CN106702022A

CN106702022A - 一种鱼神经坏死病毒的rt‑lamp反应引物组、检测试剂盒及其应用方法

Info

Publication number: CN106702022A
Application number: CN201611252883.0A
Authority: CN
Inventors: 袁于人; 殷波; 陆洲; 翟伟锋
Original assignee: Bio Technology (suzhou) Co Ltd
Current assignee: Bio Technology (suzhou) Co Ltd
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及鱼神经坏死病毒的RT‑LAMP检测反应引物组、试剂盒及其应用方法，其RT‑LAMP反应引物组包含外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，RT‑LAMP检测试剂盒包含引物组、10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、M‑MuLV反转录酶、RNase‑Free水，应用方法包括以下步骤：提取总RNA，配置RT‑LAMP检测体系，将检测体系置于61℃下恒温反应30min、80℃灭活5min，判定有无NNV病毒。本发明建立了一种特异性强、反应时间短、操作简单的鱼神经坏死病毒检测方法和检测试剂盒。

Description

一种鱼神经坏死病毒的RT-LAMP反应引物组、检测试剂盒及其应用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼神经坏死病毒的RT-LAMP反应引物组、检测试剂盒及其应用方法。

背景技术

随着鱼类养殖业的迅速发展壮大，养殖过程中各种疾病的出现，给养殖户带来了巨大的经济损失。鱼神经坏死病毒(nervous necrosis virous,NNV)是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的传染性病原。可以导致鱼类病毒性神经坏死病又称病毒性脑病和视网膜病，具有极高的传染性和危害性，严重情况下，仔鱼和幼鱼的死亡率可以达到100％。近年来研究表明，NNV病毒的感染可以破坏线粒体，进而导致细胞的死亡。对于鱼类神经坏死病目前尚无有效的防治方法，由于该传染病很大一部分来自亲鱼的垂直传播，因此，加强苗种的检疫，使用健康不带毒的种苗进行养殖，可以大大减少该传染病的爆发几率。目前使用的检测方法有显微镜观察法、免疫学方法、分子生物学方法和细胞培养法。本发明建立了一种方便快捷的RT-LAMP病毒核酸检测法。

环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增技术，LAMP反应是在一个恒定温度的条件下进行的，样品的扩增发生在环区域，包含两种方式：一种是在颈环结构区域3’端的自我延伸，另一种是新的引物在环区域发生的延伸。由于LAMP技术具有高灵敏度、强特异性、快速简便、成本低廉等特点，使其广泛应用于病原菌的检测、胚胎性别鉴定、食品卫生检测等方面。

中国专利200910039534.4公开了一种赤点鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒，通过内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3组成引物组，能够在1小时左右完成扩增。

本发明利用RT-LAMP检测技术，建立了鱼神经坏死病毒的快速检测方法。通过对比选取了特异性好的一组扩增引物，并优化了反应时间、反应温度等条件，检验了该方法的灵敏性和特异性，最终建立了一套不依赖复杂设备，操作简单，只需肉眼观察就可以实施的检测方案。

发明内容

本发明的目的是介绍一种操作简单、不依赖复杂的设备、特异性强、成本低廉的鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒和应用方法。

为了实现以上目的，本发明的具体实施方案如下：

一种检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP反应引物组，其特征在于，所述RT-LAMP反应引物组包含外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，其中：

外引物F3序列如SeqID NO.1所示，外引物B3序列如SeqID NO.2所示，内引物FIP序列如SeqID NO.3所示，内引物BIP序列如SeqID NO.4所示。

优选地，含有上述RT-LAMP反应引物组的检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP试剂盒，包含如下试剂：引物组、10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、M-MuLV反转录酶、RNase-Free水。

优选地，所述10×反应缓冲液包括：200mM pH 8.8的Tris-HCl；100mM(NH₄)₂SO₄；100mM KCl；20mM MgSO₄；1％TritonX-100；50mM dNTPs；100mM DTT；100mM钙黄绿素。

优选地，所述引物组中，内引物BIP、FIP浓度均为400pmol，外引物B3、F3浓度均为50pmol。

上述检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)总RNA的提取；

(2)吸取检测试剂盒的试剂，与提取的RNA混合，配置RT-LAMP检测体系；

(3)将步骤(2)配置好的检测体系置于61℃下恒温反应30min，80℃灭活5min；

(4)判定有无NNV病毒。

优选地，步骤(1)所述总RNA提取是通过解剖获得鱼的眼和脑组织，提取总RNA。

优选地，步骤(2)所述RT-LAMP检测体系按25μl为例，包括引物组1μl，10×反应缓冲液2.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，M-MuLV反转录酶1μl，RNase-Free水18.5μl，提取的总RNA1μl。

优选地，步骤(4)中，有无NNV病毒的判定方法为：根据反应后管内液体有无绿色荧光判断检测样品为阴性或阳性，其中，有绿色荧光的为阳性结果，无绿色荧光的为阴性结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明结果表明最佳扩增时间为30分钟。本发明无需复杂设备，操作简单，反应时间短，结果容易判定，由于钙黄绿素为预先加入到反应体系中，而非反应结束后再打开盖子加入，因此整个过程无需开盖，避免了气溶胶的污染。

附图说明：

图1荧光目视结果；

图2 RT-LAMP特异性实验结果；

图3 RT-LAMP的灵敏性扩增结果；

序列表说明：

SeqID NO.1外引物F3序列；

SeqID NO.2外引物B3序列；

SeqID NO.3内引物FIP序列；

SeqID NO.4内引物BIP序列。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：引物的制备。

参照鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列(GenBank:AF245004.1)，制备引物组，包含外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，其中：

外引物F3序列如SeqID NO.1所示，外引物B3序列如SeqID NO.2所示，内引物FIP序列如SeqID NO.3所示，内引物BIP序列如SeqID NO.4所示；

实施例2：一种鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒的配制。

其中，10×反应缓冲液包括：200mM pH 8.8的Tris-HCl；100mM(NH₄)₂SO₄；100mMKCl；20mM MgSO₄；1％TritonX-100；50mM dNTPs；100mM DTT；100mM钙黄绿素。

引物组浓度为：内引物BIP、FIP浓度均为400pmol，外引物B3、F3浓度均为50pmol。

实施例3：产物检测。

(1)总RNA的提取：

取石斑鱼的脑及眼组织20mg，在液氮中磨碎；加入600μL Buffer RL，室温放置5分钟；12000rpm离心5分钟，取上清；向上清溶液中加入1倍体积的70％的乙醇，混匀；将所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入350μL Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入500μL Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇；将吸附柱转入新的离心管中，向吸附柱中间加入50μL RNaseFree Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液。

(2)配置RT-LAMP检测体系：

按25μl为例，取RT-LAMP反应试剂盒(按实施例2制备)试剂24μl(其中，10×反应缓冲液2.5μL、引物组1.0μL、Bst DNA聚合酶1.0μL、M-MuLV反转录酶1.0μL、RNase-Free水18.5μL)，加入提取的总RNA 1μl。

(3)反应：

将配置好的RT-LAMP检测体系置于61℃条件下恒温30min，再置于80℃下灭活5min。

(4)产物结果的判断：

RT-LAMP反应的目视检测：根据反应后管内液体有无绿色荧光判断检测样品为阴性或阳性，其中，有绿色荧光的为阳性结果，无绿色荧光的为阴性结果。结果如图1所示。

实施例4：特异性检测。

本实验选取9种常见鱼类病毒的核酸，1斜带鱼神经坏死病毒、2传染性胰脏坏死病毒、3病毒性出血性败血症病毒、4淋巴囊肿病毒、5大菱鲆红体病虹彩病毒、6传染性鲑鱼贫血症病毒、7嗜水气单胞菌、8哈维氏弧菌、9鳗弧菌核酸，利用上述试验建立的方法，结果如图2所示。

结果表明只有含有NNV核酸的样品有绿色荧光，其余无荧光，本发明建立的RT-LAMP法对NNV有特异性。

进一步的，本实验进行了现场检测，本实验随机抽取20尾赤点鱼鱼苗，分别采用本实验的RT-LAMP法和RT-PCR法，检测结果完全一致，说明本实验的RT-LAMP法准确可靠。

实施例5：灵敏性检测。

将提取的总RNA分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5，并以稀释后的样品为模板，进行反应。

同时利用上述稀释样品进行RT-PCR对照试验，结果表明其灵敏度与本发明的RT-LAMP法相当，然而相对于耗时6h的RT-PCR法，本发明的RT-LAMP法优化后仅需要30min既可以完成，如图3所示。

本发明由于引物的设计是针对高度保守区，且不同毒株间无明显差异，因此本发明提供的检测方法有着更加广泛的应用价值。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 斯澳生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种鱼神经坏死病毒的RT-LAMP反应引物组、检测试剂盒及其应用方法

<130> 2016

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcgagaatct cccaggcc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gaaggtgtgg tcgttgtca 19

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tagcagcgtg tcccagtcgt gggacaggaa ctgacgga 38

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

attcagccaa tgtgccccgc gatcaggcag gaagccag 38

Claims

1.一种检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP反应引物组，其特征在于，所述RT-LAMP反应引物组包含外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，其中：

2.一种检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如下试剂：权利要求1所述的RT-LAMP反应引物组、10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、M-MuLV反转录酶、RNase-Free水。

3.根据权利要求2所述的检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述10×反应缓冲液包括：200mM pH 8.8的Tris-HCl；100mM(NH₄)₂SO₄；100mM KCl；20mMMgSO₄；1％TritonX-100；50mM dNTPs；100mM DTT；100mM钙黄绿素。

4.根据权利要求3所述的检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述引物组中，内引物BIP、FIP浓度均为400pmol，外引物B3、F3浓度均为50pmol。

5.根据权利要求2-4任一项所述的检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)总RNA的提取；

(4)判定有无NNV病毒。

6.根据权利要求5所述的检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒的应用，其特征在于，步骤(1)所述总RNA提取是通过解剖获得鱼的眼和脑组织，提取总RNA。

7.根据权利要求5所述的检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒的应用，其特征在于，步骤(2)所述RT-LAMP检测体系按25μl为例，包括引物组1μl，10×反应缓冲液2.5μl，BstDNA聚合酶1μl，M-MuLV反转录酶1μl，RNase-Free水18.5μl，提取的总RNA 1μl。

8.根据权利要求5所述的检测鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，有无NNV病毒的判定方法为：根据反应后管内液体有无绿色荧光判断检测样品为阴性或阳性，其中，有绿色荧光的为阳性结果，无绿色荧光的为阴性结果。