CN115770245A - 双苄基异喹啉生物碱在制备防治非洲猪瘟病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及双苄基异喹啉生物碱在制备防治非洲猪瘟病毒药物中的应用。本发明提供了具有双苄基异喹啉结构的生物碱在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。现有非洲猪瘟抗病毒药物大多为人工合成小分子化合物，成本较高。本发明双苄基异喹啉生物碱(异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素、防己诺林碱)药效较好，安全浓度高，可抑制非洲猪瘟病毒基因复制、蛋白表达、病毒粒子产出。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及双苄基异喹啉生物碱在制备防治非洲猪瘟病毒药物中的应用。
背景技术
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)最早于1921年在肯尼亚被发现，2007年扩散、爆发于多个欧洲国家。我国于2018年首次报道该病，随后ASF并迅速流行、爆发于我国各个地区，严重威胁着我国生猪养殖业的发展。ASF是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一种急、烈性传染性疾病，传染力高，病程短，病死率可高达100％。主要临床症状表现为发热、胃肠黏膜出血、食欲不振、皮肤发绀等。ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，目前有8个血清群和24个基因型，是唯一的大型虫媒DNA病毒，其基因组大小约为170～190kb，含151～167个开放阅读框(openreadingframes,ORFs)，不同毒株之间因病毒编码的多基因家族(multigenefamilies,MGF)的开放阅读框的获得或缺失而导致基因组存在较大差异。ASFV有囊膜，病毒粒子呈二十面对称体，直径为175～215nm。
目前还没有安全、有效的药物来预防和治疗ASF，同时也没有成熟的疫苗来免疫接种，主要的防制手段仍是预防为主的综合防治措施，确有感染便立即封锁隔离和扑杀猪只，这不仅对养殖户乃至整个养猪业造成重大的经济损失，更无法满足我国生猪产业的规模化发展，威胁着我国的猪肉供给。因此，如果能够合理有效的治疗患病猪只、抑制猪只感染，将对我国养猪业带来显著的积极意义、极大的降低扑杀措施造成的巨大经济损失。
现有非洲猪瘟抗病毒药物大多为人工合成小分子化合物，成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了双苄基异喹啉生物碱在制备防治非洲猪瘟病毒药物中的应用。本发明提供了具有双苄基异喹啉结构的生物碱在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。本发明通过实验发现双苄基异喹啉生物碱(异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素、防己诺林碱)药效较好，安全浓度高，可抑制非洲猪瘟病毒基因复制、蛋白表达、病毒粒子产出。。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了具有双苄基异喹啉结构的生物碱在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述具有双苄基异喹啉结构的生物碱包括以下任意项：
(I)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中的一种或多种；和/或
(II)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的衍生物；和/或
(III)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种药学上可接受的盐；和/或
(IV)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的前药或药物中间体。
在本发明的一些实施方案中，如下任意项在猪原代巨噬细胞上具有显著的抑制作用：
(I)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中的一种或多种；和/或
(II)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的衍生物；和/或
(III)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种药学上可接受的盐；和/或
(IV)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的前药或药物中间体。
在本发明的一些实施方案中，所述预防和/或治疗非洲猪瘟包括如下任意项：
(I)、抑制病毒复制；和/或
(II)、抑制感染性病毒粒子产出；和/或
(III)、抑制病毒蛋白的表达。
在本发明的一些实施方案中，所述抑制病毒复制包括抑制非洲猪瘟病毒B646L基因和/或非洲猪瘟病毒CP204L基因的转录。
在本发明的一些实施方案中，所述抑制病毒蛋白的表达包括抑制非洲猪瘟病毒p30蛋白和/或非洲猪瘟病毒p72蛋白的表达。
在本发明的一些实施方案中，所述药物的有效浓度包括(0.3～5μM)/5×105个细胞。
在本发明的一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方案中，所述药物的给予方式包括：舌下含化、口服、肌肉注射或静脉注射中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述药物的剂型包括：片剂、胶囊或颗粒中的一种或多种。
本发明提供了具有双苄基异喹啉结构的生物碱在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。本发明使用双苄基异喹啉生物碱处理PAM细胞，并考察其对PAM细胞的细胞毒性的影响，以及对非洲猪瘟病毒基因复制、蛋白表达、病毒粒子产出的影响。结果表明，双苄基异喹啉生物碱(异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素、防己诺林碱)药效较好，安全浓度高，可抑制非洲猪瘟病毒基因复制、蛋白表达、病毒粒子产出。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示异粉防己碱对PAM细胞的抑制活性；
图2示异粉防己碱对PAM细胞中ASFVB646L基因和ASFVCP204L基因复制的影响；
图3示异粉防己碱对PAM细胞中ASFVp72和p30蛋白表达水平的影响；
图4示异粉防己碱对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响；
图5示异粉防己碱在不同给药方式下对ASFV感染的抑制作用。
图6示汉防己甲素对PAM细胞的细胞毒性作用；
图7示汉防己甲素对PAM细胞中ASFVB646L、CP204L基因复制的影响；
图8示汉防己甲素对PAM细胞中ASFVp30、p72蛋白表达的影响；
图9示汉防己甲素对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响。
图10示千金藤素对PAM细胞活力的影响；
图11示千金藤素对PAM细胞的细胞毒性；
图12示千金藤素对PAM细胞中ASFVB646L基因和ASFVCP204L基因复制的影响；
图13示千金藤素对PAM细胞中ASFVp72和p30蛋白表达水平的影响；
图14示千金藤素对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响；
图15示ASFV所感染的PAM细胞在不同时间加入或去除千金藤素对ASFV复制的影响。
图16示防己诺林碱对PAM细胞的细胞毒性作用；
图17示防己诺林碱对PAM细胞中ASFVB646L基因与CP204L基因转录的影响；
图18示防己诺林碱对PAM细胞中ASFVp30、p72蛋白表达的影响；
图19示防己诺林碱对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响。
具体实施方式
本发明公开了一种双苄基异喹啉生物碱在制备防治非洲猪瘟病毒药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
异粉防己碱(Isotetrandrine)是一种来源于防己科植物的双苄基异喹啉生物碱，双苄基异喹啉生物碱已被运用于抗炎，抗菌以及抗肿瘤中，异粉防己碱对ASFV的抗病毒活性尚未有报道。
汉防己甲素(Tetrandrine)又名粉防己碱，是一种具有双苄基异喹啉结构的生物碱，主要存在于防己科千金藤属植物粉防己的根块中，其主要应用在治疗人的心血管系统、呼吸系统、免疫系统、消化系统疾病以及抗癌方面，目前暂未有报道将其作为抗病毒药物用于治疗动物疾病。
千金藤素(Cepharanthine)是一种能够从中草药中分离出的双苄基异喹啉生物碱。早在1951年就一直在日本被批准为应用于多种急性和慢性疾病的药物，包括治疗辐射诱导的白细胞减少症、头皮糠疹脱发、疟疾和毒蛇咬伤。其提取方式经过人们长时间的不断研发和改进，已经非常成熟便捷，这也极大的降低了使用千金藤素的经济成本。千金藤素作为植物天然产物，在亚洲地区资源非常丰富，它是安全的、耐受性良好并且产生的不良反应十分有限，副作用可以忽略不计。它的两个头对头连接的苄基异喹啉化学结构使其呈椭圆形大环结构，并赋予其独特的化学性质：例如其乙醚溶解性(可作良好的溶剂)、光学活性和降低各种生物膜流动性的能力。目前并未报道有千金藤素作为治疗和预防ASF药物的相关研究，千金藤素具有成为ASFV候选抗病毒药物的潜力有待确定。
防己诺林碱(Fangchinoline)作为防己科植物粉防己中提纯的一种双苄基异喹啉生物碱，成本较低且易于获取，已在抗炎，抗肿瘤等方面被证实具有显著疗效，防己诺林碱对ASFV的抗病毒活性尚未有报道。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
使用双苄基异喹啉生物碱处理PAM细胞，并考察其对PAM细胞的细胞毒性的影响，以及对非洲猪瘟病毒基因复制、蛋白表达、病毒粒子产出的影响。结果表明，双苄基异喹啉生物碱(异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素、防己诺林碱)药效较好，安全浓度高，可抑制非洲猪瘟病毒基因复制、蛋白表达、病毒粒子产出。
本发明使用OIE推荐的ASFVB646L(上游引物：SEQ ID NO:1，CCCAGGRGATAAAATGACTG；下游引物：SEQ ID NO:2，CACTRGTTCCCTCCACCGATA)和CP204L(上游引物：SEQ ID NO:3，GAGGAGACGGAATCCTCAGC；下游引物：SEQ ID NO:4，GCAAGCATATACAGCTTGGAGT)基因引物，内参基因为GAPDH(上游引物：SEQ ID NO:5，GAAGGTCGGAGTGAACGGATTT；下游引物：SEQ IDNO:6，TGGGTGGAATCATACTGGAACA)。
如无特殊说明，本发明提供的双苄基异喹啉生物碱在制备防治非洲猪瘟病毒药物中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1异粉防己碱对PAM细胞的细胞毒性
一、实验方法
1、异粉防己碱的配制
异粉防己碱购于MCE(MedChemExpress)公司(货号：HY-N6045，Casno.477-57-6)，将异粉防己碱溶解于DMSO，配制为10mM，分装后贮存于-80℃备用，使用时再用含10％FBS的细胞培养基RPMI-1640稀释。
2、异粉防己碱对PAM细胞的细胞毒性
将PAM细胞以1×105个每孔接种于96孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，用10％FBS的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/mL，链霉素50μg/mL)将异粉防己碱稀释到0、1、5、10、20、40、60、80和100μM，100μL/孔，设置空白细胞对照组，每个浓度做6个复孔，在37℃、5％CO2培养箱培养24h后，弃掉上清液，加入MTT试剂，100μL/孔，继续避光培养4h后，弃掉上清液，加入150μL/孔的DMSO，避光低速震荡10分钟，使用酶标仪在参考波长490nm处读取每个孔的吸光度。
二、实验结果
结果如图1所示，异粉防己碱对PAM细胞的半数抑制浓度(CC50)为14.37μM。
实施例2不同浓度的异粉防己碱对PAM细胞中ASFVB646L基因和ASFV CP204L基因复制的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM异粉防己碱的10％FBSRP MI-1640共1mL，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度异粉防己碱的10％FBSRPMI-1640继续孵育24h。24h后，将细胞于-80℃和室温反复冻融三次后，收集细胞悬液。用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒(飞捷生物公司)按照说明书步骤，抽提细胞悬液中的ASFV的基因组，使用OIE推荐的ASF VB646L(上游引物：SEQ ID NO:1，CCCAGGRGATAAAATGACTG；下游引物：SEQ ID NO:2，CACTRGTTCCCTCCACCGATA)和CP204L(上游引物：SEQ ID NO:3，GAGGAGACGGAATCCTCAGC；下游引物：SEQ ID NO:4，GCAAGCATATACAGCTTGGAGT)基因引物，采用SYBR Green I为荧光染料，进行荧光定量PCR试验，检测ASFV B646L和CP204L基因的相对表达量，内参基因为GAPDH(上游引物：SEQ ID NO:5，GAAGGTCGGAGTGAACGGATTT；下游引物：SEQ ID NO:6，TGGGTGGAATCATACTGGAACA)。
反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。
二、实验结果
如图2所示，与对照组相比，异粉防己碱在0～5μM浓度下，呈浓度依赖性的抑制了ASFVB646L和CP204L基因的转录水平，在0.6μM浓度下ASFV B646L和CP204L基因的转录水平几乎被完全抑制。表明异粉防己碱有抑制ASFV基因转录的作用。
实施例3不同浓度的异粉防己碱对PAM细胞中ASFVp72和p30蛋白表达水平的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含0、0.3、0.6、1μM异粉防己碱的10％FBSRPMI-1640共1mL继续孵育24h。24h后，弃去细胞上清，收集细胞培养物，提取总蛋白，用westernblot方法检测ASFV早期表达蛋白p30蛋白，晚期表达蛋白p72蛋白和内参蛋白GAPDH的表达差异。
二、实验结果
如图3所示，与未感染组相比，感染对照组与异粉防己碱实验组ASFV p72和p30蛋白表达显著增加。然而与感染对照组相比，异粉防己碱在0～1μM的浓度下对ASFV p72和p30蛋白的表达呈浓度依赖性的抑制。表明异粉防己碱有抑制ASFV病毒蛋白表达的作用。
实施例4不同浓度的异粉防己碱对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM异粉防己碱的10％FBS RPMI-1640共1mL，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度异粉防己碱的10％FBS RPMI-1640继续孵育24h。24h后，收集细胞上清，取100μL上清液用10％FBS的RPMI-1640培养基10倍倍比稀释，加入已贴壁的PAM细胞中，100μL/孔，每个浓度设置8个重复，并且设置细胞空白对照，感染24h后进行间接免疫荧光实验，观察记录每孔中p30蛋白的免疫荧光阳性率。用Reed-Muench法计算出各试验组细胞培养液中的病毒滴度(TCID50)值。
二、实验结果
如图4所示，异粉防己碱在0～5μM浓度下对ASFV感染性病毒粒子的产出呈浓度依赖性的抑制，在0.6μM以上浓度时ASFV病毒滴度显著下降(P＜0.01)。表明异粉防己碱有抑制ASFV感染性病毒粒子产出的作用。
实施例5异粉防己碱在预防给药、共同给药和治疗给药下对ASFV感染的抑制作用
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为5μM浓度的异粉防己碱孵育细胞4h共1mL，之后弃液，PBS润洗3次后感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换10％FBSRPMI-1640继续孵育为预防组；细胞贴壁后，感染含5μM浓度的异粉防己碱的MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换10％FBS RPMI-1640继续孵育为共同加药组；细胞贴壁后，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换含5μM浓度的异粉防己碱的10％FBS RPMI-1640继续孵育为治疗组；在感染前4h至感染后24h均存在5μM浓度的异粉防己碱为加药组；无异粉防己碱添加为对照组。所有实验组在病毒感染24h后，用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒(飞捷生物公司)按照说明书步骤，抽提细胞中的ASFV的总RNA，采用SYBR Green I为荧光染料，进行荧光定量PCR试验，检测ASVB646L基因和CP204L基因的相对表达量，内参设置为GAPDH。
反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。
二、实验结果
如图5所示，与对照组相比，加药组，共同加药组，治疗组与预防组均显著抑制了ASFV，其中治疗组与预防组对ASFV的抑制程度与加药组相近，表明异粉防己碱在对ASFV的预防及治疗给药均有良好效果。
实施例6汉防己甲素对PAM细胞的细胞毒性
一、实验方法
1、汉防己甲素的配制
汉防己甲素购于Selleckchem公司(货号S2403，CASno.518-34-3)。将汉防己甲素溶解于DMSO，配制为10mM，分装后贮存于-80℃备用，使用时再用含10％FBS的细胞培养基RPMI-1640稀释。
2、汉防己甲素对PAM细胞的细胞毒性
将PAM细胞以1×105个每孔接种于96孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，用10％FBS的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/mL，链霉素50μg/mL)将汉防己甲素稀释到0、1、5、10、20、40、60、80和100μM，100μL/孔，设置空白细胞对照组，每个浓度做6个复孔，在37℃、5％CO2培养箱培养48h后，弃掉上清液，加入MTT试剂，100μL/孔，继续避光培养4h后，弃掉上清液，加入150μL/孔的DMSO，避光低速震荡10分钟，使用酶标仪在参考波长490nm处读取每个孔的吸光度。
二、实验结果
结果如图6所示，汉防己甲素对PAM细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)为36.02μM，表明汉防己甲素对PAM细胞的细胞毒性较小。
实施例7不同浓度的汉防己甲素对PAM细胞中ASFVB646L、CP204L基因复制的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM汉防己甲素的10％FBS RPMI-1640共1mL，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度汉防己甲素的10％FBS RPMI-1640继续孵育24h。24h后用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒(上海飞捷公司)按照说明书步骤，抽提细胞中的总RNA，使用ASFV B646L基因与CP204L基因和内参基因GAPDH的特异性引物，采用SYBR Green I为荧光染料，进行相对荧光定量PCR试验，检测ASVB646L基因和CP204L基因的相对表达量。
反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。
二、实验结果
如图7所示，与对照组相比，汉防己甲素在0～5μM浓度下，呈浓度依赖性的抑制了ASFV B646L和CP204L基因的转录水平，在5μM浓度下ASFV B646L和CP204L基因的转录水平几乎被完全抑制。表明汉防己甲素有抑制ASFV基因转录的作用。
实施例8不同浓度的汉防己甲素对PAM细胞中ASFV p30、p72蛋白表达的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM汉防己甲素的10％FBS RPMI-1640共1mL，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度汉防己甲素的10％FBS RPMI-1640继续孵育24h。24h后，弃去细胞上清，收集细胞培养物，提取总蛋白，用western blot方法检测ASFV早期表达蛋白p30蛋白，晚期表达蛋白p72蛋白和内参蛋白GAPDH的表达差异。
二、实验结果
如图8所示，与未感染组相比，感染对照组与1μM汉防己甲素实验组ASFVp30蛋白表达显著增加。然而与感染对照组相比，汉防己甲素在5μM的浓度时ASFVp30蛋白和p72蛋白的表达被完全抑制。表明汉防己甲素有抑制ASFV病毒蛋白表达的作用。
实施例9不同浓度的汉防己甲素对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM汉防己甲素的10％FBS RPMI-1640共1mL，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度汉防己甲素的10％FBS RPMI-1640继续孵育24h。24h后收集细胞上清，取100μL上清液用10％FBS的1640培养基10倍比稀释，加入已贴壁的PAM细胞中，100μL/孔，每个浓度设置8个重复，感染24h后进行间接免疫荧光实验，观察记录每孔中p30蛋白的免疫荧光阳性率。用Reed-Muench法计算出各试验组细胞培养液中的病毒滴度(TCID50)值。
二、实验结果
如图9所示，汉防己甲素在0～5μM浓度下对ASFV感染性病毒粒子的产出呈浓度依赖性的抑制，在5μM浓度时检测不到针对病毒p30蛋白的免疫阳性荧光。表明汉防己甲素有抑制ASFV感染性病毒粒子产出的作用。
实施例10千金藤素对PAM细胞的细胞毒性
一、实验方法
1、千金藤素的配制
千金藤素购于Selleckchem公司(货号S4238，CAS no.481-49-2)。将千金藤素溶解于DMSO，配制为50mM，分装后贮存于-80℃备用，使用时再用含10％FBS的细胞培养基RPMI-1640稀释。
2、千金藤素对PAM细胞的细胞毒性
将PAM细胞以1×105个每孔接种于96孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，用10％FBS的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/mL，链霉素50μg/mL)将千金藤素稀释到0、1、5、10、20、40、60、80和100μM，100μL/孔，设置空白细胞对照组，每个浓度做6个复孔，在37℃、5％CO2培养箱培养24h后，弃掉上清液，加入MTT试剂，100μL/孔，继续避光培养4h后，弃掉上清液，加入150μL/孔的DMSO，避光低速震荡10分钟，使用酶标仪在参考波长490nm处读取每个孔的吸光度。
二、实验结果
结果如图10所示，千金藤素对PAM细胞的细胞毒性较小，在20μM以下的浓度细胞存活率超过70％。如图11所示，千金藤素的CC50＝39.98μM，表明千金藤素药效较好，安全浓度高。
实施例11不同浓度的千金藤素对PAM细胞中ASFV B646L基因和ASFV CP204L基因复制的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM千金藤素的10％FBS RPMI-1640，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度千金藤素的10％FBS RPMI-1640共1mL继续孵育24h。24h后，将细胞于-80℃和室温反复冻融三次后，收集细胞悬液。
用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒(飞捷生物公司)按照说明书步骤，抽提细胞悬液中的ASFV的基因组，使用OIE推荐的ASFVB646L(上游引物：SEQ ID NO:1，CCCAGGRGATAAAATGACTG；下游引物：SEQ ID NO:2，CACTRGTTCCCTCCACCGATA)和CP204L(上游引物：SEQ ID NO:3，GAGGAGACGGAATCCTCAGC；下游引物：SEQ ID NO:4，GCAAGCATATACAGCTTGGAGT)基因引物，采用SYBR Green I为荧光染料，进行荧光定量PCR试验，检测ASFV B646L和CP204L基因的拷贝数。
反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。
二、实验结果
如图12所示，与对照组相比，千金藤素在0.3μM时，显著抑制了ASFV B646L和ASFVCP204L的复制，在5μM浓度下ASFV B646L和ASFV CP204L的复制几乎被完全抑制。表明千金藤素有抑制ASFV基因复制的作用。
实施例12不同浓度的千金藤素对PAM细胞中ASFV p72和p30蛋白表达水平的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM千金藤素的10％FBSRPMI-1640继续孵育24h共1mL。24h后，弃去细胞上清，收集细胞培养物，提取总蛋白，用westernblot方法检测ASFV早期表达蛋白p30蛋白，晚期表达蛋白p72蛋白和内参蛋白GAPDH的表达差异。
二、实验结果
如图13所示，与未感染组相比，感染对照组与0.3μM和0.6μM的千金藤素实验组ASFVp72和p30蛋白表达显著增加。然而与感染对照组相比，千金藤素在1μM的浓度以上时ASFVp72和p30蛋白的表达被完全抑制。表明千金藤素有抑制ASFV病毒蛋白表达的作用。
实施例13不同浓度的千金藤素对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM千金藤素的10％FBSRPMI-1640，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度千金藤素的10％FBSRPMI-1640继续孵育24h共1mL。24h后，收集细胞上清，取100μL上清液用10％FBS的1640培养基10倍倍比稀释，加入已贴壁的PAM细胞中，100μL/孔，每个浓度设置8个重复，并且设置细胞空白对照，感染24h后进行间接免疫荧光实验，观察记录每孔中p30蛋白的免疫荧光阳性率。用Reed-Muench法计算出各试验组细胞培养液中的病毒滴度(TCID50)值。
二、实验结果
如图14所示，千金藤素在1～5μM浓度下对ASFV感染性病毒粒子的产出呈浓度依赖性的抑制，在5μM浓度时检测不到针对病毒p30蛋白的免疫阳性荧光。表明千金藤素有抑制ASFV感染性病毒粒子产出的作用。
实施例14ASFV所感染的PAM细胞在不同时间加入或去除药物对ASFV复制的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换10％FBS RPMI-1640继续孵育。addition组分别于0、3、6、9、12、15h换为含10μM千金藤素的10％FBSRPMI-1640持续孵育至24h共1mL；elimination组弃去病毒液后加入含10μM千金藤素的10％FBSRPMI-1640，分别于0、3、6、9、12、15h换为10％FBSRPMI-1640持续孵育至24h。24h后，将细胞于-80℃和室温反复冻融三次后，收集细胞悬液。
用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒(飞捷生物公司)按照说明书步骤，抽提细胞中的ASFV的总RNA，使用OIE推荐的ASFVB646L基因引物(上游引物：SEQ ID NO:1，CCCAGGRGATAAAATGACTG；下游引物：SEQ ID NO:2，CACTRGTTCCCTCCACCGATA)，采用SYBRGreenI为荧光染料，进行荧光定量PCR试验，检测ASVB646L基因的拷贝数。
反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。
二、实验结果
如图15所示，与对照组相比，使用10μM千金藤素在病毒感染后3h添加显著抑制了ASFVB646L的复制(P＜0.5)，在病毒感染后3h消除极显著抑制了ASFVB646L的复制(P＜0.01)，并在3h后各组之间病毒B646L基因复制情况无明显差异，表明千金藤素在ASFV感染早期以及任何时段均有良好的抗病毒效果。
实施例15防己诺林碱对PAM细胞的细胞毒性
一、实验方法
1、防己诺林碱的配制
防己诺林碱购于Selleckchem公司(货号S3606，CASno.436-77-1)。将防己诺林碱溶解于DMSO，配制为50mM，分装后贮存于-80℃备用，使用时再用含10％FBS的细胞培养基RPMI-1640稀释。
2、防己诺林碱对PAM细胞的细胞毒性
将PAM细胞以1×105个每孔接种于96孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，用10％FBS的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/mL，链霉素50μg/mL)将防己诺林碱稀释到0、1、5、10、20、40、60、80和100μM，100μL/孔，设置空白细胞对照组，每个浓度做6个复孔，在37℃、5％CO2培养箱培养48h后，弃掉上清液，加入MTT试剂，100μL/孔，继续避光培养4h后，弃掉上清液，加入150μL/孔的DMSO，避光低速震荡10分钟，使用酶标仪在参考波长490nm处读取每个孔的吸光度。
二、实验结果
结果如图16所示，防己诺林碱对PAM细胞的细胞毒性较小，其对PAM细胞的半数抑制浓度(CC50)为45.27μM。
实施例16不同浓度的防己诺林碱对PAM细胞中ASFVB646L基因与CP204L基因转录的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM防己诺林碱的10％FBSRP MI-1640共1mL，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度防己诺林碱的10％FBSRPMI-1640继续孵育24h。24h后用RNAfast200总RNA极速提取试剂盒试剂盒(上海飞捷公司)按照说明书步骤，抽提细胞中的总RNA，使用ASFVB646L(上游引物：SEQID NO:1，CCCAGGRGATAAAATGACTG；下游引物：SEQ ID NO:2，CACTRGTTCCCTCCACCGATA)和CP204L(上游引物：SEQ ID NO:3，GAGGAGACGGAATCCTCAGC；下游引物：SEQ ID NO:4，GCAAGCATATACAGCTTGGAGT)基因引物，采用SYBRGree nI为荧光染料，进行相对荧光定量PCR试验，检测ASFVB646L基因和CP204L基因的相对表达量。
反应条件为：95℃5min激活热启动酶；95℃10s变性，60℃30s退火，反应45个循环；在此步骤收集荧光信号。
二、实验结果
如图17所示，与对照组相比，防己诺林碱在0～5μM浓度下，呈浓度依赖性的抑制了ASFVB646L和CP204L基因的转录水平，在5μM浓度下ASFVB646L和CP204L基因的转录水平几乎被完全抑制。表明防己诺林碱有抑制ASFV基因转录的作用。
实施例17不同浓度的防己诺林碱对PAM细胞中ASFVp30、p72蛋白表达的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM防己诺林碱的10％FBSRPMI-1640共1mL继续孵育24h。24h后，弃去细胞上清，收集细胞培养物，提取总蛋白，用westernblot方法检测ASFV早期表达蛋白p30蛋白，晚期表达蛋白p72蛋白和内参蛋白GAPDH的表达差异。
二、实验结果
如图18所示，与未感染组相比，感染对照组与0.3μM，0.6μM和1μM防己诺林碱实验组ASFVp30蛋白和p72蛋白表达水平显著增加。然而与感染对照组相比，防己诺林碱在5μM的浓度时ASFVp30蛋白和p72蛋白的表达几乎被完全抑制。表明防己诺林碱有抑制ASFV病毒蛋白表达的作用。
实施例18不同浓度的防己诺林碱对PAM细胞中ASFV感染性病毒粒子产出的影响
一、实验方法
将PAM细胞以5×105个每孔接种于24孔板中，接种4h后细胞贴壁，弃去板中的培养液，换为含0、0.3、0.6、1、5μM防己诺林碱的10％FBSRPMI-1640共1mL，在37℃、5％CO2培养箱培养2h后，弃去上清，感染MOI＝0.1的ASFV，感染后1.5h弃去病毒液，换为含相应浓度防己诺林碱的10％FBSRPMI-1640继续孵育24h。24h后收集细胞上清，取100μL上清液用10％FBS的1640培养基10倍比稀释，加入已贴壁的PAM细胞中，100μL/孔，每个浓度设置8个重复，并且设置细胞空白对照，感染24h后进行间接免疫荧光实验，观察记录每孔中p30蛋白的免疫荧光阳性率。用Reed-Muench法计算出各试验组细胞培养液中的病毒滴度(TCID50)值。
二、实验结果
如图19所示，防己诺林碱在0～5μM浓度下对ASFV感染性病毒粒子的产出呈浓度依赖性的抑制，在5μM浓度时检测不到针对病毒p30蛋白的免疫阳性荧光。表明防己诺林碱有抑制ASFV感染性病毒粒子产出的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.具有双苄基异喹啉结构的生物碱在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述具有双苄基异喹啉结构的生物碱包括以下任意项：
(I)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中的一种或多种；和/或
(II)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的衍生物；和/或
(III)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种药学上可接受的盐；和/或
(IV)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的前药或药物中间体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，如下任意项在猪原代巨噬细胞上具有显著的抑制作用：
(I)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中的一种或多种；和/或
(II)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的衍生物；和/或
(III)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种药学上可接受的盐；和/或
(IV)、异粉防己碱、汉防己甲素、千金藤素或防己诺林碱中一种或多种的前药或药物中间体。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗非洲猪瘟包括如下任意项：
(I)、抑制病毒复制；和/或
(II)、抑制感染性病毒粒子产出；和/或
(III)、抑制病毒蛋白的表达。
5.如权利要求4所述的的应用，其特征在于，所述抑制病毒复制包括抑制非洲猪瘟病毒B646L基因和/或非洲猪瘟病毒CP204L基因的转录。
6.如权利要求4或5所述的的应用，其特征在于，所述抑制病毒蛋白的表达包括抑制非洲猪瘟病毒p30蛋白和/或非洲猪瘟病毒p72蛋白的表达。
7.如权利要求4至6任一项所述的的应用，其特征在于，所述药物的有效浓度包括(0.3～5μM)/5×105个细胞。
8.如权利要求4至7任一项所述的的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
9.如权利要求4至8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给予方式包括：舌下含化、口服、肌肉注射或静脉注射中的一种或多种。
10.如权利要求4至9任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：片剂、胶囊或颗粒中的一种或多种。
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| CN112516139A (zh) * | 2019-08-31 | 2021-03-19 | 广州自远生物科技有限公司 | 异喹啉类化合物制备抗病毒产品的用途 |
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