CN115992143A - 一种抗神经坏死病毒的高通量药物筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，其序列为tggttgtgggggaggtccgtcttgcagtgctggctacgcttcgggtagag或其衍生物组成。该ssDNA核酸适配体可应用于检测抗神经坏死病毒或筛选抗神经坏死病毒感染的药物。这对于快速检测抗鱼类神经坏死病毒，并筛选抗神经坏死病毒感染的药物，为海水鱼养殖中神经坏死病毒病的防控治疗奠定了基础。

Description

一种抗神经坏死病毒的高通量药物筛选方法

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一种用于抗神经坏死病毒的高通量药物筛选。

背景技术

向海洋进军，全力推动海洋经济的发展已成为我国的重要战略。近年来，我国海洋经济迅猛发展，2021年全国海洋生产总值突破9万亿元，其中海洋渔业经济在海洋经济中占比超过17.8％。然而，海洋经济鱼类在高密度、集约化养殖条件下，各种养殖病害的频频爆发造成巨大经济损失。

其中，神经坏死症病毒(Nervous Necrosis Virus，NNV)是最严重的传染性海水鱼养殖病原之一，感染速度快，致死率高，特别是对苗种生产期的仔鱼和幼鱼危害很大，致死率高达100％。然而目前针对鱼类神经坏死症病毒尚无市场化的有效抗病毒药物，海水鱼养殖正处于无药可用的困局。为了进一步降低神经坏死病毒危害我国水产养殖业的风险，人们需要一种可以高效快速检测到神经坏死病毒的手段，用于海水鱼养殖中神经坏死症病毒病的防控治疗。

指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment technology，SELEX)是一种生物文库筛选技术，该技术使用容量高达10¹⁴～10¹⁵的随机寡核苷酸文库，在体外经过多轮筛选最终获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰、稳定性强、高特异性识别并结合靶物质等诸多优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗神经坏死病毒的高通量药物筛选方法，以提高神经坏死病毒的检测水平，有效提高研究人员预防及治疗神经坏死病毒的效率。

根据本发明的第一个方面，提供一种用于检测神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，命名为LYNV1，由以下序列组成：如SEQ ID NO.1所示的DNA序列及其衍生物，衍生物为SEQID NO.1所示的DNA序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

优选地，ssDNA核酸适配体被标记物标记，标记物选自发光物质、生物素、酶中的一种或多种。

优选地，标记物为发光物质，发光物质选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明中的一种或多种。

优选地，标记物包括羟基荧光素。

根据本发明的第二个方面，提供上述ssDNA核酸适配体在检测抗神经坏死病毒中的应用。

优选地，ssDNA核酸适配体被标记物标记；使待测样品与宿主细胞进行孵育，然后使ssDNA核酸适配体与宿主细胞进行孵育，接着洗涤宿主细胞，最后对宿主细胞进行标记物的标记信号检测，通过标记信号的强度作出待测样品中是否含有抗神经坏死病毒的判断。

优选地，ssDNA核酸适配体与宿主细胞孵育的时间为30分钟。

本方案提供的检测抗神经坏死病毒方法操作简单、使用方便、完整检测流程的耗时小于1小时，可以快速出检测结果。而现有的检测技术RT-qPCR操作繁琐，耗时长达12小时，本方案只需RT-qPCR技术的1/12的检测时间，即可获得检测结果，对研究人员高效检测出神经坏死病毒并进行预防及治疗有重大的实验意义。

根据本发明的第三个方面，提供一种用于检测抗神经坏死病毒的试剂盒，试剂盒包括上述ssDNA核酸适配体。

根据本发明的第四个方面，提供上述ssDNA核酸适配体在筛选抗神经坏死病毒感染的药物中的应用。

优选地，ssDNA核酸适配体被标记物标记；使待测药物与神经坏死病毒混合，将由此形成的混合物与宿主细胞进行孵育，然后使ssDNA核酸适配体与宿主细胞进行孵育，接着洗涤宿主细胞，最后对宿主细胞进行标记物的标记信号检测，基于标记信号的强度评价待测药物的抗神经坏死病毒能力。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

①本发明提供的核酸适配体，对神经坏死病毒具有高敏感性，与现有的蛋白抗体相比具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白抗体所不具备的特点：无免疫原性；制备周期短，重现性好；分子量小，便于体外化学合成；便于标记；易于对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代；序列稳定易于运输和保存等。

②采用本发明的基于核酸适配体的抗鱼类神经坏死病毒药物高通量快速筛选技术(LYNV1-AHTS)，操作简单迅速，耗时短，检测结果精准，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等开发相关的药物快速筛选试剂盒。这对于快速筛选抗鱼类神经坏死病毒药物，并用于海水鱼养殖中神经坏死病毒病的防控治疗具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例中，多功能酶标仪检测羟基荧光素(FAM)标记的LYNV1与石斑鱼神经坏死病毒感染细胞的结合情况，对照组：羟基荧光素(FAM)标记的LYNV1与未感染石斑鱼神经坏死病毒细胞的结合情况。

图2是实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测石斑鱼神经坏死病毒感染细胞的情况，对照组：未感染石斑鱼神经坏死病毒细胞。

图3是本发明实施例中，LYNV1-AHTS分析评估11种药用植物成分的抗病毒活性，对照组1：羟基荧光素(FAM)标记的LYNV1与未感染石斑鱼神经坏死病毒细胞的结合情况；对照组2：羟基荧光素(FAM)标记的LYNV1与感染石斑鱼神经坏死病毒细胞的结合情况。

图4是实时荧光定量PCR分析评估11种药用植物成分的抗病毒活性，对照组1：未感染NNV病毒的GS细胞；对照组2：感染NNV病毒的GS细胞。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

石斑鱼脾脏细胞(Grouper Spleen cell，GS)保存于本实验室，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。

石斑鱼神经坏死病毒NNV(广西株，nervous necrosis virus from hybridgrouper cultured in Guangxi)是通过对广西近海网箱养殖石斑鱼的病原微生物进行分离鉴定，获得石斑鱼神经坏死病毒，保存于本实验室，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。下述实施例中使用前将NNV病毒在细胞培养基中稀释至10⁶TCID₅₀/mL。

羟基荧光素(FAM)标记的SEQ ID NO.1：

5’-FAM-TGGTTGTGGGGGAGGTCCGTCTTGCAGTGCTGGCTACGCTTCGGGTAGAG-3’，适配体由上海生工合成。

石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白(Major capsid protein，CP)基因引物：

正向引物(qCP-F)5’-GCACGCTTCTCTCACCTTCA-3’，反向引物(qCP-R)5’-AACGGCAACGGGAGCACTA-3’。引物由上海生工合成。

内参基因β-actin引物：

正向引物(β-actin-F)5’-CAACTGACAACGATCACACCTTC-3’，反向引物(β-actin-R)5’-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3’。引物由上海生工合成。

实施例1.核酸适配体LYNV1监测不同感染时间的NNV感染情况

GS细胞培育：将GS细胞按照8000个/孔的数量传入96孔板，28℃培养18小时。

处理①组：取部分本实施例培育的GS细胞，采用NNV病毒(MOI＝0.4)感染GS细胞，并于感染时间为0、6、12、24、48h，分别取样，将羟基荧光素(FAM)标记的ssDNA核酸适配体FAM-LYNV1(FAM-LYNV1在使用前在90℃变性5min，然后在冰上复性5min)加入上述GS细胞中，加入FAM-LYNV1的剂量为200nM，使FAM-LYNV1与上述GS细胞在冰上共同孵育30min，孵育结束后，用PBS轻轻洗涤3次后，收集细胞。

对照处理①组：取部分本实施例培育的GS细胞，静置，并于静置时间为0、6、12、24、48h，分别取样，将羟基荧光素(FAM)标记的ssDNA核酸适配体FAM-LYNV1(FAM-LYNV1在使用前在90℃变性5min，然后在冰上复性5min)加入上述GS细胞中，加入FAM-LYNV1的剂量为200nM，使FAM-LYNV1与上述GS细胞在冰上共同孵育30min，孵育结束后，用PBS轻轻洗涤3次后，收集细胞。

测试方法：使用多功能酶标仪分析FAM-LYNV1对NNV感染细胞的结合效果及其特异性。

实验结果：

本实施例的检测结果如图1所示：采用FAM-LYNV1与处理①组的GS细胞孵育，随着GS细胞与NNV病毒共同孵育的时间延长，所检测到的荧光强度明显地增强；采用FAM-LYNV1与对照处理①组的GS细胞孵育，随着GS细胞的静置时间延长，所检测到的荧光强度变化不大。由此说明，FAM-LYNV1对NNV感染的GS细胞具有高特异性识别能力。

实施例2.RT-PCR监测不同感染时间的NNV感染情况

将GS细胞按照6.4×10⁵个/孔的数量传入12孔板，28℃培养18小时，然后采用NNV病毒(MOI＝0.4)感染GS细胞。

测试方法：

对于本实施例培育的GS细胞，分别于NNV病毒感染时间为0、6、12、24、48h时取样，将取样细胞和培养基收集提取RNA，并将其反转录成cDNA，以cDNA为模板，β-actin基因作为内参基因，用RT-qPCR检测石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白CP基因的表达情况。

实验结果：

本实施例的RT-qPCR检测结果如图2所示：在NNV病毒感染时间为0h取样的GS细胞，检测不到石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白CP基因的表达；随着GS细胞与NNV病毒共同培养的时间延长，在GS细胞中所检测到的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白CP基因的相对表达量呈持续升高的趋势。上述结果与实施例1所展示的结果吻合，由此，能够佐证实施例1中，采用核酸适配体LYNV1监测不同感染时间的NNV感染情况具有可靠性。

实施例3.LYNV1-AHTS技术分析评估11种药用植物成分的抗病毒活性

GS细胞培育：将GS细胞按照8000个/孔的数量传入96孔板，28℃培养18小时。

处理②组：将参试药用植物成分和NNV病毒(MOI＝0.4)加入本实施例培育的GS细胞中，在本实施例中，参试药用植物成分有11种，将上述得到的GS细胞混合物于28℃孵育培养48h。将羟基荧光素(FAM)标记的ssDNA核酸适配体FAM-LYNV1(FAM-LYNV1在使用前在90℃变性5min，然后在冰上复性5min)分别加入上述GS细胞混合物中，加入FAM-LYNV1的剂量为200nM，使FAM-LYNV1与GS细胞在冰上共同孵育10min，孵育结束后，用PBS轻轻洗涤3次后，收集细胞。

对照处理②A组：取部分本实施例培育的GS细胞，静置48h。将羟基荧光素(FAM)标记的ssDNA核酸适配体FAM-LYNV1(FAM-LYNV1在使用前在90℃变性5min，然后在冰上复性5min)加入上述GS细胞中，加入FAM-LYNV1的剂量为200nM，使FAM-LYNV1与上述GS细胞在冰上共同孵育10min，孵育结束后，用PBS轻轻洗涤3次后，收集细胞。

对照处理②B组：取部分本实施例培育的GS细胞，采用NNV病毒(MOI＝0.4)感染GS细胞，并于感染时间为48h。将羟基荧光素(FAM)标记的ssDNA核酸适配体FAM-LYNV1(FAM-LYNV1在使用前在90℃变性5min，然后在冰上复性5min)加入上述GS细胞中，加入FAM-LYNV1的剂量为200nM，使FAM-LYNV1与上述GS细胞在冰上共同孵育10min，孵育结束后，用PBS轻轻洗涤3次后，收集细胞。

测试方法：使用多功能酶标仪分析FAM-LYNV1对NNV感染细胞的结合效果及其特异性。

实验结果：

本实施例的检测结果如图3所示：以本实施例设置的对照处理的对照处理②A组作为阴性对照组，该对照处理组对应的荧光强度低于5000；以本实施例设置的对照处理的对照处理②B组作为阳性对照组，该对照处理组对应的荧光强度接近35000，明显高于对照处理②A组对应的荧光强度值；而在本实施例所设置处理②组中，分别考察了11种参试药用植物成分对NNV病毒感染GS细胞的抑制效果，如图3所示，与对照处理②B组相比，这些参试药用植物成分的引入，都能够使实验体系的荧光强度值发生明显的下降，由此可以说明，参试的11种参试药用植物成分都能够对与NNV病毒感染GS细胞起到明显的抑制作用。

实施例4.RT-qPCR技术分析评估11种药用植物成分的抗病毒活性

将GS细胞按照6.4×10⁵个/孔的数量传入12孔板，28℃培养18小时。

处理③组：将参试药用植物成分和NNV病毒(MOI＝0.4)加入本实施例培育的GS细胞中，在本实施例中，参试药用植物成分有11种，将上述得到的GS细胞混合物于28℃孵育培养48h。

对照处理③A组：取部分本实施例培育的GS细胞，静置48h。

对照处理③B组：取部分本实施例培育的GS细胞，采用NNV病毒(MOI＝0.4)感染GS细胞48h。

测试方法：

将上述处理③组、对照处理③A组和对照处理③B组的GS细胞和培养基收集提取RNA，并将其反转录成cDNA，以cDNA为模板，β-actin基因作为内参基因，用RT-qPCR检测石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白CP基因的表达情况。

实验结果：

本实施例的RT-qPCR检测结果如图4所示：以本实施例设置的对照处理的对照处理③A组作为阴性对照组，该对照处理组检测不到石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白CP基因的表达；以本实施例设置的对照处理的对照处理③B组作为阳性对照组，该对照处理组对应的检测到石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白CP基因表达量高于60000；而在本实施例所设置处理③组中，分别考察了11种参试药用植物成分对NNV病毒感染GS细胞的抑制效果，如图4所示，与处理③B组相比，这些参试药用植物成分的引入，都能够使实验体系的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白CP基因表达量发生明显的下降，不同药物的下降幅度与实施例3中处理②组的荧光强度下降幅度的变化相似，由此可以说明，RT-qPCR检测结果与LYNV1-AHTS相似。此外，就操作简便性而言，RT-qPCR技术的操作繁琐，耗时长达12h，LYNV1-AHTS技术的操作简便，耗时小于2h。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种用于检测神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，其特征在于，由以下序列组成：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其衍生物，所述衍生物为所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

2.如权利要求1所述用于检测神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，其特征在于：所述ssDNA核酸适配体被标记物标记，所述标记物选自发光物质、生物素、酶中的一种或多种。

3.如权利要求2所述用于检测神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，其特征在于：所述标记物为发光物质，所述发光物质选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明中的一种或多种。

4.如权利要求3所述用于检测神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，其特征在于：所述标记物包括羟基荧光素。

5.如权利要求1～4任一项所述ssDNA核酸适配体在检测抗神经坏死病毒中的应用，所述应用不包括在疾病诊断中的应用。

6.如权利要求5所述ssDNA核酸适配体在检测抗神经坏死病毒中的应用，其特征在于：

所述ssDNA核酸适配体被标记物标记；

使待测样品与宿主细胞进行孵育，然后使所述ssDNA核酸适配体与所述宿主细胞进行孵育，接着洗涤所述宿主细胞，最后对宿主细胞进行所述标记物的标记信号检测，通过所述标记信号的强度作出所述待测样品中是否含有抗神经坏死病毒的判断。

7.一种用于检测抗神经坏死病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1～4任一项所述ssDNA核酸适配体。

8.如权利要求1～4任一项所述ssDNA核酸适配体在筛选抗神经坏死病毒感染的药物中的应用。

9.如权利要求7所述ssDNA核酸适配体在筛选抗神经坏死病毒感染的药物中的应用，其特征在于：

所述ssDNA核酸适配体被标记物标记；

使待测药物与神经坏死病毒混合，将由此形成的混合物与宿主细胞进行孵育，然后使所述ssDNA核酸适配体与所述宿主细胞进行孵育，接着洗涤所述宿主细胞，最后对宿主细胞进行所述标记物的标记信号检测，基于所述标记信号的强度评价所述待测药物的抗神经坏死病毒能力。

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