CN115837025A

CN115837025A - 盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用

Info

Publication number: CN115837025A
Application number: CN202211632397.7A
Authority: CN
Inventors: 亓文宝; 朱君海; 黄丽红; 简伟俊; 陈画菡; 高飞
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-12-19
Filing date: 2022-12-19
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。本发明提供了盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。现有非洲猪瘟抗病毒药物大多为人工合成小分子化合物，成本较高，且仅在非洲猪瘟中被证明具有抗病毒功能。盐酸小檗胺作为小檗属植物中提纯的一种双苄基异喹啉生物碱，已在日本乙型脑炎病毒中被证明具有抗病毒功能，临床使用中具有作为非洲猪瘟和日本乙型脑炎病毒的双重防治药物的潜质。本发明发现，盐酸小檗胺对ASFV在猪原代巨噬细胞(PAM)上具有显著的抑制作用，对病毒在PAM细胞上的病毒复制、感染性病毒粒子产出和病毒蛋白的表达均有显著抑制作用。

Description

盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)引起的一种急性、高致死性传染病。目前尚无有效的疫苗和药物用于该病的防控。主要防制手段还是依靠严格的生物安全防控措施和扑杀感染猪只，不仅为养猪业造成重大的负担，更无法满足我国生猪产业的规模化发展。因此，如何科学有效的防控ASF疫情，对我国乃至世界养猪业都具有重大的意义。

小檗胺是从我国中药小檗属植物中提纯的一种双苄基异喹啉生物碱，目前小檗胺在临床医学上已用于化疗、放疗及慢性苯中毒后期治疗，具有抗肿瘤、控血压、再生坏死组织等功能。

目前非洲猪瘟商无商品化的疫苗与抗病毒药物，非瘟疫情的防控主要依靠严格的生物安全手段与感染猪的扑杀，极大阻碍了中国养猪业的发展。

因此，急需一种成本低、效果好的非洲猪瘟疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。现有非洲猪瘟抗病毒药物大多为人工合成小分子化合物，成本较高，且仅在非洲猪瘟中被证明具有抗病毒功能。盐酸小檗胺作为小檗属植物中提纯的一种双苄基异喹啉生物碱，已在日本乙型脑炎病毒中被证明具有抗病毒功能，临床使用中具有作为非洲猪瘟和日本乙型脑炎病毒的双重防治药物的潜质。本发明发现，盐酸小檗胺对ASFV在猪原代巨噬细胞(PAM)上具有显著的抑制作用，对病毒在PAM细胞上的病毒复制、感染性病毒粒子产出和病毒蛋白的表达均有显著抑制作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的毒性。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的复制。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的蛋白表达。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的感染性病毒粒子的产出。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的给予剂量为5μM。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的浓度为0～20μM。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的给予方式包括：舌下含化、口服、肌肉注射或静脉注射中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的辅料包括：螯合剂、保护剂、表面活性剂、赋形剂或稳定剂中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的剂型包括：片剂、胶囊或颗粒中的一种或多种。

现有非洲猪瘟抗病毒药物大多为人工合成小分子化合物，成本较高，且仅在非洲猪瘟中被证明具有抗病毒功能。盐酸小檗胺作为小檗属植物中提纯的一种双苄基异喹啉生物碱，已在日本乙型脑炎病毒中被证明具有抗病毒功能，临床使用中具有作为非洲猪瘟和日本乙型脑炎病毒的双重防治药物的潜质。本发明发现，盐酸小檗胺对ASFV在猪原代巨噬细胞(PAM)上具有显著的抑制作用，对病毒在PAM细胞上的病毒复制、感染性病毒粒子产出和病毒蛋白的表达均有显著抑制作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示运用MTT试剂盒测定盐酸小檗胺对PAM细胞的毒性实验结果；

图2示运用反转录荧光定量PCR测定不同浓度的盐酸小檗胺处理PAM细胞后ASFVB646L基因和CP204L基因的拷贝数结果；

图3示运用Western Blot检测不同浓度的盐酸小檗胺处理PAM细胞后ASFVp30和p72蛋白表达的结果；

图4示不同浓度的盐酸小檗胺处理PAM细胞后培养上清中ASFV子代病毒滴度(TCID50)的测定结果；

图5示5μM浓度的盐酸小檗胺在预防给药、共同给药和治疗给药下对ASFV B646L基因和CP204L基因相对表达量的测定结果。

具体实施方式

本发明公开了盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明实施例1～实施例5中，盐酸小檗胺的配制：盐酸小檗胺购于上海麦克林生化科技有限公司(货号B860680，CAS no.6078-17-7)。将盐酸小檗胺溶解于DMSO，配制为50mM，使用时再用含10％FBS的细胞培养基RPMI-1640倍比稀释，分装后贮存于-20℃备用。

本发明实施例1～实施例5中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1盐酸小檗胺对PAM细胞的细胞毒性

盐酸小檗胺对PAM细胞的细胞毒性

将PAM细胞以1×10⁵个每孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，弃去板中的培养液，用10％FBS的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/mL，链霉素50μg/mL)将盐酸小檗胺稀释到0、1、5、10、20、40、60、80和100μM，100μL/孔，设置空白细胞对照组，每个浓度做6个复孔，在37℃、5％CO₂培养箱培养48h后，弃掉上清液，加入MTT试剂，100μL/孔，继续避光培养4h后，弃掉上清液，加入150μL/孔的DMSO，避光低速震荡10min，使用酶标仪在参考波长490nm处读取每个孔的吸光度。

结果如图1和表1所示，盐酸小檗胺对PAM细胞的细胞毒性较小，在20μM以下的浓度细胞存活率超过70％。

表1

表1对应图1的数据。

实施例2不同浓度的盐酸小檗胺对PAM细胞中ASFV B646L基因复制的影响

将PAM细胞以5×10⁵个每孔接种于24孔板中，待细胞贴壁后，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM盐酸小檗胺的10％FBS RPMI-1640，在37℃、5％CO₂培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度盐酸小檗胺的10％FBS RPMI-1640继续孵育24h。24h后，将细胞于-80℃和室温反复冻融三次后，收集细胞悬液。

用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒(飞捷生物公司)按照说明书步骤，抽提细胞悬液中的ASFV的基因组，使用OIE推荐的ASFV B646L和CP204L基因引物，采用SYBR GreenI为荧光染料，进行荧光定量PCR试验，检测ASFVB646L和CP204L基因的相对表达量。

反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。实验结果如图2和表2所示，与对照组相比，与对照组相比，盐酸小檗胺在0.3μM时，显著抑制了ASFV CP204L基因的转录水平，在5μM浓度下ASFV B646L和ASFVCP204L基因的相对表达量几乎被完全抑制。表明盐酸小檗胺有抑制ASFV基因复制的作用。

表2

表2对应图2的数据。

实施例3不同浓度的盐酸小檗胺对PAM细胞中ASFV p30和p72蛋白表达的影响

PAM细胞以1×10⁶个每孔接种于12孔板中，待细胞贴壁后，弃去板中的培养液，换为含0、1、5、10、20μM盐酸小檗胺的10％FBS RPMI-1640，在37℃、5％CO₂培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度盐酸小檗胺的10％FBS RPMI-1640继续孵育24h。24h后，弃去细胞上清，收集细胞培养物，提取总蛋白，用western blot方法检测p30和p72蛋白表达差异。

实验结果如图3所示，与未感染组相比，感染对照组与1μM盐酸小檗胺实验组ASFVp30和p72蛋白表达显著增加。然而与感染对照组相比，盐酸小檗胺在5μM的浓度以上时ASFVp30和p72蛋白的表达被完全抑制。表明盐酸小檗胺有抑制ASFV病毒蛋白表达的作用。

实施例4不同浓度的盐酸小檗胺对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响

将PAM细胞以3×10⁵个每孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM盐酸小檗胺的10％FBS RPMI-1640，在37℃、5％CO₂培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度盐酸小檗胺的10％FBS RPMI-1640继续孵育24h。24h后，收集细胞上清，取100μL上清液用10％FBS的RPMI-1640培养基10倍倍比稀释，加入已贴壁的PAM细胞中，100μL/孔，每个浓度设置8个重复，并且设置细胞空白对照，感染24h后进行间接免疫荧光实验，观察记录每孔中p30蛋白的免疫荧光阳性率。用Reed-Muench法计算出各试验组细胞培养液中的病毒滴度(TCID₅₀)值。

实验结果如图4和表3所示，盐酸小檗胺在0～5μM浓度下对ASFV感染性病毒粒子的产出呈浓度依赖性的抑制，在1μM浓度时ASFV病毒滴度显著下降。表明盐酸小檗胺有抑制ASFV感染性病毒粒子产出的作用。

表3

药物浓度(μM)	Log10病毒滴度Mean±SD
		0	5.023±0.3060
0.3	4.623±0.1570
		0.6	4.323±0.4611
1	3.467±0.1234
		5	0.880±0.0866

表3对应图4的数据。

实施例5盐酸小檗胺在预防给药、共同给药和治疗给药下对ASFV感染的抑制作用

将PAM细胞以5×10⁵个每孔接种于24孔板中，待细胞贴壁后，弃去板中的培养液，换为5μM浓度的盐酸小檗胺孵育细胞4h，之后弃液，PBS润洗3次后感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换10％FBS RPMI-1640继续孵育为预防组；细胞贴壁后，感染含5μM浓度的盐酸小檗胺的MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换10％FBS RPMI-1640继续孵育为共同给药组；细胞贴壁后，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换含5μM浓度的盐酸小檗胺的10％FBS RPMI-1640继续孵育为治疗组；在感染前4h至感染后24h均存在5μM浓度的盐酸小檗胺为加药组；无盐酸小檗胺添加为对照组。所有实验组在病毒感染24h后，用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒(飞捷生物公司)按照说明书步骤，抽提细胞中的ASFV的总RNA，采用SYBR GreenI为荧光染料，进行荧光定量PCR试验，检测ASFV B646L基因和CP204L基因的相对表达量。

反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。

如图5和表4所示，与对照组相比，加药组，共同加药组，治疗组与预防组均显著抑制了ASFV B646L基因和CP204L基因的相对表达量。

表4

表4对应图5的数据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.盐酸小檗胺在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的毒性。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的复制。

4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的蛋白表达。

5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述盐酸小檗胺抑制非洲猪瘟病毒的感染性病毒粒子的产出。

6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的有效使用浓度为5～20μΜ。

7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给予方式包括：舌下含化、口服、肌肉注射或静脉注射中的一种或多种。

8.如权利要求1至7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的辅料包括：螯合剂、保护剂、表面活性剂、赋形剂或稳定剂中的一种或多种。

9.如权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：片剂、胶囊或颗粒中的一种或多种。