CN105002300A

CN105002300A - 一种鱼类神经坏死病毒现场快速高灵敏检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105002300A
Application number: CN201510406000.6A
Authority: CN
Inventors: 史成银; 粟子丹; 张庆利; 黄倢; 谢国驷; 杨冰; 李晨; 刘莉
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2015-07-11
Filing date: 2015-07-11
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-07-11
Also published as: CN105002300B

Abstract

本发明的目的是提供一种简单、快速、高灵敏且易操作的鱼神经坏死病毒检测方法，并将检测所需试剂和器材组装成易于携带和可供现场使用的试剂盒。本发明使用的引物组的核苷酸序列分别为SEQ？ID？NO:1-5。本发明的方法及试剂盒用于非疾病诊断和治疗目的的赤点石斑鱼神经坏死病毒的检测，具有操作简单、耗时短、灵敏度高的优点，适用于养殖企业和各级水生动物疫病防控部门对鱼类神经坏死病毒的现场检测和监控，具有很高的实用价值和应用前景。

Description

一种鱼类神经坏死病毒现场快速高灵敏检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于水产病害防治技术领域，具体涉及一种鱼类神经坏死病毒现场快速高灵敏检测方法及试剂盒。

背景技术

鱼类神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)是单链RNA病毒，属于野田村病毒科(Nodaviridae)，乙型野田村病毒属(Betanodavirus)，是鱼类病毒性神经坏死病的病原。赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervousnecrosis virus,RGNNV)是我国最为常见的鱼类神经坏死病毒，能感染石斑鱼、舌鳎、鲈鱼等30多种鱼类。该病毒主要感染仔鱼和幼鱼，严重者死亡率可达到100％，造成了严重的经济损失。目前还无法有效治疗鱼类病毒性神经坏死病，因此快速、高灵敏地检测病原对防治该病尤其重要。

鱼类神经坏死病毒的检测方法主要有：酶联免疫吸附分析法、间接荧光抗体测试法、细胞培养法、分子生物学方法等。其中分子生物学方法相对比较快速、准确，在样品检测中应用最多。常规RT-PCR(失效的中国专利CN03114369.5、CN201110288027.1)、环介导等温扩增技术(LAMP)(中国专利CN200910039534.4)、荧光定量RT-PCR(公开的中国专利申请CN201410368037.X)等分子生物学方法都曾被用于检测NNV。这些方法虽然能检测NNV，但都存在着一些缺陷：常规RT-PCR检测灵敏度不够高，最多达到10²拷贝，不能满足防控疾病的需求；荧光定量RT-PCR检测的灵敏度高，但是需要昂贵的仪器，不能现场应用；LAMP检测虽然灵敏度高，且可现场使用，但使用染料法对扩增产物进行显色，特异性差，容易产生假阳性。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、快速、高灵敏且易操作的鱼神经坏死病毒检测方法，并将检测所需试剂和器材组装成易于携带和可供现场使用的试剂盒。该发明通过联合运用特异性的核酸等温扩增技术、便捷的扩增产物可视化鉴定技术，克服了现有技术的不足，检测过程中不需要使用昂贵、复杂的设备，判定检测结果时避免了模棱两可和主观误差，为条件简陋的实验室或养殖场提供了一项可现场使用的、准确的赤点石斑鱼神经坏死病毒检测手段。

本发明首先提供一种用于检测神经坏死病毒的引物组，包含有如下的引物：

1s：5′-TGAGTACGCTCCTGGACCGTCTGCAGTTGTGGCAAGCTCGTTGG-3′(SEQ ID NO:1)；

2a：5′-TGAGTACGCTCCTGGACCGT-3′(SEQ ID NO:2)；

3a：5′-TGACTCAAACTGCTGTATTTCCAAG-3′(SEQ ID NO:3)；

4s：5′-CCAGCAATACGACCGTCG-3′(SEQ ID NO:4)；

5a：5′-GCAGGGCAAGTGTTACGCTCG-3′(SEQ ID NO:5)；

其中引物2a、3a的5′端分别用FITC和Biotin标记。

另一方面，本发明提供了一种现场快速高灵敏检测神经坏死病毒的试剂盒，包含有如下的组分：

1)采样用膜片：美国GE医疗公司出品的Whatman牌FTA膜片；

2)阳性对照膜片：吸附了RGNNV核酸片段的FTA膜片；

3)阴性对照膜片：无RGNNV核酸的FTA膜片；

4)样品采集管：空的1.5ml塑料离心管；

5)清洗管：内装无水乙醇；

6)漂洗管：内装蒸馏水；

7)NNV检测管：0.2ml的PCR管，内装扩增反应液。扩增反应液组成成分：MgCl₂1～100mmol/L、Betaine 0.1～10mol/L、dNTPs 0.1～10mmol/L、引物1a 0.1～10μmol/L、引物2a和3a各0.1～10μmol/L、引物4s和5a各0.1～10μmol/L、M-MLV反转录酶1～100U、Bst DNA聚合酶1～100U、1×ThermoPolBuffer；

8)研磨棒：塑料或不锈钢材质的、适用于1.5ml Eppendorf管的组织研磨杵；

9)牙签；

10)吸管：1ml或3ml塑料滴管；

11)全封闭式观察盒：杭州优思达生物技术有限公司出品的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，内置核酸检测试纸条。

12)纸质包装盒：将上述材料和物品统一装在一个大小适当的长方体纸盒内，纸盒上表面覆盖有试剂盒名称的不干胶贴纸，纸盒内有具若干孔洞的塑料泡沫块1个。

本发明的试剂盒用于非疾病诊断和治疗目的的赤点石斑鱼神经坏死病毒的检测，例如对饲料、养殖水体、养殖用具和死亡鱼体的检测。一种具体的检测步骤如下：

1)取待测样品约0.02～1g置于样品采集管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

2)用牙签蘸取浆状的样品将采样用膜片充分润湿；

3)用吸管取清洗管内的无水乙醇滴在上述采样用膜片上，用牙签轻轻搅动膜片30s；

4)将上述采样用膜片转移到漂洗管内，剧烈震荡3～5min；

5)将上述膜片转移到NNV检测管内，55～75℃恒温条件下保温30～90min；

6)将上述NNV检测管置于全封闭式观察盒中，压紧并扣死手柄盖。10～15min内直接肉眼判读结果。

7)结果判读：在试纸条检测线和质控线位置均出现红色或粉色条带，表明该样品的RGNNV检测结果为阳性；在试纸条检测线位置无条带，但在质控线位置出现一条红色或粉色条带，检测结果为阴性；在试纸条质控线位置无红色或粉色条带出现，表明试纸条失效，检测失败。

在上述步骤中，从第5步开始将阳性对照膜片和阴性对照膜片分别置于另外的NNV检测管内，参照采样用膜片一同处理，直至检测完成。

本发明的优点如下：

1、本发明在分析了RGNNV基因组序列保守区的基础上，经过反复尝试和条件优化，在100余条候选引物中，最终确定了5条扩增引物，既保证了检测的特异性，又保证了其稳定性。

2、本发明采用交叉引物等温扩增方法，不需要核酸变性步骤，在等温条件下实现病毒特异性核酸片段的大量扩增，灵敏度高，且不需要昂贵、复杂的PCR仪，因此本发明提供的RGNNV检测方法和试剂盒成本低，检测效果好。

3、本发明分别在2a、3a两条特异性引物的5’端进行化学标记，然后利用切向流试纸条对扩增产物进行特异性检测，比普通的核酸染料染色法更准确、方便，能有效分辨检测结果的阳性、弱阳性和阴性。

4、本发明所提供的检测方法和试剂盒，检测RGNNV时从取样到获得检测结果仅需1.5～2小时，快速、方便，适宜于病原的快速检测。

5、本发明的试剂盒配套提供了RGNNV检测所需的所有试剂且有序排列，使RGNNV的检测能方便、快速地有序进行，能在养殖场现场使用且检测结果可靠。

6、本发明提供的试剂盒用全封闭式观察盒检测扩增产物，反应结束后不打开检测管，从物理上阻止了扩增物的外泄，有效降低了扩增产物造成的假阳性。

综上，本发明提供的试剂盒操作简单、耗时短、灵敏度高，适用于养殖企业和各级水生动物疫病防控部门对鱼类神经坏死病毒的检测和监控，具有很高的实用价值和应用前景。

附图说明

图1：CPA-LFD检测方法的优化，其中(A)扩增温度的优化；(B)dNTPs浓度的优化；(C)Mg²⁺浓度的优化。

图2：CPA-LFD的检测灵敏度及其与常规RT-PCR检测灵敏度的比较，其中(A)CPA-LFD；(B)常规RT-PCR。

图3：CPA-LFD方法与LAMP方法对比检测未知感染状况的样品，其中(A)CPA-LFD方法；(B)LAMP方法。P：阳性对照，N：阴性对照，1～9：未知感染状况的样品。

具体实施方式

本发明建立了RGNNV的CPA方法，并与LFD相结合，发明了一种可视化、高灵敏、现场快速检测RGNNV的交叉引物等温扩增切向流试纸条检测方法(CPA-LFD)及试剂盒，为条件简陋的实验室或养殖场提供了一种可现场使用的RGNNV检测手段。

实施例1：引物组的设计与筛选优化

赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)是海水养殖鱼类主要的病毒性病原之一，对我国福建、广东、海南以及台湾地区的养殖石斑鱼苗危害尤其严重，患病鱼苗死亡率达60％～100％。本发明人在分析了RGNNV基因组序列保守区的基础上，经过反复尝试和条件优化，在100余条候选引物中，最终确定了5条

CPA-LFD扩增引物，既保证了检测的特异性，又保证了其稳定性。引物序列为：

5’-TGAGTACGCTCCTGGACCGTCTGCAGTTGTGGCAA

1s：

GCTCGTTGG-3’

2a：5’-Fitc-TGAGTACGCTCCTGGACCGT-3’

3a：5’-Biotin-TGACTCAAACTGCTGTATTTCCAAG-3’

4s：5’-CCAGCAATACGACCGTCG-3’

5a：5’-GCAGGGCAAGTGTTACGCTCG-3’

为了提高检测的特异性和灵敏度，取得更好的检测效果，本发明人对CPA-LFD反应体系中的扩增温度、dNTPs浓度和Mg²⁺浓度进行了优化。通过设置6个扩增温度梯度，分别为61、63、65、67、69、71℃，优化出最佳扩增温度。在此基础上，通过设置反应体系中dNTPs的终浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0mmol/L，优化出最佳的dNTPs浓度。在上述基础上，通过在体系中加入不同体积的MgCl₂和无菌水，使Mg²⁺的终浓度为分别为3、4、5、6、7、8mmol/L，优化出最适的Mg²⁺浓度(图1)。综合以上结果，最终优化出最适的扩增温度和反应体系。

实验最终确定的最佳扩增温度为69℃。25μL反应体系含：MgCl₂5mmol/L、Betaine 1.2mol/L、dNTPs 1.2mmol/L、引物1a 1.6μmol/L、引物2a和3a各0.8μmol/L、引物4s和5a各0.2μmol/L、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、BstDNA聚合酶8U、M-MLV反转录酶28U，RNA模板适量，双蒸水补充至25μL。

实施例2：CPA-LFD检测方法的灵敏度

为了测定CPA-LFD方法的检测灵敏度，并与已有的常规RT-PCR方法相比较，进行了如下测试。取1μL 10倍梯度稀释(10⁶～10⁰copies/μL)的RGNNVRNA作为模板，用两种方法分别扩增检测。其中CPA-LFD采用上述优化后的反应体系和扩增温度。常规RT-PCR采用Dalla Valle等人的方法(Dalla Valle L,ToffoloV,Lamprecht M,et al.Development of a sensitive and quantitative diagnostic assayfor fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR[J].Vet Microbiol2005,110:167-179.)，使用引物Q-RdRP-1(5’-GTG TCC GGA GAG GTT AAGGAT G-3')和Q-RdRP-2(5'-CTT GAA TTG ATC AAC GGT GAA CA-3')进行；反转录为42℃1h；PCR反应程序为：95℃1min；95℃20sec，60℃20s，72℃20s，45个循环；最后72℃延伸5min。结果表明，CPA-LFD的检测极限为10¹copies/μL，常规RT-PCR方法的检测极限为10²copies/μL(图2)。证明本专利申请发明的CPA-LFD方法比常规RT-PCR的灵敏度高10倍，是一种更优的RGNNV检测方法。

为了验证本发明提供的5条引物在CPA-LFD方法中的检测优势，在100余条候选引物中，另外选取了2组10条引物，采用上述扩增温度和反应条件分别进行CPA-LFD测试，结果表明其它引物的检测灵敏度仅为10²copies/μL和10³copies/μL，均不如本发明所提供的引物。

实施例3：本发明的检测试剂盒由下列试剂和和材料组成(每个试剂盒可检测4个样品)

(1)采样用膜片4条：分别装在4只0.2ml塑料离心管中；

(2)阳性对照膜片1条：装在1只0.2ml塑料离心管中；

(3)阴性对照膜片1条：装在1只0.2ml塑料离心管中；

(4)样品采集管4只；

(5)清洗管1只：内装无水乙醇0.8ml；

(6)漂洗管4只：每只内装蒸馏水1.0ml；

(7)NNV检测管6只：每只内装扩增反应液25μl；

(8)研磨棒4支；

(9)牙签20支；

(10)吸管1支；

(11)全封闭式观察盒6只：每只内置核酸检测试纸条1条。

(12)使用说明书1份。

(13)包装盒1个：将上述材料和物品统一装在一个长方体的纸盒内，其外形尺寸为200×100×50mm；纸盒上表面覆盖不干胶贴纸，注明试剂和名称和图案；纸盒内含塑料泡沫块1个，塑料泡沫块上有孔洞6×4个。

实施例4：应用本发明的检测试剂盒检测死亡的石斑鱼样品

1、取刚死亡的石斑鱼脑部、眼等组织样品约0.1g，置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

2、用牙签蘸取浆状的样品，将采样用膜片充分润湿；

3、用吸管清洗液，滴2～3滴于上述采样用膜片上，用新牙签轻轻搅动膜片30秒；

4、用新牙签将上述膜片转移到漂洗管内，剧烈震荡4min；

5、用新牙签将上述漂洗管内的膜片和试剂盒提供的阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到不同的NNV检测管内，置于69℃金属浴上或水浴锅中保温60min；

6、将上述NNV检测管置于全封闭式观察盒中，扣紧手柄盖，10min后观察结果。在试纸条检测线和质控线位置均出现红色或粉色条带，表明该样品的RGNNV检测结果为阳性；在试纸条检测线位置无条带，但在质控线位置出现一条红色或粉色条带，检测结果为阴性；在试纸条质控线位置无红色或粉色条带出现，表明试纸条失效，检测失败。同时，阳性对照膜片对应的检测结果应该为阳性，阴性对照膜片对应的检测结果应该为阴性，否则应判定检测结果无效。

实施例5：本发明的CPA-LFD方法与已有的LAMP方法的对比检测取9份未知感染状况的、死亡的半滑舌鳎鱼苗样品，分别使用本发明建立的CPA-LFD检测方法和已有的LAMP检测方法进行RGNNV的检测，比较检测结果。CPA-LFD方法按上述体系和步骤进行，LAMP方法按文献(中国专利CN200910039534.4)提供的体系和步骤进行。结果发现，CPA-LFD方法和LAMP方法检测结果基本一致，其中1～5号和9号样品为RGNNV阴性，6和8号样品为强阳性(图3)。但对于7号样品，CPA-LFD方法的检测结果为清晰的弱阳性，而LAMP方法的检测结果难以分辨是阴性还是弱阳性。因此本发明的CPA-LFD方法检测结果更为准确、易读，且不需要核酸变性步骤，明显优于已有的LAMP方法。

Claims

1.一种用于检测神经坏死病毒的引物组，其特征在于，所述的引物组包含有如下的引物：

1s：5′-TGAGTACGCTCCTGGACCGTCTGCAGTTGTGGCAAGCTCGTTGG-3′、

2a：5′-TGAGTACGCTCCTGGACCGT-3′、

3a：5′-TGACTCAAACTGCTGTATTTCCAAG-3′、

4s：5′-CCAGCAATACGACCGTCG-3′、

5a：5′-GCAGGGCAAGTGTTACGCTCG-3′。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的引物2a的5′端用FITC标记。

3.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的引物3a的5′端用Biotin标记。

4.一种用于检测神经坏死病毒的试剂盒，包含有如下的组分：

1)采样用膜片：美国GE医疗公司出品的Whatman牌FTA膜片；

2)阳性对照膜片：吸附了RGNNV核酸片段的FTA膜片；

3)阴性对照膜片：无RGNNV核酸的FTA膜片；

4)样品采集管：空的1.5ml塑料离心管；

5)清洗管：内装无水乙醇；

6)漂洗管：内装蒸馏水；

7)NNV检测管：0.2ml的PCR管，内装扩增反应液；扩增反应液组成成分：MgCl₂1～100mmol/L、Betaine0.1～10mol/L、dNTPs0.1～10mmol/L、权利要求1所述的引物1a0.1～10mmol/L、引物2a和3a各0.1～10mmol/L、引物4s和5a各0.1～10mmol/L、M-MLV反转录酶1～100U、Bst DNA聚合酶1～100U、1×ThermoPol Buffer；

9)牙签；

10)吸管：1ml或3ml塑料滴管；

11)全封闭式观察盒：杭州优思达生物技术有限公司出品的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，内置核酸检测试纸条；

12)使用说明书；

13)纸质包装盒：将上述材料和物品统一装在一个大小适当的长方体纸盒内，纸盒上表面覆盖有试剂盒名称的不干胶贴纸，纸盒内有具若干孔洞的塑料泡沫块1个。

5.权利要求4所述的试剂盒用于非疾病诊断和治疗目的的赤点石斑鱼神经坏死病毒的检测。

6.一种检测饲料、养殖水体、养殖用具或死亡鱼体中神经坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括有如下的步骤；

2)用牙签蘸取浆状的样品将采样用膜片充分润湿；

4)将上述采样用膜片转移到漂洗管内，剧烈震荡3～5min；

6)将上述NNV检测管置于全封闭式观察盒中，压紧并扣死手柄盖；10～15min内直接肉眼判读结果；

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤中，从第5步开始将阳性对照膜片和阴性对照膜片分别置于另外的NNV检测管内，参照采样用膜片一同处理，直至检测完成。