CN117205213A - 白鲜碱在制备鱼类病毒性神经坏死病药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产养殖技术领域，涉及水产动物病害的防治，具体涉及白鲜碱在制备鱼类病毒性神经坏死病药物中的用途。本发明首先确定白鲜碱具有抗神经坏死病毒活性，在此基础上利用Reed‑Muench法获得白鲜碱对神经坏死病毒的滴度，再通过不同白鲜碱使用剂量下石斑鱼的存活率获取白鲜碱的安全剂量，并研究白鲜碱对于石斑鱼感染神经坏死病毒后存活率和衣壳蛋白表达的影响，最终证实白鲜碱在石斑鱼感染神经坏死病毒之后具有显著的治疗作用。本发明为鱼类病毒性神经坏死病的防治提供一种可供选择的药物，同时为进一步研究白鲜碱抗神经坏死病毒的靶点奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，涉及水产动物病害的防治，具体涉及白鲜碱在制备鱼类病毒性神经坏死病药物中的用途。
背景技术
鱼类病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis，VNN）是由神经坏死病毒（nervous necrosis virus，NNV）引起的一种世界范围的鱼类流行性传染病。NNV的遗传信息由两个单链正义RNA（RNA1和RNA2）组成，其中RNA1负责病毒的转录和翻译；RNA2负责编码NNV组装、释放和入侵宿主的关键衣壳蛋白（capsid protein，CP），而CP决定病毒的宿主范围。NNV危害蝶形目、鲈形目和鳕形目等百余种鱼类，尤其危害石斑鱼、鲈鱼、金鲳鱼等。NNV主要在鱼类仔鱼、稚鱼和幼鱼阶段大规模爆发，导致种苗大规模死亡，尤其对于石斑鱼来说，其孵化一个月内的死亡率可达到100％。
目前，病毒性神经坏死病的防控处在瓶颈阶段，在鱼类养殖过程中，仔鱼、稚鱼和幼鱼特异性免疫系统尚未发育完整，疫苗免疫存在局限，疫苗发挥作用前苗种经常出现大规模死亡。因此，药物治疗是目前VNN疫病防控的重要手段。但自金刚烷胺、鸟嘌呤类似物和利巴韦林等药物被禁用以来，鲜有高效的水产抗病毒药物可用。
中草药含有多种多样的抗病毒活性成分，在抗病毒方面具有较少产生耐药性、毒副作用小及广谱抗病毒等优势，符合无公害水产养殖的要求。中草药及其活性成分是新药研究的出发点和药源库，从大量天然产物中发掘抗病毒活性成分成为医药研究的热点，具有不可替代的优势。然而，中草药成分对于鱼类VNN的防治目前研究成果极少，对于鱼类感染NNV之后的治疗，目前更是缺乏有效的解决方案。
发明内容
对于鱼类感染NNV目前尚无有效的治疗药物，为技术所述技术问题，本发明提供白鲜碱在石斑鱼病毒性神经坏死病防治中的用途。
进一步地，在上述用途中，在石斑鱼感染神经坏死病毒后，白鲜碱具有抑制神经坏死病毒的衣壳蛋白复制活性。
进一步地，在上述用途中，白鲜碱抑制衣壳蛋白的IC50值为8.64μM。
进一步地，在上述用途中，斜带石斑鱼鳍条细胞系感染神经坏死病毒后，白鲜碱具有抗斜带石斑鱼鳍条细胞系病变的作用。
进一步地，在上述用途中，在石斑鱼感染神经坏死病毒后，白鲜碱具有降低石斑鱼死亡率的作用。
进一步地，在上述用途中，白鲜碱的安全使用剂量为5mg/kg；所述安全使用剂量指石斑鱼的存活率不低于90%的白鲜碱使用剂量。
与现有技术相比，本发明“白鲜碱在制备鱼类病毒性神经坏死病药物中的用途”具有以下有益效果：
本发明通过CCK8法、RT-qPCR法、病毒滴度测定法等实验，首次验证了白鲜碱具有抑制神经坏死病毒的衣壳蛋白复制活性，白鲜碱抑制神经坏死病毒衣壳蛋白的IC50值为8.64μM。另外，白鲜碱对于NNV诱导斜带石斑鱼鳍条细胞系产生的细胞病变具有显著抗性，同时具有降低石斑鱼死亡率的作用。本发明为鱼类病毒性神经坏死病的防治提供一种可供选择的药物，同时为进一步探究白鲜碱抗神经坏死病毒作用靶点研究奠定了基础。
附图说明
图1为不同白鲜碱浓度下的GF-1细胞存活率变化图。
图2为不同白鲜碱浓度在GF-1细胞上对于衣壳蛋白的抑制率曲线图。
图3为PGNNV处理GF-1细胞后出现细胞病变效应（CPE）的显微结果图。
图4为不同时间点对应的NNV滴度变化图。
图5为腹腔注射不同剂量的白鲜碱后，石斑鱼在不同时间点的存活率变化图。
图6为对照组（注射等量L-15）、病毒感染组（注射PGNNV）、白鲜碱处理组（5mg/kg剂量）石斑鱼在不同时间点的存活率变化图。
图7为病毒感染组（注射PGNNV）和白鲜碱处理组（5mg/kg剂量）的衣壳蛋白相对表达量柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
斜带石斑鱼鳍条细胞系（GF-1）购于美国菌种保藏中心ATCC（American typeculture collection，ATCC），培养条件为含5%胎牛血清、1%双抗的L-15培养基。
珍珠龙胆石斑鱼神经坏死病毒（pearl gentian grouper nervous necrosisvirus，以下简写为PGNNV）由西北农林科技大学提供，在GF-1细胞中进行接种扩增，培养条件为含2%胎牛血清、1%双抗的L-15培养基，冻存于-80℃。
白鲜碱（Dictamnine），化学式C12H9NO2，又名4-甲氧基呋喃并[2，3-B]喹啉，分子量199.21，是一种天然活性分子，存在于白鲜皮等植物中。本发明所用白鲜碱购自上海麦克林生物试剂股份有限公司，货号为D873458-50mg。
实施例1
本实施例提供了使用CCK8试剂对GF-1细胞进行药物毒性检测实验。
实验方法：
提前12h将GF-1细胞进行铺板，按照8×104个/mL的密度将细胞种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养过夜。
显微镜观察细胞状态，确认细胞长至单层后，开始进行药物毒性测试。提前预热好细胞维持液，同时对生物安全柜进行30min紫外辐照，在生物安全柜中用细胞维持液稀释白鲜碱母液，稀释后白鲜碱浓度分别为204.74μM、100.40μM、25.10μM、12.55μM和6.27μM，并设置二甲基亚砜（DMSO）对照组、空白细胞对照组。
从细胞培养箱中取出96孔板，移除原有培养基，向96孔板中加入准备好的白鲜碱稀释液和DMSO稀释液，每个浓度设置6个复孔，并设置细胞空白对照组，向孔中加入细胞维持液，做好标记后，放入细胞培养箱中继续培养。
培养48h后，使用CCK8试剂对GF-1细胞进行药物毒性试验。在生物安全柜中用细胞维持液稀释CCK8试剂至浓度为5%，将96孔板置于阴暗处，向96孔板中加入稀释好的CCK8试剂，每孔加入100μL，用锡箔纸包好96孔板避光放入细胞培养箱中继续培养2h。
2h后从细胞培养箱中取出96孔板，使用酶标仪于450nm波长条件检测吸光值，根据检测情况计算药物半数毒性浓度（IC50值）和细胞存活率。各组的细胞存活率的计算方法为：
细胞存活率（%）=（加药组A450nm吸光值/细胞对照组A450nm吸光值）×100%
实验结果：
图1为不同白鲜碱浓度下的GF-1细胞存活率变化图。由图1可知，白鲜碱对GF-1细胞具有一定毒性，且随着药物浓度递增，细胞存活率呈下降趋势。白鲜碱作用于GF-1细胞48h，其CC20值为26.38μM，且当白鲜碱浓度为25.10μM时，细胞存活率达到90%。
实施例2
本实施例提供了利用RT-qPCR法检测白鲜碱抗PGNNV活性。
实验方法：
提前12h将GF-1细胞进行铺板，按照3.2×105个/mL的密度将细胞种于12孔板中，在细胞培养箱中培养过夜。
显微镜观察细胞状态，确认板内细胞汇合度达到100%时，开始进行RT-qPCR实验。提前用细胞维持液将白鲜碱母液稀释至25.10μM、12.55μM、6.27μM、3.14μM、1.57μM，并将其分别与稀释后的103×TCID50/0.1mL病毒液等体积混合，用移液枪吹打混匀后加入到细胞上。
28℃孵育48h后，离心收集细胞并加入1Ml Trizol溶液（RNA抽提试剂），用无菌枪头反复吹打直至离心管内无细胞沉淀。
加入0.2mL氯仿，盖紧管盖涡旋振荡30s，在室温下放置5min，12000×g、4℃离心15min，吸取上层水相。
将上层水相转移至新的无菌无酶离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，12000×g、4℃离心15min。
弃去上层液体，加入1mL的75%乙醇并颠倒漂洗RNA；7500×g、4℃离心15min。
弃去上清液，室温干燥RNA沉淀后，加入20μL无RNA酶的ddH2O溶解RNA；以溶解RNA的DEPC-H2O作为空白，利用核酸浓度测定仪检测RNA的纯度及浓度；RNA的完整性用甲醛变性的琼脂糖电泳检查，其中28S与18S条带的亮度比约为2:1。
反转录PCR使用Vazyme HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNAwiper）反转录试剂盒，得到cDNA。再以cDNA为模板，使用Vazyme AceQ® qPCR SYBR®Green Master Mix试剂盒进行RT-qPCR扩增。利用2-△△Ct法分析白鲜碱对衣壳蛋白（CP）的抑制率。
实验结果：
不同白鲜碱浓度在GF-1细胞上对于衣壳蛋白的抑制率曲线见图2所示。图2显示白鲜碱能显著抑制CP表达，且随着白鲜碱浓度的升高，其对CP抑制率呈现上升趋势，白鲜碱抑制CP的IC50值为8.64μM。
实施例3
本实施例利用镜检法检测白鲜碱抗PGNNV活性。
提前12h将GF-1细胞进行铺板，按照3.2×105个/mL的密度将细胞种于12孔板中，细胞培养箱中培养过夜。
显微镜观察细胞状态，确认板内细胞汇合度达到100%时，取细胞维持液将白鲜碱浓度稀释至25.10μM，并将其同稀释后的103×TCID50/0.1mL病毒液等体积混合，用1mL移液枪吹打混匀后加入到细胞上。
28℃孵育48h后，显微镜观察由PGNNV引起的细胞病变现象（CPE）并记录。
实验结果：
PGNNV处理GF-1细胞出现明显的CPE现象（如图3），具体表现为细胞出现大量孔洞、变大变圆、出现亮斑、细胞脱落漂浮在培养液中（见图3中圈出部分）。而白鲜碱处理组在病毒感染阶段一直能够维持细胞的正常形态，与对照组细胞状态无明显差异。
实施例4
本实施例提供了Reed-Muench法检测白鲜碱对PGNNV的滴度。
提前12h将GF-1细胞进行铺板，按照3.2×105个/mL的密度将细胞种于12孔板中，细胞培养箱中培养过夜。
显微镜观察细胞状态，确认板内细胞汇合度达到100%时，用不同浓度PGNNV液感染细胞2h。感染结束后将PGNNV液移除，用0.1M无菌PBS缓冲液清洗细胞3次。加入100μL用细胞维持液配置的白鲜碱（25.10μM）溶液继续孵育96h。
之后每24h记录各稀释度下的病变现象，根据Reed-Muench法计算半数细胞病变浓度（TCID50值）。图4为不同时间点对应的NNV滴度变化图。图4显示，在24h、48h、72h和96h时TCID50值对应的PGNNV滴度分别为103.75、105.29、106.49、108.01×TCID50/0.1mL，在经过白鲜碱处理后，分别降低至101.47、102.71、103.51、104.23×TCID50/0.1mL。
综合实施例2~4的实验结果，表明白鲜碱在GF-1细胞感染PGNNV后具有良好的抗PGNNV活性。
实施例5
本实施例提供了白鲜碱对石斑鱼安全剂量的获取。
将石斑鱼随机分组，每组40尾鱼，饲养在50L的水箱中，水温28℃，溶解氧水平>5mg/L。
将6种不同剂量（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、50mg/kg）的白鲜碱腹腔注射石斑鱼，每尾注射10μL，对照组注射等量L-15（含3%的DMSO）。
对白鲜碱的个体行为和死亡率进行为期7d的观察，确定白鲜碱在石斑鱼体内的安全剂量，本实施例将石斑鱼的存活率大于90%对应的白鲜碱注射量作为安全剂量。
实验结果：
图5为腹腔注射不同剂量的白鲜碱后，石斑鱼在不同时间点的存活率变化图。如图5所示，当注射白鲜碱的剂量为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、50mg/kg时，石斑鱼的存活率分别为90%、86.7%、80%、70%与23.3%，由此确定白鲜碱对于石斑鱼的安全剂量为5mg/kg。
实施例6
本实施例提供了白鲜碱对石斑鱼感染PGNNV后存活率的影响。
根据上述实验结果，选择103×TCID50NNV稀释石斑鱼感染，5mg/kg浓度的白鲜碱作为安全浓度。将石斑鱼随机分组，每组60尾鱼，饲养在50L的水箱中，水温28℃，溶解氧水平>5mg/L。
对照组注射L-15（含3%DMSO）10μL；病毒感染组注射103×TCID50PGNNV（含3%DMSO）10μL；白鲜碱治疗组注射103×TCID50PGNNV与5mg/kg白鲜碱混合液10μL。每隔24h观察并记录鱼的存活率，直至第7d。
实验结果：
图6为对照组（注射等量L-15）、病毒感染组（注射PGNNV）、白鲜碱处理组（5mg/kg剂量）石斑鱼在不同时间点的存活率变化图。如图6所示，PGNNV感染石斑鱼后，石斑鱼的存活率仅为6.7%，使用5mg/kg的白鲜碱治疗后，石斑鱼的最终存活率提高了20%，为26.7%。可见白鲜碱对PGNNV感染的石斑鱼具有治疗效果。
实施例7
本实施例提供了石斑鱼感染PGNNV后，白鲜碱对CP表达的影响。
选择103×TCID50PGNNV作为石斑鱼的病毒感染浓度；5mg/kg浓度的白鲜碱作为安全浓度。将石斑鱼随机分组，每组40尾鱼，饲养在50L的水箱中，水温28℃，溶解氧水平>5mg/L。
对照组注射L-15（含3%的DMSO）10μL，病毒感染组注射103×TCID50PGNNV（含3%DMSO）10μL；白鲜碱治疗组注射103×TCID50PGNNV与5mg/kg白鲜碱混合液10μL。
在腹腔注射病毒液后的第2天各自采集3只石斑鱼，经MS-222（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，鱼用麻醉剂）麻醉后，取脑组织研磨。
采用实施例2中相同的方法，提取RNA，并通过RT-qPCR法测试各处理组脑组织中PGNNV的表达量。
实验结果：
图7为病毒感染组（注射PGNNV）和白鲜碱处理组（5mg/kg剂量）的衣壳蛋白相对表达量柱状图。图7显示，通过检测石斑鱼脑部病毒量，白鲜碱处理组的CP表达量仅为病毒感染组的15.3%。表明白鲜碱在PGNNV感染早期具有显著抑制其在石斑鱼体内复制的能力。
本发明通过药物毒性实验、病毒滴度检测实验、RT-qPCR实验与病毒攻毒实验，验证了白鲜碱具有显著的抗NNV病毒活性，并在NNV感染的早期阶段发挥抗性作用，该研究成果为进一步研究白鲜碱抗NNV的靶点奠定了基础。
以上所述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (4)
1.白鲜碱在制备鱼类病毒性神经坏死病防治药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述白鲜碱具有抑制神经坏死病毒衣壳蛋白复制的活性。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，用神经坏死病毒感染斜带石斑鱼鳍条细胞系，所述白鲜碱具有抗斜带石斑鱼鳍条细胞系病变的作用。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在石斑鱼感染神经坏死病毒后，所述白鲜碱具有降低石斑鱼死亡率的作用。
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