０１％、もしくは０．００１％未満である。他の実施形態において、競合核酸（例えば、結合対核酸の間に形成される二本鎖の領域に相補的な核酸）が、遊離の結合メンバーが再会合することを防ぐために使用され得る。同様の効果は、結合対における１つの核酸を、その結合パートナーである核酸にハイブリダイズしない場合に小さなヘアピンを形成するように設計することによって得られ得る。
一旦形成されると、結合対と標的分析物との間の複合体の安定性は、ポリメラーゼ酵素を用い、核酸二本鎖の３’末端を伸長することによって増強され得る（米国特許第５，６３５，６０２号に記載され、この特許は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
本発明の核酸マーカーは、結合対核酸の１つもしくは両方に多くの標識のうちのいずれか１種を組み込むことによって検出され得る。本発明における使用のために適するマーカーの例としては、以下が挙げられる：介入性蛍光分子（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎおよび臭化エチジウム）；ＦＲＥＴ蛍光共鳴エネルギー移動対（例えば、フルオレセインおよびローダミン）；放射性化合物、生物発光化合物、化学発光化合物（例えばアクリジニウムエステル）；化学発光消光対；および配列−配列特異的様式で核酸にハイブリダイズする試薬（例えば、分子ビーコン（Ｋｒａｍｅｒ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、および蛍光発生プライマー（例えば、ＬＵＸＴＭプライマー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））。さらに、蛍光核酸三リン酸（ＮＴＰおよびｄＮＴＰ）が、二本鎖核酸対の３’末端の伸長の間に組み込まれ得る。さらに、ニックトランスレーションおよび他の手段によって、標識を組み込むことが可能である。
（核酸結合対分析物アッセイ）
本発明はまた、結合対を使用して分析物を検出するための方法を提供する。１つの実施形態において、上述のような分析物特異的結合対が、その分析物と接触させられて、複合体を形成する。結合対のメンバーは、２つの核酸の間に形成される、所定のかつ限定的な安定性の分子内二本鎖によって結合する。さらに、結合メンバーは、結合メンバーと分析物との会合ゆえに、近接した位置で固定され、従って、局所的に高い濃度で存在する。この核酸二本鎖は、次いで、解離され得、そして再会合させられる。
当該分野で公知の任意の方法が、二本鎖を解離させるために使用され得る。本発明の１つの実施形態において、解離は、この核酸二本鎖の溶解温度より高くこの複合体を加熱することによって、達成され得る。本発明の別の局面において、塩濃度もしくはイオン強度が、低下させられ得る。本発明のなお別の局面において、この二本鎖を解離させるために、化学的薬剤もしくは生物学的薬剤が、この複合体に添加され得る。
本発明の別の局面において、分析物と複合体化していない結合対メンバーの核酸の再会合は、希釈によって防止され得るか、または除去され得る。別の局面において、希釈もしくは他の反応条件が、過剰な有利の結合メンバーの実質的な再会合をさせない。一般的に、実質的な再会合をさせない条件としては、過剰な遊離の結合メンバーの再会合の、５％未満、代表的には１％未満、多くの場合０．１％未満、そして最も多くの場合０．０１％未満を含む。この実施形態に従い、結合対は、分析物と接触させられ、それによって、結合対と分析物との間の複合体が形成される。次いで、この複合体は希釈され、それによって、近接に結合した核酸マーカーのハイブリダイゼーションは支持されるが、大量の溶液中のハイブリダイゼーションは支持されない。これらの条件下で、マーカー核酸の３’末端の伸長は、複合体化しそしてハイブリダイズしたマーカー核酸において主に起こるか、またはこれらのマーカー核酸においてのみ起こり、一方、未複合体化核酸は、ハイブリダイズせず、従って、３’末端からの伸長は起こらない。
本発明のこの方法に従い、次いで、伸長された二本鎖が、分析物検出のための手段として検出される。本発明の実施形態において、二本鎖を含む核酸は、検出を促進するために増幅される。増幅は、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得る。適切な方法としては、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、およびＴＭＡが挙げられるが、これらに限定されない。
代表的に、核酸増幅方法は、ＤＮＡのプライムされた（ｐｒｉｍｅｄ）酵素的合成に依存する。このような方法に従って、遊離の３’ＯＨを有するプライマーは、一本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡのテンプレートにハイブリダイズされる。次いで、この３’ＯＨは、ポリメラーゼを用いる伸長の開始点を形成し得る。これらのポリメラーゼの例としては、限定されないが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦｉｄｅｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ ＤＮＡ、Ｈｏｔ ＴｕｂＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ。
本発明の１つの局面において、ＰＣＲのためのテンプレートは、その各々の特異性分子を介して分析物に複合体化された２本の鎖の核酸の二本鎖領域を含む核酸分子である。当業者によって理解されるように、ＰＣＲのためのテンプレートは、所望のＰＣＲ産物よりも長くてもよい。２つの独立したＰＣＲプライマーが、核酸テンプレートの１本の鎖における特定の各部位において、内部的にハイブリダイズし得、そしてＤＮＡ合成を開始し得る。残りのＲＮＡ産物は、代表的には、１つのプライマーによって規定される５’末端および他のプライマーによって規定される３’末端を有する。
次いで、この増幅産物は、例えば、臭化エチジウム、銀染色、オートラジオグラフィー、ドットブロッティング、スロットブロッティングもしくはサザンブロッティングによって染色することにより、検出され得る。あるいは、検出は、核酸の１つもしくは両方、増幅産物もしくは複合体の二本鎖領域への検出分子の組み込みによって達成され得る。本発明の方法における使用のために適する検出分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：蛍光分子、蛍光消光分子、化学発光化合物、化学発光消光分子、蛍光ヌクレオチド、酵素標識および放射性標識。
本発明の特定の実施形態において、二本鎖検出は、複合体の二本鎖領域へのアクリジニウムエステルの組み込み、ならびに核酸二本鎖を形成していない第１結合対メンバーおよび第２結合対メンバーにおいて標識を選択的に加水分解することによって促進され得る。
（二本鎖からの３’伸長およびプライマー結合部位の産生）
本発明は、プライマー結合部位の１つもしくは両方が核酸マーカー配列に存在しない、結合対核酸二本鎖の増幅を介した分析物の検出のための方法を提供する。この実施形態に従い、１つ以上のプライマー結合部位が、結合対が分析物に結合した後に生成される。例えば、核酸マーカー配列の１つもしくは両方が、所望のプライマー配列に同一な配列を、二本鎖領域の外側に組み込み得る。言い換えると、増幅のためのプライマー結合部位は、結合対核酸において存在しないが、核酸二本鎖の３’末端が伸長した後にのみ形成される。
この実施形態において、マーカー核酸内に、プライマーに相補的な領域は存在しない（すなわち、プライマー部位は存在しない）。しかし、ハイブリダイゼーション後、マーカーの１つもしくは両方の３’末端は、適切なポリメラーゼを用いて伸長され得る。この伸長は、所望のプライマー配列に同一な配列を包含し、それによって、プライマーに結合するためにその後の増幅工程において使用され得る相補的プライマー結合部位を生成する（図２および図３）。この実施形態の１つの局面において、二本鎖領域が第１核酸マーカーと第２核酸マーカーとの間に形成されそしてその後伸長されない限り、増幅プライマーはハイブリダイズせず、核酸合成／増幅を開始もしない。本発明の別の局面において、検出される分子のみがハイブリダイズするので、バックグラウンド非特異的検出は低下する。
以下のヌクレオチド配列を有する、５’アミノＣ１２スペーサーアーム（スペーサーＣ１２ ＣＥホスホルアミダイト；１２−（４，４’−ジメトキシトリチロキシ）ドデシル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト）を有する６０塩基長のオリゴヌクレオチドが、本発明のこの局面における使用のために適することが見出されている：
（１）５’ＮＨ３−Ｃ１２−ＧＣＴＡＣＧＧＣＴＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＴＧＣＧＣＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＧＧＣＴＣＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＴＧ３’［配列番号１］
（２）５’ＮＨ３−Ｃ１２−ＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＧＡＧＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＧＣＴ３’［配列番号２］
（３）５’ＮＨ３−Ｃ１２−ＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣ
オリゴヌクレオチド（１）［配列番号１］は、オリゴヌクレオチド（２）［配列番号２］およびオリゴヌクレオチド（３）［配列番号３］の両方と、それぞれ３’末端における最後の９塩基および１５塩基について、相補的である。オリゴの間に形成された二本鎖の長さは、特異的なギブスの自由エネルギー（ΔＧ）を有し、これは、最も近い隣接塩基配列によって制御される。例えば、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：３７４６−３７５０（１９８６）を参照。９塩基対重複および１５塩基対重複は、以下の式に従うと、５０ｍＭのＮａＣｌ中で、それぞれ２６℃および４２℃の溶解温度（Ｔｍ’）を有する：
Ｔｍ＝６４．９＋４１＊（ｙＧ＋ｚＣ−１６．４）／（ｗＡ＋ｘＴ＋ｙＧ＋ｚＣ）
式中、ｗ、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ、配列中の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの数である。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌを参照。重複している鎖は、２５℃、５０ｍＭ ＮａＣｌにおいて、５０ｎＭを超える濃度で存在している場合、ハイブリダイズする（＞５０％二本鎖）。鎖は、１００ｐＭ未満の濃度において、平衡で主にモノマーとして存在する（＜５０％ハイブリッド）。熱力学の原則に従うと、これらのような相補的ＤＮＡ鎖は、温度、ＤＮＡ濃度および塩効果の関数として、一本鎖形態と二本鎖形態との間で移行し得る。ハイブリダイズする際、各鎖の３’鎖は、他の鎖に相補的な核酸の合成のための開始点として機能し得る。各鎖は、適切なＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸の存在下で伸長し得、１１１塩基対（図２）もしくは１０５塩基対（図３）のＤＮＡ二本鎖を生じる。新しく形成された二本鎖は、上記の部分的に重複している構造に最初には存在していなかった配列を含む。これらの新しい配列は、以下の下流プライマーの存在下で、ＰＣＲによって指数的に複製され得る：
５’ＧＣＴＡＣＧＧＣＴＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡ３’［配列番号４］、および
５’ＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＴＴＣ３’［配列番号５］
個々の鎖は、第１鎖伸長産物の形成なしには、これらのプライマーの存在下で複製し得ない。
図４は、９塩基対および１５塩基対の重複するオリゴヌクレオチド鎖の両方の、実時間ＰＣＲ増幅（ホットスタート）を示す。この図から、十分な濃度の鎖が存在し、１つの鎖がハイブリダイゼーションおよび第１鎖伸長のために相補鎖に十分に近接している可能性が確実にならない限り、増幅は起こらないことが理解され得る。重複する鎖の濃度の上昇は、テンプレート生成において指数的な増大をもたらす（実時間ＰＣＲ閾値サイクルで測定される）。逆に言えば、例えば支持体を洗浄することによってこの濃度を希釈することは、シグナルを指数的に減少させる。正常な６０マーのテンプレートの増幅が、比較として示される。
（結合対−分析物複合体の近接効果）
重複するオリゴヌクレオチド標識を使用するサンドイッチイムノアッセイは、ＮＡＤＩＡa（核酸検出イムノアッセイ）と呼ばれている。同種形式ＮＡＤＩＡと異種形式のＮＡ
ＤＩＡとの両方を、実施している。同種ＮＡＤＩＡの概略図を、図５に示す。
重複するオリゴヌクレオチドで標識された抗体結合メンバーはまた、図４で示されるＰＣＲ増幅効果を示す。ＤＮＡ−Ａｂ結合体の同じ抗原または抗原被膜表面への結合は、重複するオリゴヌクレオチド鎖を互いに近接して固定する。このことは、両鎖の相対濃度をおよびテンプレート形成の可能性を増大する。テンプレートは、一旦形成されると、濃度と実時間ＰＣＲ閾値シグナルとの間で直線の関係を示す。
この近接効果は、捕捉支持体が使用される場合に（すなわち、異種アッセイにおいて）、テンプレートＤＮＡ−ＡＢ結合体の非特異的結合から生じるバックグラウンドシグナルの非常な低下に関係を有する。個々の重複するオリゴヌクレオチド配列は、増幅のためのテンプレート分子ではなく、そして上述したＤＮＡ−Ａｂ結合体と異なり、選択されたプライマーセットによってそれ自体が増幅し得ない。重複する結合体は非特異的になお結合しているが、この結合は、ランダムである。比較的少コピー数の結合体のランダムな非特異的結合は、近接な相互作用および第１鎖伸長の機会を大いに減少させる。
近接効果はまた、本発明の同種サンドイッチアッセイ形式の基礎にもなり得る。この同種サンドイッチアッセイ形式において、捕捉固体支持体は、不必要である。本発明の方法に従って、近接して結合した重複する結合体のハイブリダイゼーションおよび第１鎖伸長を支持し、そしてバルク溶液中のハイブリダイゼーションを支持しない条件が、使用されなければならない。溶液中の結合体対の任意の非特異的ハイブリダイゼーションは、シグナルを誘発する（図４に示される）。本発明の１つの実施形態は、従って、受容可能な免疫複合体形成率を維持可能な最低の結合体濃度を使用することを伴う。重複の長さ、塩濃度および温度効果の調整もまた、バルク溶液中の重複配列のランダムなハイブリダイゼーションを最小化するために利用可能である。
（細胞分析の免疫検出）
アフィニティ精製したＥ．ｃｏｌｉ ０１５７に対するポリクローナル抗体が、インタクトな微生物の検出のための異種ＮＡＤＩＡ形式を実施するために、重複するオリゴヌクレオチド鎖に結合体化されている。磁気粒子に結合した抗体（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）が、Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７細胞を水サンプルおよび肉ホモジネートから単離するために使用されている。細胞表面は、検出された数千コピーの特異的抗原を示すことが推測される。計算は、ランダムに分布する部位の間の距離が、重複するオリゴヌクレオチド結合体から抗Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７までに広がる距離の中に含まれることを示す。この場合、近接結合は、１つのタンパク質抗原上の別個のエピトープとは対照的に、個々の抗原の間隔に起因する。
本発明の方法に従い（以下の実施例で記載される）、ポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、配列（１）、（２）および（３）による３つの別個の反応において標識し、そして個々の結合体を維持した。Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７：Ｈ７を、ＡＴＣＣ（７００７２８）から得、そして３７℃で増殖した。液体培養物からの細胞を、新鮮な培地中に希釈し、そして１０ｎＭの重複するオリゴヌクレオチド−Ａｂ結合体と共に１時間室温でインキュベートした。得られた細胞−抗体複合体から、遠心分離によって過剰な未結合結合体を洗い落とし、そして冷ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水中に再懸濁し、重複する抗体試薬を、１．０ｐＭ未満まで効果的に希釈した。洗浄した細胞を、同時にプレート上に画線し、そしてＰＣＲ試薬混合物中で１０分間３３℃でインキュベーションした後に下流プライマーの存在下での４０サイクルの実時間ＰＣＲを行うことによって、アッセイした。３０℃で一晩のコロニー形成によって決定された１０〜５０個の細胞の存在は、培養なしでの２〜３時間のアッセイにおいて、バックグラウンドよりも高いシグナルを誘発するために十分であった。
（細胞分析のための同種アッセイ）
本発明は、インタクトな細胞もしくはウイルスを、細胞表面上で結合対試薬と複合体を形成させることによって検出するための方法を提供する。インタクトな細胞（例えば、細菌細胞）を検出するために使用される結合対試薬は、２つ以上のＭＡｂについての２つの結合部位を有するタンパク物分析物を検出するための方法と類似する。この場合、結合部位は、細胞表面上に埋め込まれた同じタンパク質を含み得る。結合対試薬は、個々のタンパク質単位の間の距離に広がる。
本発明に従って検出され得る細胞としては、細菌細胞、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞および真菌細胞が挙げられる。１つの実施形態において、動物細胞は、ヒト細胞であり、この細胞は、疾患を有しても、健康であってもよい。例えば、この方法は、細胞表面腫瘍抗原に対する抗体を含む結合対を使用することによって、循環する癌細胞を検出するために使用され得る。
（重複ＤＮＡマーカーの３’−５’結合体を有する結合対を使用する分析物検出）
アッセイ感度の非常な増大が、５’末端において第１特異性分子（例えば、サンドイッチ対の第１ ＭＡｂ）に結合体化した重複する対の第１の核酸を含む１つの結合対メンバー、および他の末端において第２特異性分子（例えば、第２ ＭＡｂ）に３’末端を介して結合体化した重複する対の第２の核酸鎖を含む結合対メンバー（３’結合体）を含む、結合対試薬の使用によって達成され得る（図６に示す）。この方法に従い、５’結合体の３’末端は、３’結合体の内部配列にハイブリダイズし、結合対を産生する。ここで、３’末端の伸長が、形成した複合体の塊の中央から、自由に回転する末端（３’複合体の５’末端）へと導かれる。この方向付けは、３’−３’重複結合対と比較して、鎖伸長の効率を改善し、それによって、より多くのポリメラーゼの立体接触を可能にし、そして最初の重合体化の間のねじれ応力の散逸を可能にする。
（酵素的消化を使用する同種アッセイ）
分析物の同種検出についての改善された感度は、５’末端にデオキシリボース塩基を有し３’末端にリボース塩基を有する一本鎖核酸と結合体化した特異性分子を含む結合メンバー（例えば抗体）を用いることによって達成され得る。この方法に従い、ＤＮＡ／ＲＮＡ標識は、ＲＮＡ配列の完全なストレッチおよびＤＮＡ配列の短いストレッチに対して相補的である。特定の実施形態において、ＲＮＡ配列は、少なくとも約２０塩基長である。他の実施形態において、このＲＮＡ配列は、少なくとも約３０塩基長、４０塩基長、５０塩基長もしくは６０塩基長である。本発明の１つの局面に従い、このＲＮＡ配列は、２６塩基長である。ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖領域は短く、代表的には、１５未満塩基対未満の長さを含み、多くの場合、約１２塩基対未満の長さを含み、好ましくは、約１０塩基対未満の長さを含む。本発明の種々の局面において、このＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖は、１２塩基対の長さ、１１塩基対の長さ、１０塩基対の長さ、９塩基対の長さ、８塩基対の長さもしくは７塩基対の長さである。
本発明の方法に従い、分析物結合対複合体の核酸二本鎖領域、特にＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖領域は、より高い温度において安定であり、それによって、特定の方向および結合対複合体における互いからの距離に固定される結合メンバーを含む複合体の形成を確実にする。複合体形成の後、複合体化した結合対と過剰な結合対との両方のＲＮＡ成分は、ＲＮａｓｅの添加によって消化され得、短い、残りのＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖によって結合する比較的不安定な結合対を生じる。１つの実施形態において、ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ｈである。ＲＮａｓｅ処理の後、不安定な結合対は、温度が上昇する際にその対応する結合メンバーに解離する。複合体上の位置に固定される結合メンバーのみが、温度の低下の際に迅速に再会合する。分析物によって非常に近接して維持されない解離した結合メンバーは、低い濃度および短いＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の限られた安定性に起因して、結合対に再形成し得ない。本発明の１つの局面において、短縮された３’ＤＮＡ重複の核酸成分を有する結合メンバーは、複合体形成反応物の希釈の必要性を減少させ、それによって、さらに感度を改善する。
デオキシリボースヌクレオチドモノマーおよびリボースヌクレオチドモノマーの両方を含み、そして５’アミノ官能基を有する核酸鎖は、標準的ホスホルアミダイト化学によって合成され得る。あるいは、短い３’ＤＮＡ／ＤＮＡ重複は、ＲＮＡポリメラーゼによって酵素的に埋め合わされ得る。
（分析物についての感度の高い同種アッセイ）
上述の特徴を合わせることによって、タンパク質抗原および微生物のような分析物についての、核酸検出について達成される感度に近づく同種アッセイが、発明されている。本発明に従い、第１特異性分子（例えば、サンドイッチ対の第１ ＭＡｂもしくはポリクローナル抗体の第１部分）は、キメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端に結合体化される。この方法の１つの実施形態において、このＤＮＡ／ＲＮＡオリゴのＲＮＡ部分は、３’末端における３０塩基対を含む。代表的には、独特のプライマー部位が、このＤＮＡ／ＲＮＡオリゴの５’ＤＮＡ末端に配置される。第２の特異性分子（例えば、第２のＭＡｂもしくはポリクローナル抗体の第２部分）は、必要に応じて１つ以上の３’ホスホルアミダイトスペーサーと共に合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に結合体化して、全体の長さを延長する。この方法の１つの局面において、このＤＮＡオリゴは、少なくとも６０塩基長である。代表的には、独特のプライマー結合部位が、ＤＮＡオリゴの５’末端に配置される。この方法に従い、オリゴヌクレオチドは、比較的長い（代表的には２０〜４０塩基対の）ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの二本鎖を形成し、その後に、約７〜１５塩基対のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの短いストレッチが続く（図７）。
分析物複合体形成、ＲＮＡ消化、溶解および再アニーリングの後、上記実施形態の結合対は、曝露された３’ＤＮＡ末端からの１つの方向のみに、ポリメラーゼによって伸長され得る（図７）。３’重複によって課せられた立体的制約およびねじれの制約は、上述のように除去される。結合対の酵素的消化は、短いＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖を生じ、これは、比較的不安定であり、それによって、バルクの溶液中の遊離の結合メンバーからの結合対の再形成を最小化する。
特定の問題もしくは状況に対する本発明の教示の適用は、本明細書中に包含される教示を踏まえて当業者の能力の範囲内である。本発明は、以下の非限定の実施例を参照することによって、さらに説明される。以下の実施例（実験および達成された結果を含む）は、例示目的でのみ提供され、本発明を限定すると解釈されるべきではない。
（実施例１：５’アミノＤＮＡテンプレートの活性化）
２つの６０塩基の一本鎖ＤＮＡ配列［配列番号１および３］を、１２個の炭素のスペーサーアームを介して５’末端に結合した１つの第１アミンを含むように合成した（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）。この配列は、３’末端上の最後の１５塩基について互いに相補的であった。両方を、同じように処理した。この５’アミノ−ＤＮＡ（３５０μｇ）を、２５μｌの０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解した。ジスクシンイミジルスベラートを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で乾ＤＭＳＯ中に溶解し、そして５０μｌアリコートをＤＮＡ溶液に直ちに添加し、そして穏やかに再度ピペッティングすることによって混合した。室温での１分間後、この反応混合物を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステム中に下げた０．５×２０ｃｍ Ｇ−２５（微細）カラム上に注入した。このカラムを、５ｍＭクエン酸（０．１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ５．４に調整した）中で平衡化させ、そして室温で０．５ｍｌ／分の流速で展開した。第１の溶出ピークを、氷中に埋めたＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−１０遠心限外濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）ユニット中に直接収集した。スベラート活性化テンプレートＤＮＡを、４℃で濃縮し、そして５０００×ｇで３０分間、２００〜３００μｌまで濃縮した。２６０ｎｍにおける吸光度によって、ＤＮＡ濃度を迅速に評価した。１．０ Ａ２６０単位（約３０μｌ）を含有するアリコートを、５μｌの１０％マンにトールを含有する微小遠心分離管中に分配し、そしてドライアイス／アセトン浴中で直ちに凍結した。凍結したアリコートを、乾燥するまで凍結乾燥し、乾アルゴン下で封入し、そして−２０℃で保存した。
凍結乾燥化活性化ＤＮＡの活性を、アミン含有低分子への結合体化によって評価した。０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中５０ｍｇ／ｍｌのグルタチオンを、化学量論量のＮ−エチルマレイミド（ＭＥＭ）で反応させた。このｐＨを、水酸化ナトリウムによって８．０まで再度調整した。１Ａ２６０単位のスベラート活性化ＤＮＡを、１０μｌのＮＥＭ処理グルタチオン中に溶解し、次いで、水で２５倍希釈して、４．０Ａ２６０単位／ｍｌにした。アルキル化グルタチオンとの結合体化は、１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル上で電気泳動した場合に５’アミノＤＮＡと比較してよりゆっくりと移動するバンドを生じた。上述の条件下で精製しそして凍結乾燥したスベラート活性化ＤＮＡは、代表的に、ＮＥＭ処理したグルタチオンへのほぼ１００％の結合体化を示し、このことは、完全なスベラート活性化およびアミン反応性の維持を示す。
（実施例２：サンドイッチ対形成した抗ＰＳＡ ＭＡｂの、スベラート活性化ＤＮＡに対する結合体化）
サンドイッチ対形成した抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ｃＭＡｂおよびｒＭＡｂ）の標識を、以前に報告されているように行った。米国特許出願第１０／７０１，３４７号を参照。特定の実施形態において、ｃＭＡｂを、一本鎖配列番号１を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドで標識し、そしてｒＭＡｂを、米国特許出願第１０／７０１，３４７号（この内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される方法を使用して、結合体化した。
本発明の実験のために、ＰＳＡ上の異なるエピトープに対して指向されるサンドイッチ対形成したＭＡｂをＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）から得、そして各々を、活性化重複ＤＮＡ配列の１つと結合体化させた。１００μｌのＭＡｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を、緩衝液交換し、そして室温での１０，０００×ｇの微小遠心分離においてＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）５０遠心限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）を２回通すことによって、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．２５に濃縮した。２５〜５０μｌの最終容量を、微小遠心分離管への遠心分離によって収集し、そして活性化ＤＮＡの凍結乾燥したペレット（上記の実施例１に記載するように調製した）に添加した。この結合体化反応を、室温で数時間進行させた。
ＤＮＡによる抗体標識の程度を、ＳＤＳおよび／または天然のタンパク質ゲル電気泳動によって評価した。ＤＮＡの１本以上の鎖の抗体構造物への取り込みは、分子量および電気陰性度の両方を増大させる。ＤＮＡで標識した抗体は、４％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で電気泳動した場合、ＤＮＡ取り込みの程度に対応して、はっきりした、よりゆっくりと移動するバンドとして現れた。同じ結合体化分子は、４〜１２％天然タンパク質ゲル電気泳動において、対応する非誘導体化抗体よりも早く移動した。より高い桁の結合体について、分離は、天然ゲル上でより劇的であったが、よりはっきりしなかった。
ＤＮＡ結合体化の程度を、相対反応性および各抗体構造中のリジンアミン基の暴露に基づいて５０〜１００％で評価した。この結合体は、２．５の平均標識密度を有することを見出した。いくつかの実験において、抗体−ＤＮＡ結合体を含有する反応混合物を、第２の活性化ＤＮＡの凍結乾燥したペレットに添加し、ＤＮＡによる抗体標識の程度を増大した。
未反応ＤＮＡを、この結合体から、ＴＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭＳ−２００カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を０．４ｍＬ／分の流速で用い、ＦＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーによって除去した。第１溶出ピークは、結合体化ＭＡｂと未結合体化ＭＡｂとから構成される。純粋な結合体を、ＭｏｎｏＱＴＭカラムを用いる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＦＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中で平衡化し、そしてＮａＣｌ塩勾配（０．０〜１．０Ｍ）により０．５ｍｌ／分の流速で溶出した）によって得た。ＭＡｂ−ＤＮＡ結合体を、６０〜７０％塩で溶出した。
このＭＡｂ−ＤＮＡ結合体を、遠心限外濾過によって個々に濃縮し、そしてタンパク質について、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてアッセイした。等容量の両結合体を合わせて、結合対を形成し、これは、ハイブリダイズして、１つの分子を形成した。アジ化ナトリウムを、０．１％の最終濃度まで添加し、そして結合対試薬を、４℃で保存した。
（実施例３：前立腺特異的抗原についての同種アッセイ）
実施例２の結合対を、２０ｐＭまで希釈し、そして等容量の抗原の希釈系列（０〜１ｎｇ／ｍｌのＰＳＡを含む）と合わせた。抗原結合対混合物を、２時間３７℃でインキュベートした。このインキュベーションは、ＰＳＡ抗原上の別個のエピトープに結合した結合対の各メンバーの抗体領域を有する、１つの抗原分子および１つの結合対分子を含む結合複合体の形成を可能にした。全ての塩を、故意に省き、反応溶液中の重複オリゴヌクレオチド標識のハイブリダイゼーションを減少させた。インキュベーションの後、インキュベーション混合物のアリコートを除去し、１０ｍＭＴｒｉｓ、０．１％ＢＳＡ（ｐＨ８．０）中に１：１００で希釈して、１ｐＭ未満まで結合体濃度を低下させ、そして４５℃で３分間加熱した。この加熱工程は、溶液中の遊離の未複合体化結合メンバーと抗原複合体化結合対との両方の重複二本鎖領域を解離させることによって、結合対のメンバーを、互いに効果的に分離させた。４００μＭの各プライマー（配列番号４および５）を含有する等容量の２×ＰＣＲ混合物（２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；１００ｍＭ ＫＣｌ；７ｍＭ ＭｇＣｌ２；４００μＭ各ｄＮＴＰ；５０Ｕ／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を、添加した。温度を２３℃まで下げて分析物−結合対複合体と結合しているＤＮＡ鎖を優先的に再アニーリングさせ、そして第１鎖伸長を開始し、そして反応混合物を、室温で３分間インキュベートした。これらの条件下で、複合体化結合対メンバーの相補的ＤＮＡ領域は、その非常な近接および方向に起因して、迅速に再アニーリングして、結合対試薬の重複ハイブリッドを再形成する。従って、複合体化結合対のＤＮＡ領域を、Ｔａｑポリメラーゼによって伸長し得、それによって、ＰＣＲのためのテンプレートを形成し得る。しかし、未複合体化の遊離の結合対メンバーは、非常に希釈されているので、増幅反応の前もしくは間に有意な程度まで再アニーリングしない。この反応溶液（５０μｌ）を、マイクロタイタープレートのウェルに移し、封入し、そして実時間ＰＣＲサーモサイクリングに供した。この温度は、５０℃から８５℃まで３分間にわたって傾斜し、次いで、９５℃で２分間維持された。次いで、４５サイクルの、９５℃を１５秒間および６２℃を１分間を、実施した。代表的な実験の結果を、図８に示す。この図に示されるように、１００ｆｇ／ｍｌ ＰＳＡを含有するサンプルは、バックグラウンドを上回って（すなわち、ＰＳＡを含まないコントロールサンプルと比較した場合に）検出可能であった。
（実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７についての同種アッセイ）
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得、そして液体培養で増殖させた。細胞濃度を、一晩３７℃で増殖させた寒天培地上のコロニーの出現によって決定した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７に対するポリクローナル抗体を、ＫＰＬ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得、そして実施例１および２に記載の手順に従って、相補的な重複している配列を有する核酸マーカーオリゴに結合体化させた。同じポリクローナル抗体調整物のアリコートを、２つの重複オリゴヌクレオチドのうちの１つで各々個々に標識し、精製しそして結合化学量論的に結合対試薬を産生した。
細菌細胞を、中性緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中に浮遊させて、活性な増殖を停止させ、そして等容量の２０〜２００ｐＭの結合対試薬で２時間室温で処理した。結合対の１つの抗体メンバーの、細胞表面タンパク質に対する結合は、第２メンバーの結合を増強し、細胞上の２つの隣接する結合部位を結合する分子架橋を形成する。次いで、細胞浮遊液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に１：１００で希釈し、そして４５〜５０℃まで加熱して、過剰な結合対試薬を個々の結合対メンバーに解離させた。等容量の４００μＭプライマー含有２×ＰＣＲ混合物を添加し、そしてこの混合物を、室温で３分間インキュベートした。この反応物（５０μｌ）を、マイクロタイタープレートのウェルに移し、封入し、そして上記の実施例３に記載の条件下での実時間ＰＣＲに供した。また、ＰＣＲの前に、サンプルを、固体培地上にプレート培養することによる細菌細胞数の決定のために、取り出した。４５回の増殖サイクルの後、下限１０〜５０個のインタクトな細胞を、この方法を用いて検出した。
（実施例５：結合体化ＤＮＡ標識の３’−３’重複および３’−５’重複を用いるＰＳＡトロポニンＴについての同種アッセイ）
アッセイ感度の増強は、１つの結合対メンバーを含む結合対試薬の使用によって得られ得る。この結合対メンバーは、実施例１に記載のように５’末端においてサンドイッチ対の１つのＭＡｂに結合体化した重複する対の１つのＤＮＡ鎖と３’末端を介して他のＭＡｂに結合体化した第２ＤＮＡ鎖とからなる。５’結合体の３’末端は、３’結合体の内部配列にハイブリダイズして結合対を生成し、結合対を産生する。ここで、遊離の３’末端の伸長が、形成した複合体の塊の中央から、自由に回転する末端に向かって起こる。この方向付けは、より多くのポリメラーゼの立体接触を可能にし、そして最初の重合体化の間のねじれ応力の散逸を可能にすることによって、上記の３’−３’重複結合対よりも鎖伸長の効率を改善し得る。
この実施例の結合メンバーを、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから得たモノクローナル抗体サンドイッチ対を用いて、実施例１および２に記載のように形成しそして精製する。５’ＤＮＡ標識［配列番号６および７］は、９塩基について相補的な３’末端を有する６０塩基から構成されていた。さらに、配列番号６は、７５塩基の３’ＤＮＡ標識［配列番号８］の内部の９塩基配列と相補的であった。また、３’ＤＮＡ標識を、１つもしくはいくつかのスペーサーホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を３’末端上に含み、内部化されたハイブリダイゼーションによって作製した結合対の長さの欠損を埋め合わせるように合成し得る。配列番号６は、消化したモノクローナル抗体ＭＡＫ＜ＴＮＴ＞Ｍ−７に自由に結合体化した。配列番号７および８は、消化したモノクローナル抗体ＭＡＫ＜ＴＮ−Ｔ＞Ｍ−１１−７に結合体化した。結合体化化学および精製は、同じままであった。
この安定した内部重複ハイブリッドセグメントを含む結合対を、希釈し、トロポニン−Ｔと反応させ、そして実施例３について記載したように下流プライマー（配列番号９および１０）の存在下で増幅させる。遊離の結合対および複合体化した結合対は、同じ配列の３’−３’重複結合対と類似の溶解特性および再会合特性を有する。３’−５−重複の最初の重合体化の外側への方向付けは、サンドイッチ複合体の塊が、Ｔａｑポリメラーゼの進行を妨げる場合に、テンプレート配列の生成の効率を改善する。より多数の最初のテンプレート分子の増幅は、実時間ＰＣＲにおけるより早いシグナル閾値およびよりアッセイ感度を可能にする。３’−３’重複結合対試薬を用いるトロポニン−Ｔについての同種アッセイは、ＰＳＡの検出感度（実施例３）と同様の検出感度を示した。３’−５’重複方向付けを用いたトロポニン−Ｔについての対応する同種アッセイは、２〜４倍の改善をもたらした。
（実施例６．３’−３’ビオチン標識化重複ＤＮＡおよび３’−５’ビオチン標識化重複ＤＮＡを用いるストレプトアビジンについての同種アッセイ）
同種イムノ−ＰＣＲ形式において達成し得る非常に高い感度の例は、ストレプトアビジンの検出によって実証され得る。ストレプトアビジンは、このモデル系において「抗原」として働き、約６０オングストロームの分子直径を有する。配列番号６、７および８の末端アミノ官能基を、スルホスクシンイミジル２−（ビオチンアミド）エチル−１、３’ジチオプロピオナート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で標識し、ＦＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。各ＤＮＡ標識は、完全に伸ばした場合、２００オングストロームの長さを超え、そして重複ハイブリダイゼーションを達成するために必要な距離を広がる能力を保証する。
ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０および０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に溶解し、そして１０〜１００ｐＭの最終濃度で存在するビオチンで標識化した３’−３’重複ＤＮＡ３’−５’重複ＤＮＡの両方と複合体を形成させた。この複合体を、２×ＰＣＲ混合物の添加によって１５分間処理し、そして下流プライマー（配列番号９および１０）の存在下での実時間ＰＣＲに供することによって検出した。ストレプトアビジンは、３’−５’重複構成においてアッセイされる場合約５００個の分子の投入（５０アットグラム）において検出され得、そして３’−３’方向で２０００個の分子で検出され得る。
配列番号６
５’（Ｃ６）ＮＨ２ ＡＴＡＴＡＣＣＣＣＣ ＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡ ＴＡＴＣＡＣＴＣＴＧ ＴＡＴＡＡＡＴＴＴＧ ＴＡＴＧＣＴＡＴＴＣ ＡＣＧＡＴＴＧＧＧＡ ３’
配列番号７
５’（Ｃ６）ＮＨ２ ＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡ ＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣ ＡＣＧＴＡＣＡＣＡＴ ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＣ ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣ ＡＴＣＣＣＡＡＴＣＧ ３’
配列番号８
５’ ＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡ ＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣ ＡＣＧＴＡＣＧＴＣＣ ＣＡＡＴＣＧＡＡＡＧ ＴＡＡＡＣＡＧＴＴＴ ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＴ ＡＧＣＧＣＧＴＣＴＣ ＣＴＣＡＴ ＮＨ２（Ｃ６）３’
配列番号９
５’ ＡＴＡＴＡＣＣＣＣＣ ＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡ ＴＡＴＣ ３’
配列番号１０
５’ ＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡ ＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣ ＡＣＧＴ ３’
（実施例７：重複ＤＮＡ標識の３’−５’結合体を用いる、ＰＳＡについての同種アッセイ）
この方法の結合メンバーは、核酸のうちの１つがその３’末端を介して結合されることを除き、実施例１および２に記載されるように形成され得そして精製され得る。５’ＤＮＡ標識は、３’ＤＮＡ標識の内部配列の１５塩基に相補的な３’末端を有する、６０塩基のオリゴヌクレオチドである。３’ＤＮＡ標識を、３’末端にスペーサーホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を含み、内部化されたハイブリダイゼーションによって作製した結合対の長さの欠損を埋め合わせるように合成し得る。結合体化化学および精製は、上述のように行う。
安定な内部重複ハイブリッドセグメントを含む結合対を、希釈し、ＰＳＡと反応させて、そして実施例３に記載したように増幅させる。遊離の結合対および複合体化結合対は、３’−３’重複結合対と類似の溶解特性および再会合特定を有する（これは、ＤＮＡベー角対形成の熱力学的特性によって検出される）。最初の重合体化の外側への方向付けは、テンプレート配列生成の効率を改善する。より多数の最初のテンプレート分子の増幅は、実時間ＰＣＲにおけるより早いシグナル閾値およびより高いアッセイ感度を可能にする。
（実施例８：酵素的消化を使用するＰＳＡの同種アッセイ）
タンパク質抗原および微生物の同種検出についての感度の改善を、５’末端にデオキシリボース塩基を有し３’末端にリボース塩基を有する一本鎖核酸に結合体化した抗体を含む結合対の使用によって、達成し得る。５’アミノ官能基を含むデオキシリボースモノマーおよびリボースモノマーの両方からなる核酸鎖を、標準的ホスホルアミダイト科学によって合成する。あるいは、短い３’ＤＮＡ／ＤＮＡ重複を、ＲＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に埋め合わせ得る。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方で構成される重複する核酸標識を、最初の２６塩基についてＲＮＡホスホルアミダイトで開始して合成する。残りの５９塩基を、ＤＮＡホスホルアミダイトで合成し、（Ｃ１２）アミノ官能基で終結させる。５’末端からの最初の２５塩基は、独特のプライマー配列を表す。次の２６ＤＮＡ塩基は、重複する鎖の２６ＲＮＡ塩基に相補的である。
次の９ＤＮＡ塩基は、重複する鎖の次の９ＤＮＡ塩基と相補的であり、従って、ＤＮＡ／ＲＮＡ標識は、３’末端において、ＲＮＡ配列のストレッチ全体およびＤＮＡ配列の９塩基について相補的である。結合対は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の比較的長いストレッチ、およびＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の比較的短いストレッチを介して結合する２つの結合メンバーからなる。サンドイッチＭＡｂと結合体化する場合、実施例２および３で記載したように、そして結合化学量論的に、得られる結合対は、６０の内部塩基が対形成した１００塩基のヌクレオチドを含む。
実施例３に記載のようにこの試薬を用いて、ＰＳＡを検出する。結合対は、この対の２つの抗体メンバーによる２つのＰＳＡエピトープの認識によって、分析物と複合体を形成する。抗原結合対複合体の核酸二本鎖領域（特にＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖領域）は、高い温度で安定であり、結合対複合体中で互いに特定の方向および距離に固定される結合対を含む複合体の形成を確実にする。抗原結合対複合体の形成の際、この反応物を、１０倍だけ希釈し、そしてＲＮＡｓｅ Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で室温で３０分間処理して、複合体化結合対および過剰な結合対の両方のＲＮＡ鎖を消化し、短い、残りのＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖によって結合した、比較的不安定な対を残す。得られた結合対を、４５℃まで３分間加熱することによって熱的に解離させ、次いで、室温まで冷ます。残った短いＤＮＡ／ＤＮＡ重複は、一時的のみであるが、免疫複合体に迅速に再会合する。この複合体上の位置に固定された結合メンバーのみが、温度の低下の際に迅速に再会合する。解離した結合メンバーは、その低濃度および短いＤＮＡ／ＤＮＡ重複の限られた安定性に起因して、結合対を再形成し得ない。短い３’重複のＤＮＡ標識を有する結合対を有することは、複合体形成反応の希釈の必要性を低下させ、従って、上記の実施例３のアッセイと比較して、アッセイの感度を改善する。ＰＣＲ混合物およびプライマーを添加し、そして実時間ＰＣＲ増幅を、上記のように実施する。
（実施例９：酵素的消化および３’−５’結合体化を用いる、ＰＳＡについての同種アッセイ）
上記の特徴を合わせることにより、核酸検出について達成された感度に近づく、タンパク質抗原および微生物についての同種アッセイを発明し得る。サンドイッチ対の第１Ｍａｂは、キメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端に結合体化する。ポリクローナル抗体の第１部分を、Ｍａｂの代わりに使用し得ることが、理解される。このＤＮＡ／ＲＮＡオリゴのＲＮＡ部分は、３’末端に３０塩基を含む。独特のプライマー部位は、このＤＮＡ／ＲＮＡオリゴの５’ＤＮＡ末端に位置する。第２ Ｍａｂ（これは、ポリクローナル抗体の第２部分によって置き換えられ得る）を、６４マーのＤＮＡオリゴヌクレオチド（これは、全体の長さを延長するためにいくつかの３’ホスホルアミダイトスペーサーを用いて合成される）の３’末端に結合体化し得る。この６４マーの５’末端からの５’末端２５塩基は、独特のプライマー部位を表す。次の３０塩基は、上記ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴの３０ＲＮＡ塩基に相補的である。最後の９塩基は、ＲＮＡセグメントに隣接するＤＮＡセグメントに相補的である（図７）。
両結合メンバーを合わせることは、３０塩基対ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに隣接する内部の９塩基対ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを有する結合対を産生する（図７に示す）。免疫複合体形成、ＲＮＡ消化、溶解および再アニーリングの後、結合対を、ポリメラーゼにより、曝露された３’ＤＮＡ末端からの１つの方向のみに伸長し得る（図７）。３’重複によって課せられる立体的制約およびねじれの制約を（図５におけるように）除去する。結合対の酵素的消化は、短い９塩基対重複を生じ、これは、比較的不安定であり、この結合対のバルクの溶液中での再形成を最小化する。ＰＣＲ増幅を、上記のように実施する。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載された発明。
JP2012012830A 2004-11-03 2012-01-25 同種の分析物検出 Withdrawn JP2012120534A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62495004P 2004-11-03 2004-11-03
US60/624,950 2004-11-03

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007539365A Division JP5188808B2 (ja) 2004-11-03 2005-11-03 同種の分析物検出

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2012120534A true JP2012120534A (ja) 2012-06-28

Family

ID=37570907

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007539365A Expired - Fee Related JP5188808B2 (ja) 2004-11-03 2005-11-03 同種の分析物検出
JP2012012830A Withdrawn JP2012120534A (ja) 2004-11-03 2012-01-25 同種の分析物検出

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007539365A Expired - Fee Related JP5188808B2 (ja) 2004-11-03 2005-11-03 同種の分析物検出

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8338579B2 (ja)
EP (1) EP1842226B2 (ja)
JP (2) JP5188808B2 (ja)
KR (1) KR20070105967A (ja)
CN (2) CN103146808A (ja)
AT (1) ATE480643T1 (ja)
AU (1) AU2005333156B2 (ja)
CA (1) CA2585781A1 (ja)
DE (1) DE602005023529D1 (ja)
DK (1) DK1842226T3 (ja)
ES (1) ES2352041T5 (ja)
PT (1) PT1842226E (ja)
WO (1) WO2006137932A2 (ja)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1563100T3 (da) * 2002-11-01 2013-08-05 Iris Int Inc Fortrængningssandwich-immuno-PCR
JP5188808B2 (ja) 2004-11-03 2013-04-24 アイリス モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 同種の分析物検出
CA2585675A1 (en) * 2004-11-03 2006-12-28 Iris Molecular Diagnostics, Inc. Microbubbles for affinity separation
CA2711843C (en) 2007-12-20 2018-11-13 Laboratory Corporation Of America Holdings Her-2 diagnostic methods
ES2433745T3 (es) * 2008-02-21 2013-12-12 Iris International, Inc. Procedimiento para la determinación temprana de recidivas tras la terapia para el cáncer de próstata
WO2010011901A1 (en) * 2008-07-24 2010-01-28 Innovative Biosensors, Inc. Detection of rna-dna duplex molecules
SG177252A1 (en) 2008-12-01 2012-03-29 Lab Corp America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
EP2387717B1 (en) * 2009-01-15 2014-12-10 Laboratory Corporation of America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-2 expression
CA2749846C (en) 2009-01-15 2018-08-07 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-3
KR101029343B1 (ko) * 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
JP2012003925A (ja) 2010-06-16 2012-01-05 Sony Corp 表示装置
WO2012085113A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Binding agent
CN103384825B (zh) 2010-12-23 2017-05-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过二价结合剂检测经翻译后修饰的多肽
ES2656969T3 (es) * 2010-12-23 2018-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Detección de un dímero polipeptídico por un agente de unión bivalente
JP5766296B2 (ja) * 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
GB201101621D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Olink Ab Method and product
DE102011082353B4 (de) 2011-09-08 2021-04-01 Siemens Aktiengesellschaft Stator für einen Elektromotor
GB201201547D0 (en) * 2012-01-30 2012-03-14 Olink Ab Method and product
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
US10670740B2 (en) 2012-02-14 2020-06-02 American Science And Engineering, Inc. Spectral discrimination using wavelength-shifting fiber-coupled scintillation detectors
CN104364392B (zh) 2012-02-27 2018-05-25 赛卢拉研究公司 用于分子计数的组合物和试剂盒
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
CN104395340B9 (zh) * 2012-06-27 2018-11-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含至少两个不同靶向实体的定制选择性和多特异性治疗分子的方法及其用途
WO2014025810A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Prostate cancer gene expression profiles
EP2895496B1 (en) 2012-09-14 2017-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the production and selection of molecules comprising at least two different entities and uses thereof
US9809848B2 (en) 2013-03-15 2017-11-07 Fluidigm Corporation Simultaneous detection of target protein and target nucleic acids in a single cell
US9593364B2 (en) * 2013-05-21 2017-03-14 Src, Inc. Detecting a target molecule in a sample using a dual-antibody quantitative fluorescence-based detection method
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
US20150132743A1 (en) * 2013-09-04 2015-05-14 Fluidigm Corporation Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell
AU2014373792A1 (en) 2013-12-30 2016-07-07 Genomatix Genomic rearrangements associated with prostate cancer and methods of using the same
CN103728451B (zh) * 2014-01-23 2015-06-24 湖南大学 一种检测赭曲霉素a的胶体金免疫试剂盒及其制备方法
CN103728452B (zh) * 2014-01-23 2015-06-24 湖南大学 一种检测黄曲霉素b1的胶体金免疫试剂盒及其制备方法
US9909167B2 (en) * 2014-06-23 2018-03-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University On-slide staining by primer extension
NL2013857B1 (en) * 2014-11-21 2016-10-11 Piculet Biosciences Tech B V Self-assembled bivalent ligand complex (SABLC) libraries and methods for screening such libraries.
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US11291931B2 (en) 2014-12-15 2022-04-05 Akadeum Life Sciences, Inc. Method and system for buoyant separation
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
EP3271709B1 (en) 2015-03-20 2022-09-21 Rapiscan Systems, Inc. Hand-held portable backscatter inspection system
JP7508191B2 (ja) 2015-03-30 2024-07-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー コンビナトリアルバーコーディングのための方法および組成物
WO2016168711A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 The Regents Of The University Of California Methods for detecting agglutination and compositions for use in practicing the same
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
RU2018107453A (ru) 2015-08-10 2019-09-12 Эссенликс Корп. Устройства для анализов и способы в биологии/химии, предусматривающие упрощенные стадии, образцы небольшого объема, повышенную скорость и простоту применения
ES2745694T3 (es) 2015-09-11 2020-03-03 Cellular Res Inc Métodos y composiciones para normalización de biblioteca de ácido nucleico
KR101982330B1 (ko) 2015-09-14 2019-05-24 에센릭스 코프. 증기 응축액 특히 입김 응축액을 수집 및 분석하기 위한 장치 및 시스템 그리고 이 장치 및 시스템을 사용하는 방법
CN112462055B (zh) 2015-09-14 2024-06-07 上海宜晟生物科技有限公司 用于分析样品，尤其是血液，的装置和系统以及其使用方法
GB201518655D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Olink Ab Method for generating proximity probes
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
CN106124781B (zh) * 2016-07-07 2018-01-02 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法
CN116064727A (zh) 2016-07-27 2023-05-05 斯坦福大学托管董事会 高度复用荧光成像
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
DE102016221875B4 (de) * 2016-11-08 2018-06-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, Verwendungen hiervon und Verfahren zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch
RU2763296C2 (ru) 2016-12-15 2021-12-28 Сосьете Де Продюи Нестле С.А. Композиции и способы, которые регулируют бактерии у животного-компаньона
EP3558121B1 (en) 2016-12-21 2022-06-08 Essenlix Corporation Devices and methods for authenticating a sample and use of the same
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
WO2018148342A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Essenlix Corporation Compressed open flow assay and use
US12066434B2 (en) 2017-02-08 2024-08-20 Essenlix Corporation QMAX assays and applications
CA3053005A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Essenlix Corporation Sample collection and handling for delayed analysis
CA3053002A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Essenlix Corp. Bio/chemical material extraction and assay
CN111433606B (zh) 2017-02-09 2024-05-24 上海宜晟生物科技有限公司 采用不同间距高度的测定
CN110998325B (zh) 2017-02-09 2024-08-16 上海宜晟生物科技有限公司 扩增测定
US20220042069A1 (en) * 2017-02-09 2022-02-10 Atlas Antibodies Ab Method for determining levels of interactions between biomolecules
EP3662259A4 (en) 2017-02-09 2021-08-25 Essenlix Corporation COLORIMETRIC TESTS
US10966634B2 (en) 2017-02-16 2021-04-06 Essenlix Corporation Assay with textured surface
EP3635135A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Becton, Dickinson and Company Sample indexing for single cells
CN112689758A (zh) 2017-08-01 2021-04-20 Essenlix公司 检查药物对微生物影响的装置和方法
US11280706B2 (en) 2017-08-01 2022-03-22 Essenlix Corporation Dilution calibration
US11243201B2 (en) 2017-08-01 2022-02-08 Essenlix Corporation Sample collection, holding and assaying
WO2019075415A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Essenlix Corporation DEVICES AND METHODS FOR AUTHENTICATING MEDICAL ANALYSIS AND USES THEREOF
US10807095B2 (en) 2017-10-26 2020-10-20 Essenlix Corporation Making and tracking assay card
US11237113B2 (en) 2017-10-26 2022-02-01 Essenlix Corporation Rapid pH measurement
US11609224B2 (en) 2017-10-26 2023-03-21 Essenlix Corporation Devices and methods for white blood cell analyses
US11648551B2 (en) 2017-12-12 2023-05-16 Essenlix Corporation Sample manipulation and assay with rapid temperature change
WO2019118936A2 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Essenlix Corporation Devices, systems, and methods for monitoring hair
WO2019140334A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Essenlix Corporation Homogeneous assay (ii)
US20210270851A1 (en) * 2018-02-22 2021-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker for diagnosing autism spectrum disorder
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CA3097976A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
EP3811117A4 (en) 2018-06-20 2022-03-16 American Science & Engineering, Inc. SCINTILLATION DETECTORS COUPLED TO WAVELENGTH OFFSET SHEET
WO2020014273A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Akadeum Life Sciences, Inc. System and method for buoyant particle processing
US11885952B2 (en) 2018-07-30 2024-01-30 Essenlix Corporation Optics, device, and system for assaying and imaging
JP2022511398A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ５’転写物配列の決定
JP2022506546A (ja) 2018-11-08 2022-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
CN113574178A (zh) 2019-01-23 2021-10-29 贝克顿迪金森公司 与抗体关联的寡核苷酸
KR20210121149A (ko) * 2019-01-25 2021-10-07 소마젠 인크 항체-ｄｎａ 접합체 및 ｈｐｖ의 검출 및 치료
EP3924506A1 (en) 2019-02-14 2021-12-22 Becton Dickinson and Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
WO2021092386A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Becton Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
GB202004469D0 (en) 2020-03-27 2020-05-13 Olink Proteomics Ab Controls for proximity detection assays
CA3172942A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Olink Proteomics Ab Method for detecting analytes of varying abundance
GB202004472D0 (en) 2020-03-27 2020-05-13 Olink Proteomics Ab Method for detecting analytes of varying abundance
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US12043673B2 (en) * 2020-10-15 2024-07-23 City Of Hope Complementary RNA linked bispecific T-cell engaging antibodies
GB202017873D0 (en) 2020-11-12 2020-12-30 Olso Unversitetssykehus Hf Method of determining DLBCL prognosis
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US11340361B1 (en) 2020-11-23 2022-05-24 American Science And Engineering, Inc. Wireless transmission detector panel for an X-ray scanner
GB202018503D0 (en) 2020-11-25 2021-01-06 Olink Proteomics Ab Analyte detection method employing concatamers
CN112730840B (zh) * 2021-01-29 2023-10-17 章毅 鉴别cd44和cd24分子表型的方法
EP4392158A1 (en) 2021-08-26 2024-07-03 Akadeum Life Sciences, Inc. Method and system for buoyant separation
WO2024100258A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Olink Proteomics Ab Library of proximity probes and method of use
EP4382534A1 (en) 2022-12-06 2024-06-12 Biomérieux Synthetic peptide for use in an immunomolecular assay
WO2024173590A1 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Akadeum Life Sciences, Inc. Method and system for partially or fully automated buoyancy-assisted separation

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1582956A (en) * 1976-07-30 1981-01-21 Ici Ltd Composite magnetic particles
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
DE3100535A1 (de) 1981-01-10 1982-08-12 Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach "neue carbonsaeure-derivate, ihre herstellung und ihre verwendung als arzneimittel"
FR2571498B1 (fr) * 1984-10-04 1988-04-08 Immunotech Sa Procede de separation de cellules utilisant des anticorps et des billes de faible densite
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4618525A (en) * 1985-06-03 1986-10-21 Minnesota Mining And Manufacturing Company Coated glass microbubbles and article incorporating them
US4824776A (en) * 1985-07-25 1989-04-25 Molecular Biosystems, Inc. Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4933447A (en) * 1987-09-24 1990-06-12 Ss Pharmaceutical Co., Ltd. Quinoline derivatives
US4957656A (en) 1988-09-14 1990-09-18 Molecular Biosystems, Inc. Continuous sonication method for preparing protein encapsulated microbubbles
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US5427930A (en) 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
SE9002480D0 (sv) * 1990-07-23 1990-07-23 Hans Lilja Assay of free and complexed prostate-specific antigen
EP0488152A3 (en) 1990-11-30 1992-11-25 Hitachi, Ltd. Method for immunoassay and apparatus therefor
WO1992015708A1 (en) * 1991-02-27 1992-09-17 Amoco Corporation Methods for improving the sensitivity of hybridization assays
IE920778A1 (en) 1991-03-12 1992-09-23 Du Pont Method for specific binding assays using a releasable ligand
US5665539A (en) * 1991-07-12 1997-09-09 The Regents Of The University Of California Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
US6723303B1 (en) * 1991-09-17 2004-04-20 Amersham Health, As Ultrasound contrast agents including protein stabilized microspheres of perfluoropropane, perfluorobutane or perfluoropentane
EP1331011A3 (en) 1991-10-24 2003-12-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5270184A (en) * 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
DE4232755A1 (de) 1992-09-26 1994-03-31 Schering Ag Mikropartikelpräparationen aus biologisch abbaubaren Mischpolymeren
EP0688366B1 (en) * 1993-01-15 2002-05-22 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Sensitive nucleic acid sandwich hybridization assays and kits
US5985548A (en) * 1993-02-04 1999-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
DE69432897T2 (de) * 1993-05-10 2004-05-27 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Verfahren zur bestimmung von mehr als einem immunologischen liganden und bestimmungsreagenz sowie satz dafuer
US5635602A (en) † 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
US5681697A (en) * 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5599677A (en) * 1993-12-29 1997-02-04 Abbott Laboratories Immunoassays for prostate specific antigen
US5648213A (en) * 1994-08-30 1997-07-15 Beckman Instruments, Inc. Compositions and methods for use in detection of analytes
JPH08178926A (ja) * 1994-10-25 1996-07-12 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd イムノアッセイプレートおよびその用途
CN1046520C (zh) 1994-11-15 1999-11-17 法玛西雅厄普约翰美国公司 二环噁嗪及噻嗪噁唑烷酮抗菌剂
SE504798C2 (sv) * 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
DE19524133A1 (de) * 1995-07-03 1997-01-09 Bayer Ag Die Verwendung von neuen und bekannten kationischen 4,5-Dihydro-1H-1,2,3-triazoliumverbindungen als Farbstoffe, neue kationische 4,5-Dihydro-1H-1,2,3-triazoliumverbindungen und deren Herstellung
NO301198B1 (no) * 1995-07-14 1997-09-22 Alcatel Kabel Norge As Kabel, fremgangsmåte og impregneringsmasse
US5655539A (en) * 1996-02-26 1997-08-12 Abbott Laboratories Method for conducting an ultrasound procedure using an ultrasound transmissive pad
AT403803B (de) 1996-04-19 1998-05-25 Sanochemia Ltd Neue benzazepinderivate, diese enthaltende arzneimittel und verwendung derselben zum herstellen von arzneimitteln
US6165942A (en) * 1996-10-03 2000-12-26 Nissan Chemical Industries, Ltd. Heterocycle-fused pyrimidinone derivative and herbicidal composition
US6083484A (en) * 1996-10-17 2000-07-04 Molecular Biosystems, Inc. Microparticles stabilized by polynuclear chromium complexes and their use as ultrasound contrast agents
US6245318B1 (en) 1997-05-27 2001-06-12 Mallinckrodt Inc. Selectively binding ultrasound contrast agents
US6086540A (en) * 1997-10-07 2000-07-11 Molecular Biosystems, Inc. Methods of ultrasound imaging using echogenically persistent contrast agents
US6531278B1 (en) * 1998-01-14 2003-03-11 Utah State University Ligand-DNA composition for capture and detection of contaminants on a solid surface
CA2326386A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to separation processes
US8063190B2 (en) * 1998-06-02 2011-11-22 Tom Robin Caine Boyde Nucleic acid-linked conjugates and methods for making and using them
US6214566B1 (en) * 1998-11-16 2001-04-10 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for detecting anti-squalene antibodies
WO2000041524A2 (en) 1999-01-11 2000-07-20 President And Fellows Of Harvard College Isothermal amplification of dna
WO2001027630A2 (en) * 1999-10-13 2001-04-19 The University Of British Columbia Methods to identify compounds that modulate neuronal activity
CA2391534A1 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Drug Innovation & Design, Inc. Selective cellular targeting: multifunctional delivery vehicles
SE516272C2 (sv) * 2000-02-18 2001-12-10 Ulf Landegren Metoder och kit för analytdetektion mha proximitets-probning
US7306904B2 (en) * 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
US6511809B2 (en) * 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
EP1364009A2 (en) 2000-06-15 2003-11-26 Board of Regents, The University of Texas System Regulatable, catalytically active nucleic acids
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US20020132260A1 (en) 2001-02-22 2002-09-19 Erlander Mark G. Quantitative immunohistochemistry (QIHC)
WO2002083951A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Northeastern University Multiplexed ligand/protein binding assays with pna labels
EP1249500A1 (de) 2001-04-12 2002-10-16 chimera biotec GmbH Verfahren zum Nachweis einer Substanz
WO2003011824A1 (en) 2001-07-31 2003-02-13 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
CN1871517A (zh) 2002-02-19 2006-11-29 免疫公司 快速有效分离循环癌细胞的方法和试剂
US20060154246A1 (en) * 2002-03-08 2006-07-13 Dario Neri Encoded self-assembling chemical libraries (esachel)
CA2965865C (en) * 2002-07-18 2021-10-19 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
BR0313405A (pt) * 2002-08-12 2005-07-12 Takeda Pharmaceutical Compostos, métodos para preparar um composto e para prevenir e/ou tratar câncer, prodroga, medicamento, modulador do receptor de androgênio, agente para prevenir e/ou tratar hipogonadismo ou pertubação climatérica masculina, osteoporose e câncer, e, uso de um composto
DK1563100T3 (da) 2002-11-01 2013-08-05 Iris Int Inc Fortrængningssandwich-immuno-PCR
TWI375796B (en) * 2003-04-18 2012-11-01 Becton Dickinson Co Immuno-amplification
US20090176207A1 (en) * 2004-06-23 2009-07-09 Washington University Methods for Determining Risk of Developing Regular Smoking Behavior
CN101084207A (zh) 2004-09-20 2007-12-05 泽农医药公司 杂环衍生物及其作为硬脂酰CoA去饱和酶抑制剂的用途
CA2585675A1 (en) 2004-11-03 2006-12-28 Iris Molecular Diagnostics, Inc. Microbubbles for affinity separation
JP5188808B2 (ja) 2004-11-03 2013-04-24 アイリス モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 同種の分析物検出
JP4692200B2 (ja) 2005-10-06 2011-06-01 横河電機株式会社 化学処理用カートリッジおよびその使用方法
ES2433745T3 (es) 2008-02-21 2013-12-12 Iris International, Inc. Procedimiento para la determinación temprana de recidivas tras la terapia para el cáncer de próstata

Also Published As

Publication number Publication date
ATE480643T1 (de) 2010-09-15
DK1842226T3 (da) 2010-10-18
WO2006137932A9 (en) 2007-02-15
WO2006137932A2 (en) 2006-12-28
DE602005023529D1 (de) 2010-10-21
US20080131883A1 (en) 2008-06-05
AU2005333156A1 (en) 2006-12-28
PT1842226E (pt) 2010-11-29
US20120082988A1 (en) 2012-04-05
CA2585781A1 (en) 2006-12-28
CN101137758A (zh) 2008-03-05
KR20070105967A (ko) 2007-10-31
EP1842226A2 (en) 2007-10-10
EP1842226B1 (en) 2010-09-08
AU2005333156B2 (en) 2011-05-26
CN101137758B (zh) 2012-10-10
EP1842226A4 (en) 2009-08-05
JP2008518605A (ja) 2008-06-05
US9234890B2 (en) 2016-01-12
ES2352041T3 (es) 2011-02-15
ES2352041T5 (es) 2014-12-22
EP1842226B2 (en) 2014-07-02
US8338579B2 (en) 2012-12-25
CN103146808A (zh) 2013-06-12
JP5188808B2 (ja) 2013-04-24
WO2006137932A3 (en) 2007-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5188808B2 (ja) 同種の分析物検出
EP1563100B1 (en) Displacement sandwich immuno-pcr
US5200313A (en) Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
US5665539A (en) Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
EP0163220B1 (en) Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
JPS60262055A (ja) 核酸のハイブリツド形成分析法およびそれに用いる試薬系
JP2008518973A (ja) 親和性分離のための微粒気泡
US20090208932A1 (en) Methods Of Detecting An Analyte In A Sample
EP0146039A2 (en) Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding
AU2011213911A1 (en) Homogeneous analyte detection
JPS60201257A (ja) 特定のポリヌクレオチド配列順序の検出方法
JPH06235727A (ja) バイオ情報変換素子及びそれを用いた生物種検出方法
NO844848L (no) Hybridiseringsanalyse med immobilisering av hybrider ved anti-hybrid binding

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130107

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130712

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20130910