CN106124781B - 一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法 - Google Patents

一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤A：1)将能结合去甲睾酮的核酸适配体1和能结合去甲睾酮的核酸适配体2与待测样品混匀得到反应体系，反应，得到待测样品反应产物；以不加入待测样品为对照，得到对照反应产物；所述核酸适配体1和所述核酸适配体2分别标记荧光基团和淬灭基团；2)检测待测样品反应产物和对照反应产物的荧光强度，根据二者的荧光强度强弱比较，确定待测样品中是否含有19‑去甲睾酮。本发明发现一种基于用核酸适配夹心荧光淬灭检测去甲睾酮的方法，该方法具有快速、简单、灵敏等优点，适用于去甲睾酮的初筛检测。

Description

一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法。
背景技术
19-去甲基睾酮是一种将雄性激素(睾酮或者甲基睾酮)经结构修饰后得到的合成甾体激素，具有刺激体内蛋白质合成的增加，减弱氨基酸的分解代谢，促进骨骼生长等功效。在畜禽养殖过程中，人们通过添加19-去甲基睾酮及其他促蛋白同化激素来增加瘦肉产量，提高饲料转化效率。近年来已有研究表明，富集在体内的19-去甲基睾酮残留及其代谢物质会对人体健康造成危害作用：影响人体肝脏功能，损害心血管系统、生殖系统等，造成内分泌机能障碍，此外还有一定致癌性。因此，从1985年开始，欧盟就禁止使用生长促进类药物饲养畜禽，而我国、日本及欧盟等也均规定动物食用组织中不得有甾体激素残留。2004年欧盟对我国畜禽产品提出了18个种类的兽药残留、抗生素检测监控要求，其中明确指出，动物源性食品药物残留中，19-去甲基睾酮不得检出。
激素残留常用的检测方法为液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等仪器检测方法。这些仪器类方法虽然灵敏度高、定性准确，能够确定目标化合物的分子量、分子式，甚至官能团，适合检测19-去甲基睾酮及其代谢物。但是，这些方法普遍成本较高，需要昂贵的试验仪器、专业的技术人员及耗时费力的前处理工作，无法满足高效、简便、经济的快速检测要求。目前，免疫学检测方法以抗体对抗原的特异性识别为基础，凭借抗原和抗体的亲和力高、检测快速、简便、经济实用等优点，成为最主要的一类19-去甲睾酮快速检测方法，主要包括酶联免疫法(ELISA)和免疫检测试纸，这类检测方法通常需要多步洗脱步骤，并且在只有一个可利用抗体的情况下只能建立竞争法检测模式，此外抗原抗体制备不易、生物稳定性差等都是免疫学快速检测方法需要克服的问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种适配体夹心荧光淬灭法检测待测样品中是否含有19-去甲睾酮的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤A：
1)将能结合去甲睾酮的核酸适配体1和能结合去甲睾酮的核酸适配体2与待测样品混匀得到反应体系，反应，得到待测样品反应产物；以不加入待测样品为对照，得到对照反应产物；
所述核酸适配体1和所述核酸适配体2分别标记荧光基团和淬灭基团；
2)检测待测样品反应产物和对照反应产物的荧光强度，根据二者的荧光强度强弱比较，确定待测样品中是否含有19-去甲睾酮。
上述方法中，所述检测待测样品反应产物和对照反应产物的荧光强度，根据二者的荧光强度强弱比较，确定待测样品中是否含有19-去甲睾为如下A或B：
A、若待测样品反应产物的荧光强度小于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中含有或候选含有19-去甲睾酮；若待测样品反应产物的荧光强度大于等于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中不含有或候选不含有19-去甲睾酮；
B、若待测样品反应产物的荧光强度显著小于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中含有或候选含有19-去甲睾酮；若待测样品反应产物的荧光强度不显著小于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中不含有或候选不含有19-去甲睾酮。
上述方法中，所述核酸适配体1的3’末端标记淬灭基团，且所述核酸适配体2的5’末端标记荧光基团；
或所述核酸适配体1的5’末端标记淬灭基团，且所述核酸适配体2的3’末端标记荧光基团。
上述方法中，所述淬灭基团为BHQ；所述荧光基团为6FAM。
上述方法中，所述核酸适配体P1的核苷酸序列为序列1；
所述核酸适配体P2的核苷酸序列为序列2。
上述方法中，所述反应体系中，所述核酸适配体P1和所述核酸适配体P2的摩尔比为1:1；
所述反应的条件为避光反应20min；
所述检测的条件为Ex为480nm，Em为520nm。
本发明另一个目的是提供一种适配体夹心荧光淬灭法检测待测样品中19-去甲睾酮含量的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)上述方法中的步骤A，得到待测样品反应产物的荧光强度；
2)重复步骤A，且将步骤A中的待测样品替换为不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液，得到不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液反应产物的荧光强度；以不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液的浓度log作为横坐标，不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液反应产物的荧光强度作为纵坐标制备标准曲线；标准曲线如图2所示。
3)将所述待测样品反应产物的荧光强度代入所述标准曲线中，得到待测样品中中19-去甲睾酮含量。
上述方法中的核酸适配体P1和核酸适配体P2在检测19-去甲睾酮中的应用也是本发明保护的范围。
上述方法中的核酸适配体P1和核酸适配体P2在检测待测样品中是否含有19-去甲睾酮中的应用也是本发明保护的范围。
上述方法中的核酸适配体P1和核酸适配体P2在定量检测待测样品19-去甲睾酮含量中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明发现一种基于用核酸适配夹心荧光淬灭检测去甲睾酮的方法，该方法具有快速、简单、灵敏等优点，适用于去甲睾酮的初筛检测。
附图说明
图1为基于片段化适配体的荧光法检测19-去甲基睾酮原理示意图。
图2为荧光法检测19-去甲基睾酮标准曲线。
图3为特异性试验结果。**差异极显著(P＜0.01)
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中部分材料和试剂如下：
19-去甲睾酮(19-Nortestosterone)、雌二醇(17β-Estradiol)、雌三醇(Estriol)、雌酮(Estrone)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol)、双酚A(Bisphenol)标准品购自Dr.Ehrenstorfer GmbH,Ehrenstorfer Quality(Germany)。
TRIS购自北京东胜泰博有限公司，无水MgCl2购自天津市光复精细化工研究所，NaCl、KCl购自国药集团化学试剂有限公司，甲醇购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，乙醇、盐酸购自北京化工厂。超纯水由实验室纯水机自制。
尿液样品来自3名健康女性且知情。
96孔黑色酶标板(美国Corning公司)；
0.22μm滤膜(美国Millipore公司)；
10mm比色皿(北京雁栖湾生物有限公司)；
移液器(德国Eppendorf公司)；
涡旋仪(MS 3basic，德国IKA公司)；
超高速离心机(MiniSpi，德国Eppendorf公司)；
多功能酶标仪(Infinite F200，奥地利Tecan Austria GmbH)；
Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；
电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。
实施例1、适配体夹心荧光淬灭法检测去甲睾酮的方法
一、检测原理
适配体夹心荧光淬灭法为将能够和去甲睾酮同时结合的核酸适配体P1、P2(序列如下)分别标记荧光淬灭基团BHQ与荧光基团6FAM，利用荧光淬灭原理检测19-去甲基睾酮，检测原理如图1所示：没有靶标19-去甲基睾酮存在时，检测体系中P1适配体3’端的荧光淬灭基团BHQ和P2适配体5’端的荧光基团6FAM之间空间距离较大，整个体系可检测到很强的荧光信号；加入19-去甲基睾酮后，P1和P2因都与靶标具有较好的亲和力而结合在靶标分子上，从而大大缩短了P1、P2上分别标记的淬灭基团BHQ和荧光基团6FAM之间的空间距离，荧光发生淬灭，体系可检测到的荧光信号减弱，且荧光强度减弱的程度与靶标19-去甲基睾酮的浓度呈正相关。P2所标记的6FAM荧光基团正常情况在480nm的激发波长下，在520nm发射波长会有显著的荧光信号，这样，通过测定体系520nm发射波长处的荧光强度的变化，即可实现对19-去甲基睾酮的定量、快速检测。
二、核酸适配体的设计
设计合成能同时结合去甲睾酮的核酸适配体P1、P2：
核酸适配体P1：5’-GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA-3’-BHQ(序列1，3’末端连接淬灭基团BHQ)；
核酸适配体P2：5’-6FAM-GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCGCGG AAG C-3’(序列2，5’末端连接荧光基团6FAM)；
均由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.)合成。
三、适配体夹心荧光淬灭法检测去甲睾酮的方法
1、待检样品及核酸适配体溶液配置
用不同浓度的19-去甲基睾酮标准品溶液作为待检样品，具体配置如下：
不同浓度19-去甲基睾酮标准品溶液为将甲醇溶解的19-去甲基睾酮标准品用1×binding buffer(100mM Tris HCl:含200mM NaCl,25mM KCl,10mM MgCl2,体积百分含量5％乙醇，pH 8.0，其余为水)分别稀释为5nM 19-去甲基睾酮标准品溶液、10nM19-去甲基睾酮标准品溶液、50nM 19-去甲基睾酮标准品溶液、100nM 19-去甲基睾酮标准品溶液、500nM19-去甲基睾酮标准品溶液和1000nM 19-去甲基睾酮标准品溶液。
0.5μM核酸适配体P1溶液为将核酸适配体P1用100mM Tris-HCl binding buffer溶解得到的溶液，且P1在溶液中的浓度为0.5μM。
0.5μM核酸适配体P2溶液为将核酸适配体P2用100mM Tris-HCl binding buffer溶解得到的溶液，且P2在溶液中的浓度为0.5μM。
100mM Tris-HCl binding buffer配方：含200mM NaCl，25mM KCl，10mM MgCl2，体积百分含量5％乙醇，pH8.0，其余为水；
2、检测方法
在酶标板每孔中加入上述1的0.5μM核酸适配体P1溶液和0.5μM核酸适配体P2溶液各50μL，再向每孔中分别加入100μL不同浓度19-去甲基睾酮标准品溶液，得到反应体系，将反应体系避光反应20min后，再放入酶标仪中测定荧光(Ex＝480nm，Em＝520nm)。以不加入19-去甲基睾酮标准品溶液的反应体系为阴性对照。
以不同浓度19-去甲基睾酮标准品溶液的浓度(nM)Log值为横坐标，不同浓度19-去甲基睾酮标准品溶液的荧光强度为纵坐标，制得标准曲线见图2。
加入100μL不同浓度19-去甲基睾酮标准品溶液的反应体系的荧光强度分别为：36569、35442、31556、29621、25536、22506。
结果表明：随着19-去甲基睾酮靶标浓度由5nM逐渐增加至1000nM，体系测得的荧光强度与阴性对照比呈现显著的降低趋势，该方法的检测限为5nM。
三、适配体夹心荧光淬灭法检测去甲睾酮的特异性检测
为了验证该方法的特异性，选择了一些甾类化合物和雌激素类化合物进行特异性试验，包括雌三醇(Estriol)、雌酮(Estrone)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol)、双酚A(Bisphenol)。
将如下物质：17β-雌二醇、双酚A、己烯雌酚、雌三醇、雌酮和19-去甲基睾酮均用1×binding buffer(100mM Tris HCl:含200mM NaCl,25mM KCl,10mM MgCl2,5％乙醇，pH8.0)溶解得到各物质溶液，且使各物质在其对应的溶液中的浓度为200nM。检测方法同上述二的2，以不加入各物质溶液的反应体系为阴性对照。
结果如图3所示，可以看出，与阴性对照相比，只有19-去甲基睾酮使体系荧光强度有明显下降，说明该方法检测19-去甲基睾酮具有良好的特异性。
实施例3、适配体夹心荧光淬灭法检测待测样品中去甲睾酮
在经过受试者同意且知情的情况下，采集三名女性工作人员的尿液(不含有去甲睾酮)，记作尿液1、尿液2和尿液3。
1、待测样品制备
将尿液1、尿液2和尿液3分别经0.22μm滤膜过滤处理并用1×binding buffer(100mM Tris HCl:含200mM NaCl,25mM KCl,10mM MgCl2,5％乙醇，pH 8.0)稀释2倍后，得到稀释后尿液1、稀释后尿液2和稀释后尿液3。处理后的尿液对P1及P1+P2体系荧光基本无影响。
将不同量的19-去甲基睾酮标准品分别加入稀释后尿液1、稀释后尿液2和稀释后尿液3，得到样本，使19-去甲基睾酮标准品在样本中的浓度分别为5nM、10nM和500nM，得到含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本、含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本、含有500nM19-去甲基睾酮的尿液1样本、含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本、含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本、含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本、、含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本、含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本、含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本。
将9个上述样本采用实施例1的二的2方法进行检测。
结果如下：
含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本的荧光强度为36695；
含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本的荧光强度为35243；
含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本的荧光强度为26212；
含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本的荧光强度为36211；
含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本的荧光强度为34821；
含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本的荧光强度为26283；
含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本的荧光强度为37657；
含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本的荧光强度为35070；
含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本的荧光强度为26324。
将上述各荧光强度代入实施例2的二的标准曲线中，计算9个样本中19-去甲基睾酮的浓度，
结果如下：
含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为5.13nM；
含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为9.72nM；
含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液1样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为521.06nM；
含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为6.35nM；
含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为11.71nM；
含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液2样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为505.17nM；
含有5nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为3.35nM；
含有10nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为10.49nM；
含有500nM 19-去甲基睾酮的尿液3样本中19-去甲基睾酮的检测浓度为495.90nM。
将相同加入浓度的3个样本得到的检测浓度平均值，与实际加入浓度平均值比较，结果如表1所示。
表1尿液实际样品加标回收率测定(n＝3)
经样品基质干扰作用试验验证，对三个加标浓度各重复三次，测定加标回收率如表1所示：19-去甲基睾酮的三个加标浓度测得的平均回收率在98.84％-106.41％，相对标准偏差(RSD)小于1％，说明应用该方法检测实际样品中的19-去甲基睾酮具有不错的稳定性。

Claims (5)

1.一种适配体夹心荧光淬灭法检测待测样品中是否含有19-去甲睾酮的方法，包括如下步骤A：
1)将能结合去甲睾酮的核酸适配体1和能结合去甲睾酮的核酸适配体2与待测样品混匀得到反应体系，反应，得到待测样品反应产物；以不加入待测样品为对照，得到对照反应产物；
所述核酸适配体1和所述核酸适配体2分别标记荧光基团和淬灭基团；
2)检测待测样品反应产物和对照反应产物的荧光强度，根据二者的荧光强度强弱比较，确定待测样品中是否含有19-去甲睾酮；
所述核酸适配体1的核苷酸序列为序列1；
所述核酸适配体2的核苷酸序列为序列2；
所述核酸适配体1的3’末端标记淬灭基团，且所述核酸适配体2的5’末端标记荧光基团；
或所述核酸适配体1的5’末端标记淬灭基团，且所述核酸适配体2的3’末端标记荧光基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述检测待测样品反应产物和对照反应产物的荧光强度，根据二者的荧光强度强弱比较，确定待测样品中是否含有19-去甲睾为如下：
若待测样品反应产物的荧光强度小于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中含有或候选含有19-去甲睾酮；若待测样品反应产物的荧光强度大于等于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中不含有或候选不含有19-去甲睾酮。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述淬灭基团为BHQ；所述荧光基团为6FAM。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述反应体系中，所述核酸适配体1和所述核酸适配体2的摩尔比为1:1；
所述反应的条件为避光反应20min；
所述检测的条件为Ex为480nm，Em为520nm。
5.一种适配体夹心荧光淬灭法检测待测样品中19-去甲睾酮含量的方法，包括如下步骤：
1)权利要求1-4中任一所述方法中的步骤A，得到待测样品反应产物的荧光强度；
2)重复所述步骤A，且将所述步骤A中的待测样品替换为不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液，得到不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液反应产物的荧光强度；以不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液的浓度log作为横坐标，不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液反应产物的荧光强度作为纵坐标制备标准曲线；
3)将所述待测样品反应产物的荧光强度代入所述标准曲线中，得到待测样品中中19-去甲睾酮含量。
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