CN108404117B

CN108404117B - 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗寨卡病毒感染药物中的应用

Info

Publication number: CN108404117B
Application number: CN201810531851.7A
Authority: CN
Inventors: 吴建国; 王文标; 邬开朗; 刘映乐; 李耿; 刘芳; 谭秋萍; 罗震
Original assignee: Guangdong Longfan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Longfan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-05-29
Also published as: CN108404117A

Abstract

本发明公开了一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗寨卡病毒感染药物中的应用，步骤：A、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3抗寨卡病毒活性的评价；B、从THP‑1细胞中提取的总mRNA为模板，通过反转录PCR扩增得到总的cDNA，通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切、连接将NLRP3基因克隆到载体pGEX‑6p‑1的pTAC启动子下，获得表达NLRP3的菌株。C、挑取上述菌株单菌落，接入含有氨苄霉素的LB液体培养基中，进行NLRP3的表达，并用亲和层析纯化、浓缩，得到NLRP3冻存液；D、将蛋白加入到细胞中，检测ZIKV NS5的mRNA水平和蛋白水平。NLRP3是人体内组成性表达的细胞因子，生理浓度下对人体没有毒副作用，NLRP3的抗病毒作用机制是通过改变细胞内的信号来抑制病毒复制，抗病毒的机制多样化，不易使病毒产生耐药性。

Description

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗寨卡病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗病毒药物领域，更具体涉及一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptors,NLRP3)在制备治疗或预防寨卡病毒(ZIKV)感染药物中的应用。

背景技术

寨卡病毒(ZIKV)是一种经过伊蚊叮咬为媒介传播的虫媒病毒，基因组为单股正链RNA，ZIKV与登革病毒相似，属于黄病毒科黄病毒属。ZIKV于1947年在乌干达寨卡森林中一只发热的恒河猴中被初次发现。尽管有血清学证据表明ZIKV在世界范围内广泛传播，但很少有人类感染ZIKV的记录。直到2007年，密克罗尼西亚联邦雅浦岛发生了寨卡病毒的大规模爆发流行，这座位于南太平样地区的岛屿上75％的居民被病毒感染，这是ZIKV初次显示出其潜在传播性和致病性。ZIKV的第二次大规模爆发于2013年发生在法属波利尼西亚,这一次的爆发有更高的发病率，大量的数据证明寨卡病毒的感染和格林巴利综合症(Guillain-Barre′syndrome)存在一定水平的相关性。时间追溯到2015年之前，寨卡病毒暴发的疫情大多数都是分布在非洲、太平洋岛屿和东南亚国家以及地区。在2015年5月份，南美洲的巴西发现了第一例确诊寨卡感染病例，迄今为止，全世界范围内已经有70多个国家和地区报道了寨卡病毒感染情况并且引发了多个国家及地区的输入病例。出乎意料，寨卡病毒除了引发了我们之前所知的格林巴列综合症，也能摧毁孕期妇女腹中胎儿神经系统发育，导致婴儿小头症2016年的2月9号，在我国的江西省，初次确诊了输入型寨卡病毒的的病例，调查之后发现患者近期有委内瑞拉的旅行史，随后在我国的广东省、浙江省和北京市相继确诊多例寨卡病毒感染情况，但是总结来看，并未发现本土自发病例，全部都是输入型病例。

ZIKV属于黄病毒科黄病毒属，为正链RNA病毒，经过系统发生数分析之后发现，寨卡病毒与同为黄病毒属的黄热病毒、登革病毒、日本脑炎病毒以及西尼罗病毒相近。寨卡病毒的外部结构呈球状，病毒直径大约为50nm，病毒的结构蛋白(prM和E)和单股正链RNA基因组共同构成一个二十面体对称的核衣壳，病毒的外层则是由脂质包膜。

寨卡病毒基因组属于单股正链RNA，全长约10.8kb，整个基因组含一条长的单一的开放读码框，进入细胞之后翻译出一个含3000多个氨基酸的多蛋白复合体，在病毒蛋白和宿主蛋白的共同作用下，酶切形成了3个结构蛋白和7个非结构蛋白(图1)。病毒的三个结构蛋白分别是衣壳蛋白(capsid),膜蛋白前体(precursor DDMEMbrane)以及包膜蛋白(envelope)，病毒的7个非结构蛋白则依次是NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。其中病毒的衣壳蛋白和病毒的RNA相互作用共同形成核衣壳，病毒的膜蛋白前体蛋白能够阻止未成熟的病毒与宿主细胞膜进行膜融合，病毒的衣壳蛋白作为病毒的融合剂，能够调节病毒吸附细胞，加速寨卡病毒与宿主细胞膜的融合，促进寨卡病毒的基因组释放到宿主细胞中。而病毒的非结构蛋白具有RNA解旋酶、丝氨酸蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)等一系列的功能，在调节病毒基因组转录，复制和拮抗宿主免疫反应方面行使重要作用。

ZIKV感染人类引发的症状都是比较温和的，仅20％左右被感染者表现出轻微相似流感一样的发热症状。近些年来，随着研究深入，大量的实验结果均证明，ZIKV引起的临床表症还包括结膜炎、关节疼痛、皮疹以及肌肉疼痛等，在感染了ZIKV之后，80％的患者均属于隐性感染过程，并不会有任何的表症，仅20％的病人会出现以上的临床表症，大多数都较为温和，持续大概2-7天后就能够自愈，但是也有严重的并发症，包括新生儿的小头症、睾丸损伤、眼疾和格林巴列综合征。

针对ZIKV感染，到现在为止并没有开发出相关的疫苗能够用来接种预防病毒，最有效的方式还是避免和防止虫媒的叮咬，进行灭蚊行动，世界各国卫生组织和我国均在积极完善ZIKV防控措施。根据我国卫计委的要求，各个下级卫生行政部门应当高度的重视ZIKV疫情的防治和控制，需要加强医疗救治相关的准备工作，在口岸地区应当加强卫生检疫，加强对应位置医务人员的应变能力和基本素质，是这些医务人员能够掌握最基本的诊断和鉴别方法，提高早期的识别和诊断能力。在我国广东、云南、海南等与国外交流十分多的省份，需要采取防蚊和隔离措施，开展大量的灭蚊共作，防患于未然，降低病毒感染传播的风险。检测到病毒感染病人之后，需采用有效的隔离措施。

针对黄病毒属各种病毒感染，已经开发出多种有效疫苗，譬如YFV,TBEV,JEV和DENV。目前，尚无ZIKV疫苗进入临床应用，因此，ZIKV疫苗距离研发成功可能仍需数年。最近，一个印度生物公司宣称已研发出两种ZIKV疫苗正在等着进入临床前研究。美国SynConPharmaceuticals公司也开发出一种基于DNA抗ZIKV疫苗，预计2017年底进入临床研究阶段。目前的ZIKV疫苗开发策略主要以现有黄病毒疫苗开发平台为模板(例如，灭活或减活病毒，黄病毒嵌合体，糖蛋白亚基技术)。ZIKV全球传播造成越来越大威胁引起科学团体重视，并着手构建适合开发ZIKV疫苗的小鼠模型。不同ZIKV毒株互相之间并不存在很大的遗传变异，基于此，开发一种疫苗抵抗所有ZIKV毒株成为可能。然而，黄病毒疫苗开发也受到其爆发的零星性，不可预测性限制。

鉴于ZIKV疫苗的临床研究还未进行，研究者开始着重推进抗ZIKV治疗方案开发。传统上，抗病毒药物的研发主要在肿瘤细胞系(例如，星形细胞瘤细胞和肝癌细胞)或动物细胞系(例如，Vero细胞)中进行。人类干细胞系模型的建立使得在人体相关靶标筛选抗ZIKV药物成为可能。最近，美国食品药品监督局(FDA)检测774种药物的抗ZIKV效果，发现几种药物能够抑制ZIKV感染，这个实验最初是在人肝癌细胞系中进行，并在人的胎盘滋养层细胞和神经干细胞中证实其抗ZIKV效果。另一项研究检测了6000多种FDA已批准上市的，临床研究中的和具有药理学活性的药物，然后发现一种pan-caspase抑制剂能够抑制由ZIKV感染引起的caspase-3激活，从而保护人单层和前脑中神经细胞死亡。另一项有趣的研究表明，十种结构不相关细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CDKs)能够抑制ZIKV复制，考虑到ZIKV编码的蛋白都不是CDKs，实验结果表明宿主的CDKs在病毒复制过程中行使十分重要的作用。基于此，可将这些复合物开发成抗病毒药物，抑制ZIKV感染。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerizationdomain-like receptors，NLRs)是一个大家族，NLRP3是整个NLRs家族中探讨的最多，激活机制研究的最清楚的蛋白，NLRP3蛋白经过其N端的PYRIN结构域与ASC蛋白的PYRIN结构域相互作用，再经过中部的NACHT结构域发生寡聚化导致同源的寡聚体的产生，激活之后招募的ASC蛋白再经过其CARD结构域与Caspase-1的N端CARD结构域相互结合，共同组成NLRP3炎症小体复合物，复合物产生之后，会剪切无活性的Caspase-1产生有活性的Caspase-1 p10/p20，有活性的Caspase-1能够识别并切割IL-1β和IL-18的前体，产生有活性的IL-1β和IL-18剪切体，随后经过膜泡运输，IL-1β和IL-18分泌到细胞外行使其细胞因子的功能。NLRP3炎症小体能够被许多的病毒激活，在抗病毒和帮助宿主免疫应答中起十分重要的作用。NLRP3炎症小体的完全活化需要2步，第一步是需要TLR、NLR或者RLR激活NF-κB通路，诱导产生NLRP3、IL-1β和IL18的前体；第二步则是受到病毒感染或者危险信号的刺激，激活NLRP3炎症小体，形成炎症小体复合体之后，切割产生有活性的Caspase-1 p10/p20，随后识别并切割产生有活性的IL-1β和IL-18。已知报道的内源刺激物，例如ATP、MSU(尿酸钠盐)、CPPD(二水焦磷酸钙)、淀粉样蛋白-β、胆固醇结晶和透明质酸，如果发生细胞内定位异常，均会被NLRP3感应从而激活NLRP3炎症小体。外源刺激物，例如石棉或者二氧化硅这类结晶或者颗粒状物质、佐剂中的明矾、病原体微生物和病毒刺激细胞之后也能够被NLRP3感应从而激活NLRP3炎症小体。

对NLRP3研究主要集中在以NLRP3为核心的炎症小体上。但是目前未有NLRP3本身对寨卡病毒(ZIKV)的预防与治疗作用的报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptors,NLRP3)在制备治疗或预防寨卡病毒(ZIKV)感染药物中的应用，从而为临床上ZIKV的感染治疗提供一类安全高效且毒副作用蛋白。通过单独使用或者与其他抗ZIKV药物联合使用，NLRP3能够在预防或者治疗寨卡病毒感染过程中发挥重要作用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在制备治疗或预防寨卡病毒感染药物中的应用，其步骤是：

A、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3抗寨卡病毒活性的评价；

B、以从THP-1(Human acute monocytic leukemia cell line)细胞中提取的总mRNA为模板，通过反转录PCR扩增得到总的cDNA，再以总的cDNA为模板，用特异引物扩增得到NLRP3基因片段。通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切、连接将NLRP3基因克隆到载体pGEX-6p-1(购于YRgene)的pTAC(购于科瑞思博)启动子下，得到NLRP3的表达载体pGEX-6p-1-NLRP3。将上述表达载体pGEX-6p-1-NLRP3转化大肠杆菌BL21(购于科瑞思博)，获得表达NLRP3的菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3。

C、挑取上述菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3单菌落，接入3mL含有氨苄霉素(Amp+)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床上摇菌过夜；转接1-2mL菌液至含20mL培养基的50mL摇瓶中，在37℃、200rpm摇床上摇菌2h，到细胞达到对数中期(OD₆₀₀＝0.5-0.6)；在培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM，37℃、200rpm摇床上继续培养6h。得到的大肠杆菌培养液离心收集细胞，用10mL PBS重悬，破碎收集上清。取2mL GST融合蛋白纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司)，加入柱中，10-15倍柱体积的lysis buffer(Tris-HCl 0.484g，NaCl 5.84g，二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT)，乙二胺四乙酸(EDTA)40μL(0.5M EDTA)，苯甲基磺酰氟(PMSF)0.035g，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)4℃进行柱平衡。用柱帽堵上，将澄清的细胞上清用0.45μm的细菌过滤器后加入谷胱甘肽树脂预装柱，4℃摇床孵育过夜。用15-20mL wash buffer(Tris-HCl 0.484g，NaCl 5.84g，二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT)，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)洗柱，用5mL elution buffer(Tris-HCl 1.21g，NaCl 1.752g，0.1％Trition-100 0.2mL，乙二胺四乙酸(EDTA)2mL(0.5MEDTA)，还原性谷胱甘肽1.792g，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)将目的蛋白洗脱，分三次洗脱收集洗脱液。蛋白液用超滤管4℃12000rpm离心，浓缩蛋白，浓缩后的蛋白浓度为2.1mg/mL，分装冻存于-80℃冰箱，得到NLRP3冻存液；

D、将NLRP3蛋白加入到细胞中再加ZIKV，检测ZIKV NS5的mRNA水平和蛋白水平。

通过上述的技术措施：本发明获得了一个非常好的效果，本实验结果如图1和图2所示。将NLRP3蛋白加入到细胞中再加ZIKV，检测ZIKV NS5的mRNA水平和蛋白水平，发现NS5的mRNA水平、蛋白水平与不加NLRP3相比显著下降，并呈剂量依赖性，该结果表明NLRP3蛋白抑制ZIKV复制，具有抗ZIKV的活性。

所述的NLRP3表达质粒，其构建过程见实施例1。

所述的抗ZIKV药物是以NLRP3作为药物活性成分，利用常规技术可制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂{活性成分含量5％(质量比，以下相同)，其余为相应辅料(90％淀粉和5％PVP)}或注射剂(规格为1mg/mL，溶于生理盐水)任何一种药学上接受的载体(剂型)。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、NLRP3是在人体内组成性表达的一种细胞因子，生理浓度下对人体没有毒副作用。

2、NLRP3的抗病毒作用机制是通过改变细胞内的信号通路来抑制病毒复制，或直接作用于病毒包膜，或影响病毒吸附，从而抗病毒，因其抗病毒的机制多样化，不易使病毒产生耐药性。

基于上述结果表明：NLRP3可用于制备抗ZIKV药物，NLRP3可用于制备预防和/或治疗ZIKV感染的药物。

本发明发现了NLRP3新的药用价值，为抗ZIKV、预防和/或治疗ZIKV感染提供了新的有效药物。

附图说明

图1为一种Realtime PCR检测ZIKV NS5的mRNA水平结果图。其中NLRP3的浓度为16μg/mL时ZIKV NS5的mRNA量减少69.5％。

图2为一种Western Blot检测ZIKV NS5的蛋白水平结果图。其中NLRP3的浓度为20μg/mL时ZIKV NS5的蛋白量减少82.7％。

图中从左到右依次是只加入病毒、加入10μg/mL的NLRP3蛋白液和病毒、加入20μg/mL蛋白液和病毒。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptors,NLRP3)在制备治疗或预防寨卡病毒(ZIKV)感染药物中的应用，其步骤是：

(1)克隆NLRP3基因(NLRP3制备)：以从THP-1(Human acute monocytic leukemiacell line)细胞中提取的总mRNA为模板，通过反转录PCR扩增得到总的cDNA，再以总的cDNA为模板，用特异引物扩增得到NLRP3基因片段。引物如下：

P1(正向引物):5’-CGCGGATCCATGAAGATGGCAAGCACCCGC-3’ BamHⅠ

P1(反向引物)：5’-CCGCTCGAGCTACCAAGAAGGCTCAAAGAC-3’ XhoⅠ

通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切、连接将NLRP3基因克隆到载体pGEX-6p-1(购于YRgene)的pTAC(购于科瑞思博)启动子下，得到NLRP3的表达载体pGEX-6p-1-NLRP3。

(2)表达NLRP3的大肠杆菌的获得：将上述表达载体pGEX-6p-1-NLRP3转化大肠杆菌BL21(购于科瑞思博)，获得表达NLRP3的菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3。

(3)NLRP3的表达：挑取上述菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3单菌落，接入3mL含有氨苄霉素(Amp+)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床上摇菌过夜；转接1-2mL菌液至含20mL培养基的50mL摇瓶中，在37℃、200rpm摇床上摇菌2h，到细胞达到对数中期(OD₆₀₀＝0.5-0.6)；在培养液中加入IPTG至终浓度为0.6mM，37℃、200rpm摇床上继续培养6h。

(4)NLRP3的纯化：将步骤(3)得到的大肠杆菌培养液离心收集细胞，用10mL PBS重悬，破碎收集上清。取2mL GST融合蛋白纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司)，加入柱中，10-15倍柱体积的lysis buffer(Tris-HCl 0.484g，NaCl 5.84g，二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT)，乙二胺四乙酸(EDTA)40μL(0.5M EDTA)，苯甲基磺酰氟(PMSF)0.035g，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)4℃进行柱平衡。用柱帽堵上，将澄清的细胞上清用0.45μm的细菌过滤器后加入谷胱甘肽树脂预装柱，4℃摇床孵育过夜。用15-20mL wash buffer(Tris-HCl0.484g，NaCl 5.84g，二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT)，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)洗柱，用5mL elution buffer(Tris-HCl 1.21g，NaCl 1.752g，0.1％Trition-100 0.2mL，乙二胺四乙酸(EDTA)2mL(0.5M EDTA)，还原性谷胱甘肽1.792g，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)将目的蛋白洗脱，分三次洗脱收集洗脱液。蛋白液用超滤管4℃12000rpm离心，浓缩蛋白，浓缩后的蛋白浓度为2.1mg/mL，分装冻存于-80℃冰箱，得到NLRP3冻存液。

(5)NLRP3对宿主细胞的毒性检测：

经24-48h培养HeLa细胞(人宫颈癌细胞)长满单层时加DMEM培养基+10％(体积比)胎牛血清培养，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％(体积比)CO₂细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。将实施例1得到的NLRP3冻存液用无血清的DDDMEM细胞培养液逐倍稀释，配制成四个浓度梯度5、10、20、40μg/mL，之后再把不同浓度的NLRP3蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μL，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加药，只加培养液)，再每孔补加100μL细胞培养液，于37℃、5％CO₂细胞培养箱内，培养48小时后，加入20μL/孔

AQueous OneSolution Reagent继续孵育4h，终止培养。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式：细胞存活率(％)＝实验孔的OD值/对照孔的OD值×100％计算细胞存活率，找出NLRP3蛋白液对细胞的最大无毒浓度范围，结果见表1。

表1 NLRP3对HeLa细胞毒性结果

结果表明：NLRP3在5-40μg/mL的范围对HELA细胞没有明显细胞毒性，此外在显微镜下观察细胞也没有病变发生，表明NLRP3的安全性较好。

(6)NLRP3抗ZIKV病毒的作用：

经24-48h培养宫颈癌细胞(HeLa细胞)长满单层时(DDDMEM培养基+10％胎牛血清培养)，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。加入用无血清的DDMEM细胞培养液稀释的终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/mL的NLRP3蛋白液，孵育1h后用ZIKV病毒感染，感染复数(multiplicities of infection，MOI)为MOI＝5，12h后收样检测分别用Realtime PCR和Western Blot检测ZIKV NS5的mRNA水平和蛋白水平。其中，WesternBlot以β-actin为内参，所用抗体购买于Abnova公司；Realtime PCR以GAPDH为内参，引物如下：

NS5上游引物：5'-TGGGGGGTGGAACAGGAGA-3'，

NS5下游引物：5'-AGTTACAGCACTCCAGGTGTAG-3'；

GAPDH上游引物：5'-AAGGCTGTGGGCAAGG-3'，

GAPDH下游引物：5'-TGGAGGAGTGGGTGTCG-3'。

结果见图1-2，当加入NLRP3蛋白液浓度小于4μg/mL，基本不表现抗病毒效果，但是当浓度达到8μg/mL以后，ZIKV病毒NS5的mRNA水平和未加NLRP3蛋白的阴性对照相比有显著下降，并且随着加入蛋白液浓度的升高呈剂量依赖(图1)；图2结果显示，随着加入蛋白液量浓度的升高(8、16μg/mL)，ZIKV病毒NS5的蛋白水平梯度下降，说明NLRP3蛋白具有抗ZIKV病毒的效果。

(7)NLRP3对ZIKV病毒感染药物的治疗或预防作用:

经24-48h培养宫颈癌细胞(HeLa细胞)长满单层时(DDDMEM培养基+10％(体积比)胎牛血清培养)，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。将NLRP3蛋白液用无血清的DDDMEM细胞培养液逐倍稀释。稀释后再把不同浓度的NLRP3蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μL，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒感染剂量为MOI＝5，加培养液)。NLRP3蛋白液孵育1h后，弃去上清，加入用无血清的DDMEM细胞培养液稀释的病毒，感染剂量为MOI＝5，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养48h，加入20μL/孔

AQueous One SolutionReagent继续孵育4h，终止培养。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(NLRP3蛋白液处理组OD值－病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值－病毒对照组OD值)×100％。结果见表2。

表2 NLRP3对ZIKV病毒感染药物的治疗或预防作用

NLRP3蛋白液浓度(μg/mL)	细胞存活率(％)
		细胞对照组	100
病毒对照组	0
		40	92.13
20	84.26
		10	23.05
5	4.68

结果表明，细胞在NLRP3提前孵育后，再被病毒感染，存活率也是明显高于病毒对照组的，并且随着NLRP3蛋白液浓度的增高，对ZIKV的感染药物的治疗或预防作用越为明显。上述数据显示NLRP3在浓度为大于5μg/mL，具有治疗或预防病毒感染作用。

Claims

1.一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在制备抑制寨卡病毒复制的药物中的应用。