CN110946866B - 达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种达匹维林的新用途，尤其是达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的药物中的应用。旨在寻找对病毒性出血性败血症病毒有抗病毒活性的药物，可用于病毒性出血性败血症病毒感染的治疗。本发明通过研究发现达匹维林(Dapivirine)具有抑制病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的功能，在治疗病毒性出血败血症方面具有很好的效果。即达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及达匹维林的新用途，尤其是达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的药物中的应用。
背景技术
病毒性出血性败血病(Viral hemorrhagic septicemia，VHS)是一种由病毒性出血性败血症病毒(VHSV)引起的烈性传染病，该病毒能够感染多种海洋和淡水鱼类，包括虹鳟、鲑鱼、大菱鲆等，引发严重的鱼类出血性败血症。VHS主要流行于欧洲，北美，日本及韩国，曾造成严重的经济损失，是出现疫情后必须向世界动物卫生组织汇报的水产疫病之一。
VHSV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)。弹状病毒呈子弹状，长度约170-180nm，宽度约60-70nm，含包膜。病毒基因组为负链ssRNA，大小约11kb，编码5种结构蛋白：核蛋白(nucleoprotein、N)、聚合酶相关磷蛋白(polymerase-associated phosphoprotein、P)、基质蛋白(matrix protein、M)、糖蛋白(glycoprotein、G)和RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP、L)；第六个基因位于G和L之间，编码与发病机制有关的非结构蛋白(Nv)。VHSV可根据N和G基因的差别分成4个地理亚型：I、II、III、IV。
达匹维林(Dapivirine，TCM120)是一种非核苷逆转录酶抑制剂(nonnucleosidereverse transcriptase inhibitor，NNRTIs)，别称为TMC120，化学式为C20H19N5，属于二芳基嘧啶化合物(DAPY)。达匹维林能够结合HIV逆转录酶的变构位点，使酶的构象改变而失活，从而抑制HIV-1的复制。目前，达匹维林主要作为杀微生物剂，被制成半固体凝胶、弹性硅胶两种剂型置于阴道环内，用于防止HIV的传播。达匹维林对包括A型和B型在内的多株流感病毒具有抗病毒活性，在感染初期抑制病毒核糖核蛋白进入细胞核，从而抑制病毒基因组的复制和蛋白合成。在肿瘤研究方面，达匹维林能够通过降低U87 GBM细胞对凋亡和自噬的抑制，导致JNK和PI3K/Akt通路的激活，来抑制胶质瘤细胞的活性。
目前，尚未有相关文献证实达匹维林具有抗VHSV活性。
发明内容
本发明旨在寻找对病毒性出血性败血症病毒有抗病毒活性的药物，可用于病毒性出血性败血症病毒感染的治疗。本发明通过研究发现达匹维林(Dapivirine)具有抑制病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的功能，在治疗病毒性出血败血症方面具有很好的效果。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的药物中的应用。
作为本发明的一个实施例，达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对FHM细胞感染的药物中的应用。体外细胞毒性实验结果表明，达匹维林对FHM细胞的半数致死浓度CC50是8.0μM，如图1所示；达匹维林对FHM细胞的保护实验结果表明，达匹维林的半数最大效应浓度EC50为0.91±0.05μM，如图2所示。
作为本发明的一个实施例，达匹维林在制备抑制鱼类VHSV病毒对细胞感染的药物中的应用。本发明检测了达匹维林的抗VHSV感染的能力，药物在病毒感染前加入细胞、药物与病毒共同加入细胞、药物在病毒感染后加入细胞和药物与病毒共同孵育后加入细胞，24小时和36小时后细胞病变效应(CPE)均显著减少，细胞内病毒核酸的复制均显著下降，如图3、4所示。
作为本发明的一个实施例，达匹维林在制备抑制鱼类VHSV病毒对FHM细胞感染的药物中的应用。本发明检测了达匹维林抗VHSV感染的过程。在VHSV感染前、吸附、内吞以及胞内复制过程中，加入达匹维林处理，均能够对一定时间后细胞内的病毒基因复制产生显著的抑制效果，如图5所示。
附图说明
图1为CCK-8试验检测达匹维林对FHM细胞的细胞毒作用研究结果图；
图2为CCK-8试验检测达匹维林在VHSV感染下对FHM细胞具有保护作用研究结果图；
图3为qRT-PCR检测达匹维林具有抗VHSV活性研究结果图；
图4为观察CPE检测达匹维林在病毒感染前加入具有抗VHSV活性研究结果图；
图5为qRT-PCR检测达匹维林对VHSV感染过程影响的研究结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明权利要求的任何限制。
实施例1细胞活性检测达匹维林对细胞的保护作用研究
1.细胞系和细胞培养
实验过程中所用的细胞系为FHM(Fathead minnow)，培养基为M199(10％FBS的培养液和2％FBS的维持培养液)，细胞培养于28℃恒温培养箱中。
2.细胞活力检测达匹维林对FHM的细胞毒性
Cell Counting Kit-8用于检测达匹维林对FHM的毒性。将处于对数增长期的FHM细胞制成悬液并以每孔100μl接种于96孔板中，于28℃下培养24h至80-90％的细胞覆盖密度，更换含有不同浓度(0.5、1、2、3、5、7、9、11μM)达匹维林的维持培养液，以0.05％的DMSO作为阴性对照并每组设置4个复孔，28℃下孵育48h。随后更换100μl新鲜的维持培养液，加入CCK-8溶液于28℃下孵育2h，测各孔在波长450nm处的吸光值，实验重复三次取平均值。计算每个孔的细胞存活率(细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔))，使用GraphPad Prism计算药物的半数致死浓度CC50。
如图1所示，实验条件下达匹维林的CC50为8.0μM，2μM达匹维林对细胞活性无明显影响。
3.细胞活力检测达匹维林对FHM的保护作用
Cell Counting Kit-8用于检测达匹维林处理下对病毒感染后的FHM细胞活性。将处于对数增长期的FHM细胞悬液以每孔100μl接种于96孔板中，于28℃下培养24h至80-90％的细胞覆盖密度，更换含有不同浓度(0.1、0.5、1、1.5、2μM)达匹维林和101.5TCID50的VHSV的维持培养液。以0.05％的DMSO作为阴性对照并每组设置4个复孔，28℃下孵育48h。随后更换100μl新鲜的维持培养液，加入CCK-8溶液于28℃下孵育2h，测各孔在波长450nm处的吸光值，实验重复三次取平均值。计算每个孔的细胞存活率(细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔))，使用GraphPad Prism计算药物的半数最大效应浓度EC50。
如图2所示，实验条件下达匹维林的EC50为0.91±0.05μM，1.5μM和2μM达匹维林完全抑制了VHSV对细胞活性的影响。
实施例2 qRT-PCR检测达匹维林的抗VHSV活性研究
1.药物处理
将处于对数增长期的FHM细胞制成悬液，以每孔1ml接种于12孔板中，于28℃下培养24h至80-90％的细胞覆盖密度，更换新鲜的维持培养液，随后以4种不同的药物处理方式检测达匹维林的抗VHSV能力。
(1)药物在病毒感染前加入细胞
向细胞维持培养液中加入浓度为2μM的达匹维林，在28℃下共同孵育4h，随后接种终浓度为101.5TCID50的VHSV，在28℃下共同孵育24h和36h后，使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％的DMSO作为阴性对照，8μM的病毒唑(Ribavirin)作为阳性对照。
(2)药物与病毒共同加入细胞
向细胞维持培养液中加入浓度为2μM的达匹维林与101.5TCID50的VHSV，在28℃下共同孵育24h和36h后，使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％的DMSO作为阴性对照，8μM的病毒唑作为阳性对照。
(3)药物在病毒感染后加入细胞
向细胞维持培养液中接种101.5TCID50的VHSV，在28℃下共同孵育4h，随后加入浓度为2μM的达匹维林，在28℃下共同孵育24h和36h后，使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％的DMSO作为阴性对照，8μM的病毒唑作为阳性对照。
(4)药物与病毒共同孵育后加入细胞
先制备达匹维林终浓度为58μM和101.5TCID50 VHSV的混合液，置于4℃下共同孵育4h。随后将混合液加入细胞维持培养液中，使达匹维林终浓度为2μM，VHSV为101.5TCID50。在28℃下共同孵育24h和36h后，使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％DMSO病毒孵育浓度作为阴性对照，0.44mM病毒唑的病毒孵育浓度作为阳性对照。
2.RNA提取
实验采用TriZol法提取细胞总RNA。将收集到的细胞悬液1300rmp室温离心3min，去上清，加入300μl TriZol溶液，室温放置5min；加入60μl氯仿，震荡混匀，室温放置10min，13000rmp下4℃离心15min；取上清于新无RNA酶离心管中，加入等量的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，13000rmp下4℃离心15min；去上清，加入700μl EDTA水配置的75％乙醇，7500rmp下4℃离心5min；去上清，室温晾干RNA沉淀10min；用8μl无核酸水溶解RNA沉淀，即得细胞总RNA。
3.cDNA合成
实验采用GoScriptTM反转录试剂盒进行RNA反转录。反应体系如下：先制备含4μlReaction Buffer和2μl Enzyme Mix的预混液，加入总量不超过5μg的RNA模板，用无核酸水补齐至20μl。逆转录反应程序如下：20μl反应体系在42℃反应20min；95℃反应5min，4℃保存，即得cDNA。
4.实时荧光定量PCR
实验采用Promega GoTaqTM qPCR试剂盒进行。反应体系如下：5μl qPCR Mix(2×)、0.5μl上游引物(10μM)、0.5μl下游引物(10μM)、1μl cDNA模板，加3μl水补足至10μl。实验检测的目标基因为VHSV，并以FHM的β-actin作为内参基因。所用的引物序列如下(均为5’-3’方向表示)：
VHSV-QPCR-F：AACTGTCTCCAAAGAAGTGTGT
VHSV-QPCR-R：GCCATCAAGGAGATAATGTG
FHMβ-actin-F：GCCGTGACCTGACTGACTACCT
FHMβ-actin-R：GGATACCGCAAGACTCCATACC
扩增反应条件为：95℃预变性10min；40个循环：95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸15sec。反应完成后，以阴性对照作为参照，使用2-△△Ct的方法计算实验组和阳性对照组VHSV基因的相对表达量。
如图3所示，在四种处理下达匹维林均表现出显著的抗VHSV效果，细胞内的病毒量均显著降低。
实施例3qRT-PCR检测达匹维林对VHSV感染过程的影响研究
1.药物处理
将处于对数增长期的FHM细胞制成悬液，以每孔1ml接种于12孔板中，于28℃下培养24h至80-90％的细胞覆盖密度，更换新鲜的维持培养液，随后进行4种不同的药物处理方式探究达匹维林对VHSV感染过程的影响。
(1)检测达匹维林预处理细胞对VHSV感染的影响
向维持培养液中加入终浓度为2μM的达匹维林，在28℃下孵育4h，随后弃去培养液，PBS洗3次；加入含101.8TCID50 VHSV的维持培养液，在28℃下孵育4h，随后弃去培养液，PBS洗3次，加入新鲜的维持培养液，在28℃下孵育20h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％的DMSO作为阴性对照，16μM的病毒唑作为对照。
(2)检测达匹维林对VHSV吸附的影响
先将FHM置于4℃中预冷10min，向维持培养液中加入终浓度为2μM的达匹维林和101.8TCID50 VHSV，4℃下共同孵育2h；随后弃去培养液，PBS洗3次，加入新鲜的维持培养液，在28℃下孵育22h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％的DMSO作为阴性对照，16μM的病毒唑作为对照。
(3)检测达匹维林对VHSV内吞的影响
先将FHM置于4℃中预冷10min，向维持培养液中加入101.8TCID50 VHSV，4℃下共同孵育2h；随后弃去培养液，PBS洗3次，加入含终浓度为2μM达匹维林的维持培养液，在28℃下孵育2h；弃去培养液，PBS洗3次，加入新鲜的维持培养液，在28℃下孵育20h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％的DMSO作为阴性对照，16μM的病毒唑作为对照。
(4)检测达匹维林对VHSV复制的影响
向维持培养液中加入101.8TCID50 VHSV，28℃下共同孵育4h；随后弃去培养液，PBS洗3次，加入含终浓度为2μM达匹维林的维持培养液，在28℃下孵育4h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞于无RNA酶离心管中。以0.05％的DMSO作为阴性对照，16μM的病毒唑作为对照。
2.RNA提取、cDNA合成、实时荧光定量PCR操作同实施例2。
如图5所示，在VHSV感染前、吸附、内吞以及胞内复制过程中，加入达匹维林处理，均能够对一定时间后细胞内的病毒基因表达量产生显著的抑制。
Claims (2)
1.达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对细胞感染的药物中的应用。
2.达匹维林在制备抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒对FHM细胞感染的药物中的应用。
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