CN106138030B - 一种肠道病毒71毒株以及芒柄花素或其盐在抑制肠道病毒71中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新的肠道病毒71毒株以及芒柄花素或其盐在该毒株中的应用。具体地，本发明人发现芒柄花素特异性地对肠道病毒71(EV‑A71或EV71)在早期感染阶段具有强大的抑制作用。通过病毒效价减少实验发现，芒柄花素对其他种的肠道病毒均不具有抑制效果。机制研究发现它作用于病毒感染细胞的进入阶段，而不抑制病毒基因组复制阶段。此外，本发明还通过耐药株的筛选鉴定出芒柄花素的作用靶点位于结构蛋白VP1第7位缬氨酸和VP4第58位赖氨酸，含有这两个突变位点的EV71对芒柄花素具有耐药性。

Description

一种肠道病毒71毒株以及芒柄花素或其盐在抑制肠道病毒71 中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地，涉及芒柄花素在肠道病毒71中的应用，以及一种新的肠道病毒71的突变蛋白、突变毒株及其与芒柄花素耐药性之间的相关性。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)和柯萨奇病毒A16型(CV-A16) 是引起亚太地区婴幼儿手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD) 的主要病原体。仅2014年一年中国大陆地区就有两百七十多万的儿童被确诊为手足口病，并有501例死亡病例，相比于2013年其发病率上升51.86％，死亡率上升98.92％(http://www.nhfpc.gov.cn/jkj/ s3578/201502/847c04 1a3bac 4c3e844f17309be0cabd.shtml)。手足口病的常见症状包括发热，局部出疹等，但也有些病人会发展成中枢神经系统(CNS)疾病，如无菌性脑膜炎，致死性脑炎。EV-A71感染更易导致儿童患上重症手足口病，并且大部分死亡病例与感染EV-A71有关。根据肠道病毒71型VP1蛋白的序列，可以将肠道病毒 71型划分成A，B1，B2，B3，B4，B5，C1，C2，C3，C4，C5共11种基因型。

因此，手足口病目前仍然是非常严峻的公共卫生问题，但迄今为止尚无有效的预防措施及治疗方法，研发抗病毒药物迫在眉睫。

发明内容

本发明第一方面，提供了一种芒柄花素或其盐的用途，用于制备抑制肠道病毒71(EV71)感染和/或抑制肠道病毒71进入细胞的药物组合物。

在另一优选例中，所述的芒柄花素的结构如式I所示：

式I

在另一优选例中，所述的肠道病毒71感染指肠道病毒71在进入细胞阶段的感染。

在另一优选例中，所述的肠道病毒71感染不包括肠道病毒71的复制和/ 或增殖。

在另一优选例中，所述的药物组合物含有芒柄花素或其盐，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的感染为早期感染。

在另一优选例中，所述的细胞包括人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)、非洲绿猴肾(Vero细胞)、幼仓鼠肾(BHK-21)细胞或肠道上皮细胞)，优选地，所述的细胞为Vero细胞或RD细胞。

在另一优选例中，所述的肠道病毒71为野生型病毒。

在另一优选例中，所述的肠道病毒71不含有一个或多个选自以下的突变氨基酸：

(a)结构蛋白VP1，V7I；和

(b)结构蛋白VP4，K58T。

本发明第二方面，提供了一种体外非治疗性的抑制肠道病毒71进入细胞的方法，在芒柄花素或其盐的存在下，将肠道病毒71和细胞接触，从而抑制肠道病毒71进入细胞。

本发明第三方面，提供了芒柄花素耐受相关的肠道病毒71突变蛋白，所述的突变蛋白选自：

(a)突变结构蛋白VP1；其中第7位氨基酸由Val(V)突变为Ile(I)，其中所述的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:1所示的序列；和

(b)突变结构蛋白VP4；其中第58位氨基酸由Lys(K)突变为Thr(T)，其中所述的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:2所示的序列。

在另一优选例中，所述的突变结构蛋白VP1的序列自第1-6位、8-297位与SEQ IDNO.:1所示的序列具有至少90％、92％、95％、98％、或100％的同源性，且含有所述突变结构蛋白VP1的肠道病毒71对芒柄花素耐药。

在另一优选例中，所述的突变结构蛋白VP1的序列自第1-57位、59-69位与SEQ IDNO.:2所示的序列具有至少90％、92％、95％、98％、或100％的同源性，且所述突变结构蛋白VP4的肠道病毒71对芒柄花素耐药。

在另一优选例中，所述的突变蛋白中，VP1突变蛋白的序列如SEQ ID NO.: 3所示。

在另一优选例中，所述的突变蛋白中，VP4突变蛋白的序列如SEQ ID NO.: 4所示。

在另一优选例中，所述的突变蛋白包括天然突变蛋白或非天然突变蛋白。

本发明第四方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第三方面所述的突变蛋白。

本发明第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第四方面所述的多核苷酸。

本发明第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第五方面所述的载体或所述的宿主细胞的基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。

本发明第七方面，提供了一种芒柄花素耐药的肠道病毒71突变病毒株，所述的突变病毒株含有一个或两个选自本发明第三方面所述的突变蛋白，且所述的突变病毒株的其他蛋白序列与野生型肠道病毒71的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的其他蛋白序列包括除突变蛋白以外的肠道病毒71 所有蛋白，其中，所述肠道病毒71的所有蛋白序列如SEQ ID NO.:3所示，其全基因序列如SEQ IDNO.:4所示。优选地，所述其他蛋白序列如SEQ ID NO.: 3中第70-565位，和第863-2193位所示。

在另一优选例中，所述EV71全基因组序列如SEQ ID NO.:4所示。其中，编码VP1和VP4蛋白的序列分别为第2438-3328位，第743-949位)。

在另一优选例中，所述的基本相同指的是所述的突变病毒株的其他蛋白序列与野生型蛋白序列具有至少90％、92％、95％、98％、或100％的同源性。

本发明第八方面，提供了本发明第三方面所述突变蛋白或其编码多核苷酸、或其检测试剂的用途，用于制备判断肠道病毒71芒柄花素耐药毒株的试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂包括：引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片。

在另一优选例中，所述引物对可以特异性扩增出VP1蛋白编码多核苷酸21 位的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)和/或VP4蛋白编码多核苷酸174位的腺嘌呤 (A)突变为胞嘧啶(C)的扩增产物。

在另一优选例中，所述的探针可以特异性结合于VP1蛋白编码多核苷酸21 位的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)和/或VP4蛋白编码多核苷酸174位的腺嘌呤 (A)突变为胞嘧啶(C)的核酸片段。

在另一优选例中，所述的抗体可以特异性结合于含VP1蛋白第7位Ile和/ 或VP4蛋白第58位Thr的多肽。

本发明第九方面，提供了一种检测肠道病毒71毒株芒柄花素耐药毒株的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(i)检测肠道病毒71VP1基因第21位腺嘌呤碱基和/或VP4基因第174 位核苷酸碱基胞嘧啶位点的试剂；或检测肠道病毒71VP1蛋白第7位Ile和/ 或VP4基因第58位Thr氨基酸位点的试剂；

(ii)说明书。

在另一优选例中，所述的试剂包括：引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片。

在另一优选例中，所述检测VP1基因第21位腺嘌呤碱基和/或VP4基因第 174位核苷酸碱基胞嘧啶位点的试剂为引物对，优选地，所述的引物对如SEQ ID NO.:5-6以及SEQID NO.:7-8所示。

EV71-VP1-2372F:GCAGCCCAAAAGAACTTCAC；(SEQ ID NO.:5)

EV71-VP1-3454R:AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC；(SEQ ID NO.:6)

EV71FL-2-F TTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACTC；(SEQ ID NO.:7)

EV71-1075R CAGTAKGARGGCCACTCMCC。(SEQ ID NO.:8)

在另一优选例中，所述试剂盒还含有本发明第三方面所述突变蛋白或其编码多核苷酸作为阳性对照。

本发明第十方面，提供了一种体外非诊断性判断肠道病毒71毒株是否为芒柄花素耐药毒株的方法，包括步骤：

(I)检测所述毒株中肠道病毒71毒株VP1基因第21位腺嘌呤碱基和/或 VP4基因第174位核苷酸胞嘧啶碱基位点；或检测肠道病毒71毒株VP1蛋白第7位Ile和/或VP4基因第58位Thr氨基酸位点；

(II)根据(I)中的检测结果，判断肠道病毒71毒株是否为芒柄花素耐药毒株，其中，当检测出肠道病毒71毒株VP1基因第21位为腺嘌呤碱基和/或VP4 基因第174位为胞嘧啶碱基；或检测出肠道病毒71毒株VP1蛋白第7位为Ile 和/或VP4基因第58位为Thr时，则表明该肠道病毒71毒株为芒柄花素耐药毒株。

本发明第十一方面，提供了一种芒柄花素耐药的肠道病毒71突变病毒株抑制剂的筛选方法，包括步骤：

(A)在实验组中，在含有待选化合物的条件下，将含有本发明第三方面突变蛋白的肠道病毒71突变病毒株和/或本发明第七方面所述的突变病毒株与细胞进行培养，并观察所述突变病毒株的细胞进入量；

在在对照组中，在不含待选化合物的条件下，将含有本发明第三方面突变蛋白的肠道病毒71突变病毒株和/或本发明第七方面所述的突变病毒株与细胞进行培养，并观察所述突变病毒株的细胞进入量；

(B)将(A)中实验组和对照组中突变病毒株的细胞进入量进行对比，若实验组中突变病毒株的细胞进入量E1显著高于对照组中突变病毒株的细胞进入量E0，则说明所述的待选化合物为芒柄花素耐药的肠道病毒71突变病毒株抑制剂。

本发明第十二方面，提供了一种抑制肠道病毒71(EV71)感染和/或抑制肠道病毒71进入细胞的方法，包括步骤：在肠道病毒71进入细胞的阶段，向需要的对象施用芒柄花素或其盐。

本发明第十三方面，提供了一种判断肠道病毒71毒株是否为芒柄花素耐药毒株和/或所述肠道病毒71毒株是否适合采用芒柄花素治疗的方法，包括步骤：

(I)检测所述毒株中肠道病毒71毒株VP1基因第21位腺嘌呤碱基和/或 VP4基因第174位核苷酸胞嘧啶碱基位点；或检测肠道病毒71毒株VP1蛋白第7位Ile和/或VP4基因第58位Thr氨基酸位点；

(II)根据(I)中的检测结果，判断肠道病毒71毒株是否为芒柄花素耐药毒株，其中，当检测出肠道病毒71毒株VP1基因VP1基因第21位腺嘌呤碱基和 /或VP4基因第174位核苷酸胞嘧啶碱基位点；或检测出肠道病毒71毒株VP1 蛋白第7位为Ile和/或VP4基因第58位为Thr时，则表明该肠道病毒71毒株为芒柄花素耐药毒株，和/或所述肠道病毒71毒株不适合采用芒柄花素治疗。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了芒柄花素对EV-A71的抑制效果及对细胞的作用；图1B显示加入芒柄花素后用空斑形成实验测定的病毒滴度。

图2显示了芒柄花素的抗病毒谱研究。

图3A显示了不同加药时间点的病毒滴度；图3B显示了瞬时转染复制子实验。

图4显示了芒柄花素对病毒不具备直接杀灭作用。

图5A显示了芒柄花素耐药株的筛选方案；图5B显示了芒柄花素对平行传代的野生型以及3个独立筛出来的选耐药株的抑制效果及对细胞的作用；图5C 显示了病毒滴度；图5D显示了3株耐药株抑制倍数与野生型的比较。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现芒柄花素特异性地对肠道病毒71(EV-A71或EV71)在早期感染阶段具有强大的抑制作用。通过病毒效价减少实验发现，芒柄花素对其他种的肠道病毒均不具有抑制效果，包括柯萨奇病毒A16(CV-A16)，柯萨奇病毒B3(CV-B3)，I型脊髓灰质炎病毒(PV1)和肠道病毒68型(EV-D68)，说明芒柄花素特异性的抑制EV-A71。机制研究发现它作用于病毒感染细胞的进入阶段，而不抑制病毒基因组复制阶段。此外，本发明还通过耐药株的筛选鉴定出芒柄花素的作用靶点位于结构蛋白VP1第7位缬氨酸和VP4第58位赖氨酸，含有这两个突变位点的EV71对芒柄花素具有耐药性。在此基础上，完成了本发明。

引物

如本文所用，术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、 DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

芒柄花素或其盐

黄芪、甘草、紫草、紫苜蓿、紫槐和红车轴草等植物中都含有异黄酮化合物—芒柄花素。芒柄花素具有雌激素活性，属于异黄酮植物雌激素。近年国外报道，异黄酮植物雌激素具有抗癌活性。

可用于本发明的芒柄花素具有式I的结构式：

式I

此外，可用于本发明的芒柄花素还包括其药学上可接受的盐。优选地，本发明所述药学上可接受的盐可以是阴离子与本发明活性成分上带正电荷的基团形成的盐。合适的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲基磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、苹果酸根、甲苯磺酸根、酒石酸根、富马酸根、谷氨酸根、葡糖醛酸根、乳酸根、戊二酸根和马来酸根。类似地，可以由阳离子与本发明活性成分的带负电荷的基团(例如羧酸根)形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子，例如四甲基铵离子。

在另一优选例中，“药学上可接受的盐”是指同选自下述酸形成的盐类：氢氟酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、草酸、硫酸、甲磺酸、水杨酸、三氟甲磺酸、萘磺酸、马来酸、柠檬酸、醋酸、酒石酸、琥珀酸、酢浆草酸、苹果酸、谷氨酸。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它包含安全有效量范围内的芒柄花素或其盐作为活性成分，以及药学上可接受的载体。

本发明所述的“活性成分”是指一种或多种本发明所述的芒柄花素或其盐活性成分。

“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有 10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

在另一优选例中，本发明活性成分可与大分子化合物或高分子通过非键合作用形成复合物。在另一优选例中，本发明活性成分作为小分子还可通过化学键与大分子化合物或高分子相连接。所述大分子化合物可以是生物大分子如高聚糖、蛋白、核酸、多肽等。

本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下) 等。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。

在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油； (d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他治疗药物(如抗生素)联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

抑制肠道病毒71的感染和/或抑制肠道病毒71进入细胞

如本文所用，所述“抑制肠道病毒71的感染”指的是本发明活性成分对肠道病毒71感染细胞，尤其是病毒进入细胞的阶段具有抑制效果。其中，所述的抑制感染并不包括病毒进入细胞后进行复制、翻译、表达蛋白的过程。

具体地，可用于本发明的细胞包括Vero细胞、RD细胞等。通常这些细胞能够良好地代表或模拟了病毒感染阶段体内病毒感染的细胞情况。

在本发明中，在体外情况中，肠道病毒71进入细胞阶段通常指的是肠道病毒71与细胞接触后0-1h；而在体内情况下，所述的进入阶段不仅指的是肠道病毒71与细胞接触后0-1h，也可指在病毒复制并导致细胞死亡后释放入微环境中、再次进入细胞的情况。因此，为了阻止肠道病毒71的感染或进入细胞，在体内施用本发明活性成分或药物组合物时，可在感染初期或感染持续阶段进行持续施用。

突变蛋白和突变毒株

本发明突变蛋白指的是基于野生型肠道病毒71的蛋白序列(如SEQ ID NO.: 1所示的VP1蛋白和SEQ ID NO.:2所示的VP4蛋白)，结构蛋白VP1的突变蛋白或VP4的突变蛋白，其中，对于VP1而言，其中第7位氨基酸由Val(V)突变为Ile(I)；对于VP4蛋白而言，其第58位氨基酸由Lys(K)突变为Thr(T)。

通常，对于VP1或VP4的蛋白而言，除了突变位点的氨基酸，其余氨基酸均与SEQ IDNO.:1或4所示的序列分别具有90％、92％、95％、98％、或100％的同源性，且含有所述的突变蛋白的肠道病毒71突变病毒株具有对芒柄花素耐受的活性。

此外，突变的蛋白可以检测到相应编码基因的SNP，优选地，含有所述的 SNP的编码基因(多核苷酸)如SEQ ID NO.:9所示：

ggagatagggtggcagatAtaattgaaagttccataggagatagcgtgagcagagccctcact caagctctaccagcacccacaggccagaacacacaggtgagcagtcatcgactggatacaggcaagg ttccagcactccaagctgctgaaattggagcatcatcaaatgctagtgacgagagcatgattgagac acgctgtgttcttaactcgcacagcacagctgagaccactcttgatagtttcttcagcagagcggga ttagttggagagatagatctccctcttgaaggcacaactaatccaagtggttatgccaactgggaca tagatataacaggttacgcgcaaatgcgtagaaaggtggagctattcacctacatgcgctttgatgc agagtttacttttgttgcgtgcacacccactgggcaagttgtcccacagttgctccaatatatgttt gtgccacctggagcccctaagccagattccagggaatccctcgcatggcagaccgccaccaaccctt cagtttttgtcaagctgtcagaccctccagcacaggtttcagtaccattcatgtcacctgcgagtgc ttaccaatggttttatgacggatatcccacattcggagaacacaaacaggagaaagatcttgaatatggggcatgtcctaataacatgatgggcacgttctcagtgcggactgtagggacctccaagtccaagt accctttagtggttaggatttacatgagaatgaagcacgtcagggcgtggatacctcgcccgatgcg taaccaaaactacctattcaaagccaatccaaattatgctggcaactccattaagccaactggtacc agtcgcacagcgatcactactctt；

VP4的编码序列如SEQ ID NO.:10所示：

(atgggttcgcaggtgtctacacagcgctccggttctcatgaaaattcaaattcagccactga gggttccaccataaactacaccaccattaattattacaaagactcctatgctgccacagcaggcaaa cagagtctcaagcaggatccagataagtttgcaaatcctgttaCagacatcttcactgaaatggcag cgccactgaag)

其中，编码VP1蛋白的多核苷酸第21位-鸟嘌呤位突变为核苷酸腺嘌呤，编码VP4蛋白的多核苷酸的第174位-腺嘌呤位突变为核苷酸胞嘧啶。

本发明还同了一种含有本发明突变蛋白的肠道病毒71的突变病毒株。其中，所述的突变病毒株包括VP1蛋白第7位由Val(V)突变为Ile(I)，或VP4蛋白第 58位氨基酸由Lys(K)突变为Thr(T)，或所述的突变病毒株VP1和VP4蛋白同时具有上述突变位点。应当理解的是，本发明突变病毒株除上述的突变位点以外，其他的蛋白及其编码序列均与野生型的肠道病毒71相同或基本相同。其中，一种优选的野生型肠道病毒71病毒株的蛋白序列如SEQID NO.:3所示；其编码的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.:4所示。在获得了以上基因编码序列后，可以对肠道病毒71病毒株的不同蛋白进行构建，或采用反向遗传的方法对病毒株进行构建，这些方法都是本领域技术人员所熟知的。

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了用于表达突变的VP1和VP4的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。

制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的突变基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。

包括外源序列的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法 (如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。

试剂盒及检测耐药的方法

本发明还提供了一种可以用于检测肠道病毒71病毒株是否对芒柄花素耐药，从而为临床诊疗方案提供支持的试剂盒。其中，所述的试剂盒中含有检测本发明突变蛋白(突变病毒株)的检测试剂，和任选的本发明突变蛋白或其基因序列用于作为阳性对照。

通常，所述的检测试剂可以是本领域技术人员熟知的基因或蛋白检测试剂，例如特异性扩增出突变基因的引物、探针或芯片，或是特异性结合于突变蛋白的抗体。本领域技术人员可以根据本发明教导的靶点设计并制备所述的引物、探针或抗体。

利用本发明提供的突变蛋白或其编码序列，和/或利用本发明试剂盒，可以诊断性或非诊断性地检测流行的肠道病毒71毒株是否为芒柄花素耐药的病毒株。即在样本中检测到了本发明突变蛋白或突变基因，则可以确定该样本是芒柄花素耐药的病毒株，从而在确定治疗方案时，避免使用芒柄花素作为抗肠道病毒71感染的的药物。

药物筛选方法

本发明提供了利用本发明突变蛋白或其基因以及病毒感染阶段作为筛药靶点的技术方案，尤其是作为筛选芒柄花素耐药型肠道病毒71突变病毒株抑制剂的方法。

优选地，本发明筛选方法将样本分为实验和对照组，分别在加与不加待选化合物的过程中，将具有本发明突变蛋白的肠道病毒71病毒株和细胞(如Vero 细胞)进行接触，并观察突变的病毒进入细胞的量，当具有待选化合物的实验培养体系中，病毒进入细胞的量显著少于对照组，则说明该待选化合物为所需的抑制剂，其能够有效地抑制耐药毒株对细胞的感染。

应理解，所选用的待选药物并无需特别限定，因为从现有的化合物数据库中，可以方便地按照本筛选方法获得所述的抑制剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用方法：

细胞、病毒和化合物

RD(人横纹肌瘤)细胞，Vero(非洲绿猴肾)细胞和BHK-21(幼仓鼠肾)细胞在含有1％青霉素/链霉素(penici ll in/streptomycin,P/S)和10％胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)的DMEM培养基中，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。EV-A71FY573株(GenBank登录号HM064456)用于高通量药物的筛选， EV-A71G082株用于病毒空斑减少实验以及不同时点加药实验。EV-A71病毒株 SH12-276(GenBank登录号KC570453)，EV-A71病毒株SH12-036(GenBank登录号KC570452)，CVA16SHZH05-1株(GenBank登录号EU262658)，柯萨奇病毒 B3(CVB3，Nancy株，ATCC VR-30)以及I型脊髓灰质炎病毒(PV1，Sabin株)用于该化合物抗病毒谱的研究。化合物芒柄花素购自Sigma-Aldrich，并溶解于 DMSO中进行抗病毒实验。

高通量筛选药物库

向96孔白板(Corning Costar)的每孔中加入50μl含有10000个RD细胞的DMEM，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h后，每孔分别加入5μl终浓度为10μM的被测化合物(化合物中的DMSO终浓度为0.25％)，对照组中加入5μl 0.25％的DMSO。然后加入45μl含50PFU的病毒稀释液，每孔的终体积为100μl，培养96小时后，取出，于室温下平衡30分钟。而后每孔加入50μl CellTiter-Glo(Promega)试剂，在室温下放置10到30分钟，使用VeritasMicroplate Luminometer(Turner BioSystem)酶标仪进行检测。抑制率大于60％的化合物将进行第二轮的验证实验。

化合物的验证实验

从Sigma-Aldrich购得芒柄花素，溶于DMSO中，终浓度为100mM。为了验证化合物抑制EV-A71诱导的细胞病变(cytopathic effect,CPE)的活性，进行了剂量依赖实验，方法类似于以上所述的高通量筛选药物库实验。为了测定化合物对细胞的作用，进行了细胞毒性实验，实验方法与剂量依赖实验相同，但是不再加入病毒液，取而代之的是含2％FBS和1％P/S的DMEM。

病毒效价的测定

测EV-A71的效价，向12孔板(Corning Costar)的每孔中加入1ml含3×10⁵个RD细胞的DMEM，培养24h。病毒进行10倍倍比稀释，即将25μl病毒液与225μl 的含2％FBS和1％P/S的DMEM混匀。吸出12孔板中的培养基，每孔加入200μl 病毒液。放置在37℃，5％CO₂的培养箱中感染1h，每隔15分钟轻轻摇动。然后吸出病毒液，加入1ml含0.8％甲基纤维素(AquacideⅡ，Calbiochem)和2％FBS的 DMEM，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养6天，置于3.7％的福尔马林中固定1h后，用1％的结晶紫染色。对于其它病毒，CV-B3培养1天，PV1培养2天，CV-A16培养 3天后再固定染色。

EV-D68的滴度是通过半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)测定的。向96孔透明板每孔中加入20000个RD细胞，培养24小时后加入100μl 10倍倍比稀释的病毒(从 10^-1到10^-8)，每个稀释度的病毒加入到10个孔中。感染1小时后，吸出病毒，加入含2％FBS的DMEM。在37℃，5％CO₂的培养箱中培养7天后置于3.7％的福尔马林中固定1h后，用1％的结晶紫染色。用Reed-Muench方法(11)测病毒滴度并表示为TCID₅₀/ml。

病毒效价减少实验

在12孔板中接种RD细胞，3×10⁵个/孔，37℃培养过夜，24小时后加入MOI＝ 0.1的EV-A71病毒液和3倍倍比稀释的芒柄花素，在37℃培养42h后，收集上清液，放到-80℃冰箱中冻存，然后测定病毒滴度。对于CV-A16和PV1，用MOI＝0.01 的病毒感染42h后收上清液，对于CV-B3，用更低的MOI＝0.001的病毒感染24h后收上清液。而对于EV-D68，用MOI＝0.1的病毒感染48h后收培养液，然后测TCID50。

不同时点加药实验

为了研究化合物芒柄花素抗病毒的作用机制，进行了不同时点加药实验。在 12孔板中接种Vero细胞，3×10⁵个/孔，37℃培养24h后，用MOI为5的EV-A71 在4℃感染1h。用预冷的培养基洗两遍后，每孔加入1ml培养基放到培养箱中 (所有操作均在冰上进行)，并分别在0，1，2，3，4，5，6，8，10h时加入20μM 的芒柄花素，感染12h后收上清液，放到-80℃冰箱中冻存，测定病毒滴度。

瞬时复制子实验

构建含萤火虫荧光素酶报告(F-Luc)基因的EV-A71复制子，该复制子用萤火虫荧光素酶基因替换了EV-A71感染性cDNA克隆中的结构基因，并在F-Luc报告基因的下游加入了2A蛋白的识别序列“AITTL”用于自我裂切割，用NotⅠ酶将复制子的质粒DNA进行线性化，并且用MEGAscript T7转录试剂盒进行体外转录。

复制子RNA(1μg)电转入8×10⁶个BHK-21细胞中(25μF，850V，电击三次，每次间隔3秒)。转染后的细胞用15ml含10％FBS的DMEM悬浮，并接种到12孔板中，1ml/孔，实验组加入20μM的芒柄花素，对照组加入0.25％的DMSO，检测转染1h和16h时的荧光素酶活性。收集裂解产物时，在4℃，700g条件下离心 5分钟，吸出培养基并加入PBS清洗，相同条件离心5分钟后加入250μl的裂解液(Promega)，用封口膜把板子封存放到-80℃。待所有的样品收齐后，取20μl 裂解液加到96孔白板中，用Veritas Microplate Luminometer(TurnerBioSystems) 检测荧光信号。

数据分析

把原始数据输入到Excel表格中计算信背比(S/B)，信噪比(S/N)，Z因子以及待测化合物对病毒的抑制率。计算公式如下：S/B＝μc/μv，μc表示细胞对照组信号的平均值，μv表示病毒对照组信号的平均值，S/N＝(μc -μv)/(σc-σv),σc表示细胞对照组信号的标准差，σv表示病毒对照组信号的标准差，Z＝1-((3σc+3σv)/|μc-μv|),Z因子在0.5与1之间表示实验方法能够有效的区分对照组之间的差异(12)。化合物的抗病毒活性 CPE抑制率＝(μcpd-μv)/(μc-μv)×100％，μcpd表示待测化合物的平均信号强度，化合物对细胞的作用细胞存活率＝μcpd/μc×100％。半数最大效应浓度(EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。半数细胞毒性浓度(CC50)是指引起50％细胞毒性反应的药物浓度，在此实验中表示为实验组比对照组荧光强度降低50％。EC₅₀和CC₅₀是用Prism软件计算的，每个化合物的选择性指数(SI)＝ CC₅₀/EC₅₀。

实施例1芒柄花素能够有效抑制EV-A71对细胞的感染

1.1向RD细胞中加入3倍倍比稀释的芒柄花素，加入病毒培养96小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测芒柄花素对EV-A71的抑制效果及对细胞的作用。结果使用Graphpad Prism5进行处理(图1A)。

1.2用感染复数(Multiple of infections,MOI)为0.1的EV-A71感染 RD细胞，并且加入3倍倍比稀释的芒柄花素，培养42h后收集上清液，用空斑形成实验测定病毒滴度。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理(图1B)。

结果可见，芒柄花素能够有效抑制EV-A71对细胞的感染且在最高测试浓度下不显示细胞毒性，其EC₅₀为2.67μM。该化合物在测试的最高浓度下(250 μM)不显示细胞毒性。

实施例2芒柄花素的抗病毒谱研究。

分别用EV-A71SH276株(MOI＝0.1)，EV-A71SH036株(MOI＝0.1)， EV-D68(MOI＝0.1)，CV-A16(MOI＝0.01)，PV1(MOI＝0.01)，CV-B3(MOI＝0.001)，感染RD细胞，并加入3倍倍比稀释的芒柄花素，分别在感染48、48、48、42、 42、24h后收集上清液，测定病毒的滴度(图2)。

结果如图2所示，芒柄花素能抑制EV-A71的感染，对2株EV-A71临床分离株SH276和SH036的EC₅₀分别为2.10和0.64μM，但是对其它不同种的肠道病毒则没有抑制作用，包括柯萨奇病毒A16(CV-A16)，柯萨奇病毒B3(CV-B3)， I型脊髓灰质炎病毒(PV1)和肠道病毒68型(EV-D68)，说明其对EV-A71的抑制是特异性的。

实施例3芒柄花素抑制病毒的机制研究。

3.1不同时点加药实验。MOI为5的EV-A71在4oC感染Vero细胞1h，用预冷的培养基洗三遍，然后在相应的时间点加入20μM的芒柄花素，12h后收集上清液测病毒滴度。对照组是在感染0、4、10h时加入0.25％DMSO(图3A)。

3.2瞬时转染复制子实验。1μg含Firefly荧光素酶(F-Luc)报告基因的复制子转染BHK-21细胞，转染后的细胞接种到12孔板中，分别加入20μM的芒柄花素，1μM的芦平曲苇(rupintrivir)，0.25％DMSO(对照)，并在1h、 16h收集裂解液进行检测(图3B)。

转染后1h代表了病毒蛋白翻译阶段，16h代表病毒RNA合成阶段，实验结果表明芒柄花素对1h和16h的荧光素酶活性均不抑制，证明芒柄花素不作用于病毒复制阶段。

实施例4芒柄花素对病毒不具备直接杀灭作用

为了确认芒柄花素是否具有杀毒效果，本实施例将病毒分别与0.25％DMSO 或20μM芒柄花素37℃孵育1h后，再稀释100倍或1000倍感染Vero细胞，测定病毒滴度，将实验组(DMSO)和对照组(芒柄花素)的滴度进行比较，发现它们之间并无显著差别，该结果证明芒柄花素没有杀毒活性，进一步说明芒柄花素是特异性的作用于进入阶段而不是通过直接把病毒杀死来发挥抗病毒活性的。

实施例5芒柄花素通过靶向肠道病毒71型结构蛋白VP1和VP4来发挥作用。

5.1芒柄花素耐药株的筛选方案。耐药株是通过在EV71病毒盲传过程中逐步增加药物浓度来筛选获得的。病毒分别在终浓度为3,6,12,24μM的芒柄花素中传1代，在终浓度为48,100μM的芒柄花素中各传3代，共10代。盲传采用在传代培养过程中每天观察细胞病变情况的方式决定收取病毒的最佳培养时间。同时以野生型病毒在不加芒柄花素的培养基中平行传代作为对照。平行筛选了3株耐药株(图5A)。

5.2Vero细胞中加入3倍倍比稀释的芒柄花素，加入病毒培养96小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测芒柄花素对平行传代的野生型以及3个独立筛出来的选耐药株的抑制效果及对细胞的作用。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理(图5B)。

5.3用感染复数(Multiple of infections,MOI)为0.1的3株筛选出来的耐药株和平行传代的野生型感染Vero细胞，一组加入100μM的芒柄花素，另一组加入DMSO作为对照，培养42h后收集上清液，用空斑形成实验测定病毒滴度。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理(图5C)。

5.43株耐药株抑制倍数与野生型比较。抑制倍数等于各组病毒用DMSO处理的病毒滴度除以100μM的芒柄花素处理的病毒。与野生型比抑制倍数比值等于野生型抑制倍数除以各筛选株的抑制倍数。从图5D中可以看出，与野生型相比，结构蛋白突变的突变株其耐药性提高了25倍以上，说明芒柄花素的作用靶点为病毒的结构蛋白VP1和VP4，VP1和VP4结构蛋白突变以后导致耐药性显著增强，也进一步说明芒柄花素是EV71进入抑制剂。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。结果使用GraphpadPrism5进行处理(图5D)。

结果可见，本发明中将肠道病毒71型在Vero细胞上在逐步提高芒柄花素浓度下传了10代获得了EV-A71的耐药株，全基因组测序发现耐药株的突变位于病毒结构蛋白VP1(G21A，VP1Val7Ile)和VP4(A174C,VP4Lys58Thr) 上，提示结构蛋白VP1和/或VP4是芒柄花素的作用靶点。该结果也进一步证明了芒柄花素是病毒进入抑制剂。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种体外非治疗性的抑制肠道病毒71进入细胞的方法，其特征在于，在芒柄花素或其盐的存在下，将肠道病毒71和细胞接触，从而抑制肠道病毒71进入细胞；

所述的芒柄花素的结构如式I所示：

所述的肠道病毒71不含有一个或多个选自以下的突变氨基酸：

(a)结构蛋白VP1，V7I；和

(b)结构蛋白VP4，K58T；

所述的细胞包括人横纹肌肉瘤RD细胞、非洲绿猴肾Vero细胞、幼仓鼠肾BHK-21细胞或肠道上皮细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞为Vero细胞或RD细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肠道病毒71为野生型病毒。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肠道病毒71的结构蛋白不是选自下组的突变蛋白：

(a)突变结构蛋白VP1；其中第7位氨基酸由Val(V)突变为Ile(I)，其中所述的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:1所示的序列；和

(b)突变结构蛋白VP4；其中第58位氨基酸由Lys(K)突变为Thr(T)，其中所述的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:2所示的序列。

5.一种芒柄花素耐药的肠道病毒71突变病毒株抑制剂的体外非治疗性筛选方法，包括步骤：

(A)在实验组中，在含有待选化合物的条件下，将含有突变蛋白的肠道病毒71突变病毒株与细胞进行培养，并观察所述突变病毒株的细胞进入量；

在对照组中，在不含待选化合物的条件下，将含有突变蛋白的肠道病毒71突变病毒株与细胞进行培养，并观察所述突变病毒株的细胞进入量；

(B)将(A)中实验组和对照组中突变病毒株的细胞进入量进行对比，若实验组中突变病毒株的细胞进入量E1显著高于对照组中突变病毒株的细胞进入量E0，则说明所述的待选化合物为芒柄花素耐药的肠道病毒71突变病毒株抑制剂；

所述突变蛋白选自：

(a)突变结构蛋白VP1；其中第7位氨基酸由Val(V)突变为Ile(I)，其中所述的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:1所示的序列；和

(b)突变结构蛋白VP4；其中第58位氨基酸由Lys(K)突变为Thr(T)，其中所述的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:2所示的序列。

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