CN107190023B - 一种筛选炎性体nlrp3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选炎性体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器，属于药物筛选技术领域。本发明通过转基因手段构建了一种细胞荧光传感器，将NLRP3启动子核心区与ZSGREEN基因插入质粒载体，转入Thp‑1细胞得到稳转细胞系；该稳转细胞系在接受到NLRP3炎性体的刺激后，会发出绿色荧光，采用宽场成像高内涵捕捉荧光细胞。该荧光传感器可以实现两个目的，第一，快速高效的发现可以引起NLRP3高表达的物质，第二，在NLRP3激活剂的作用下，可以快速高效的发现抑制NLRP3激活的物质。并且，宽场成像高内涵可以高通量的拍摄荧光图像，极大的提高了筛药的效率。本发明方法可以用于以NLRP3炎性体为靶点的药物的初筛，也可以用于对NLRP3炎性体的科学研究。

Description

一种筛选炎性体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器
技术领域
本发明涉及一种筛选炎性体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器，属于药物筛选技术领域。
背景技术
炎症是指机体对于外界刺激而利用系统的活体自制对外界致炎因子产生防御的一种十分重要而又常见的病理过程，起基本病变主要表现为组织的变质、渗出和增生，以体表炎症最为典型，其主要特征为患病部位发红、发热、肿胀及局部功能性障碍。正常情况下炎症反应能够清楚外来物质，并使受损组织得以修复和愈合，但在一些病理情况下，例如有害物质持续存在时，炎症反应反应也会导致对自身组织的攻击，甚至促进疾病的发生。常见的炎症类疾病有很多，如哮喘、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肾小球肾炎、肠胃炎、脓毒症等，另外炎症过程中产生的炎症微环境对肿瘤的发生和转移也具有一定的促进作用。炎症过程中涉及众多细胞因子和炎症介质的分泌、释放，这些炎症因子对炎症过程具有极大的推动作用。研究发现，长期、慢性持续性的炎症是胰岛素抵抗、某些心脑血管疾病、糖尿病、阿兹海默症等慢性疾病的诱因，可是说，炎症相关疾病是困扰人类多年的医学难题。
个体反应的基础是细胞及分子层面的改变，从炎症的细胞基础角度出发，致炎因素通过激活细胞内特定的受体和通路引发炎症因子的释放，如Toll样受体、Nod样受体，炎症因子又反过来继续刺激参与炎症反应的细胞。从细胞和分子层面研究炎症反应有助于我们了解炎症反应的实质，更有助于促使我们发现抗炎药物及其机理。NLRP3是NOD样受体家族的一名成员，属于先天性免疫系统中的模式识别受体，当其被激活后，与接头蛋白ASC和半胱天冬酶-1(Caspase-1)形成复合体，该复合体被称为炎性小体(Inflammasome)3，炎性小体的概念由Tschopp研究小组于2002年首次提出，在自2002至今为止的15年时间中，国际上对于炎性小体的研究成果与数量成指数型增长，而在国内，对于炎性小体相关疾病、原理的研究相对较少，水平落后于国际同领域研究者。在炎性小体NLRP3这个分子平台上，白介素-1β(IL-1β)被剪切成熟而后释放出细胞，炎性小体NLRP3的激活离不开其重要组成部分NLRP3的大量转录和翻译，可以说，NLRP3的大量转录和翻译是炎性小体NLRP3激活并组成聚合体最重要的一步。NLRP3炎性体的激活剂包括病原相关分子模式和毁坏相关分子模式，前者包括脂多糖(LPS)、病毒DNA等，后者则包括三磷酸腺苷(ATP)、β-淀粉样蛋白等。研究发现，在许多炎症相关的疾病中，都存在NLRP3炎性体的激活。以炎性小体为靶点进行药物的筛选是目前抗炎药物研发的发展方向，然而，目前在研究炎性小体3的激活与抑制时，所使用的手段主要是Western、RT-PCR等，这些方法操作繁琐、要求操作者必须具备一定的专业素质，进行一次Western实验通常需要两天时间，抗体等试剂耗材价格昂贵，同一批次处理量少，最多只能操作个位数个样本，显然这样的方法不适合也无法用于NLRP3干预剂的筛选。
细胞是形成有机体形态和功能的基本组成单位，对研究机体结构和探索生命活动具有重要意义。细胞传感技术以活细胞作为探测元件，通过对活细胞的基本生理性质或细胞对被测物的响应进行检测，从而定性定量地确定细胞的生理状态或被检物的含量。因此，细胞传感技术对于研究细胞的结构和功能、探索生命的活动和规律、疾病的诊断和治疗、药物的设计和筛选、食品安全的监督和检测等都具有十分重大的意义。随着生命工程技术的发展与信息技术的飞跃，各学科间的交叉融合，使得细胞传感检测研究得到了飞速发展，新型的纳米材料、荧光及电化学细胞传感器不断问世，极大推动了生物传感技术地迅猛发展。
目前的荧光传感器多用于毒性评价、毒物检测等。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明提供了一种可以实时的、无抗体的、可视化的方法来反映NLRP3在细胞内的状态的方法，通过融合NLRP3启动子核心区与绿色荧光蛋白基因，通过病毒转染将外来基因整合到宿主细胞，当外来刺激引起NLRP3的激活时，其启动子将启动绿色荧光蛋白的表达，因此绿色荧光蛋白实时地呈现出NLRP3的激活与抑制情况。
本发明建立了一种筛选炎性小体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器的构建及应用，并成功发现了一种多酚B具有抑制NLRP3炎性体激活的作用。本发明通过转基因手段构建了一种细胞荧光传感器，Thp-1细胞是人单核巨噬细胞，发明人将NLRP3启动子核心区与绿色荧光蛋白(ZSGREEN)基因插入质粒载体，转入Thp-1细胞并进行筛选，筛选得到的细胞即为稳转细胞系，该稳转细胞系在接受到NLRP3炎性体的刺激后，会发出绿色荧光，采用宽场成像高内涵捕捉荧光细胞。该荧光传感器可以实现两个目的，第一，快速高效的发现可以引起NLRP3高表达的物质，第二，在NLRP3激活剂的作用下，可以快速高效的发现抑制NLRP3激活的物质。并且，宽场成像高内涵可以高通量的拍摄荧光图像，极大的提高了筛药的效率。该方法可以用于以NLRP3炎性体为靶点的药物的初筛，也可以用于对NLRP3炎性体的科学研究。
本发明的第一个目的是提供一种含有NLRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因(ZsGreen)的重组载体质粒。
在一种实施方式中，所述NLRP3受体核心启动子区的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
在一种实施方式中，所述重组载体质粒是将NLRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因融合后，转化到载体中得到的。
在一种实施方式中，所述绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
在一种实施方式中，NLRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因融合后的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
在一种实施方式中，所述重组质粒是在pHBLV-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体(购买于汉恒生物科技(上海)有限公司)的基础上构建得到的，命名为NLRP3-GRE。
在一种实施方式中，所述重组载体质粒的构建方法是：确定NLRP3受体目的基因和ZSGREEN基因的序列后，合成模板DNA，分段设计引物，引物为(如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:7所示)：NLRP3-claI-EcoRI-F:gcagagatccagtttatcgatATGCTGGGGAAGTGTGTCT；zsGREE(NNLRP3)-r:ccgtgcttggactgggccaTggtggcATGGAGGGAAAAATATGCAA；zsGREE(NNLRP3)-f:CCCTCCATgccaccAtggcccagtccaagcacgg；NLRP3-claI-EcoRI-R:agaactagtctcgaggaattcttagggcaaggcggagc，大量扩增目的序列，将得到的目的序列与质粒连接。将得到的质粒转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，感受态细胞于培养液中培养过夜后收集、抽提质粒，对抽提得到的质粒进行测序，测序符合预期则证明质粒构建成功，可以进行下一步。
本发明的第二个目的是提供含有NLRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因的NLRP3稳转细胞系。
在一种实施方式中，所述稳转细胞系的构建，是将含有NLRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因的质粒进行慢病毒的包装，得到含目的质粒的慢病毒液，然后使用获得的含目的质粒的慢病毒液对Thp-1细胞进行感染，筛选获得稳转细胞系。
在一种实施方式中，所述慢病毒的包装主要通过首先将质粒通过脂质体转染的方法转入HEK293T细胞，转染进行48-72h后，收集细胞培养上清液，离心后过滤去沉淀，即为所述含目的质粒的慢病毒液。
在一种实施方式中，所述对Thp-1细胞进行感染，具体是：将Thp-1细胞按照2.5×105/mL接种于12孔板，由于Thp-1细胞感染难度较高，故采取感染复数100MOI进行感染，加入150μL的病毒液感染三天后，加入1μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，每两天更换一次新鲜培养液，每三天将嘌呤霉素的浓度提高一倍，连续筛选10天即得到稳转细胞系(NLRP3-Thp-1)。
本发明的第三个目的是提供一种荧光细胞传感器，所述荧光细胞传感器为一种筛选炎性小体NLRP3激活剂或抑制剂的荧光细胞传感器；通过构建含目的基因的质粒，通过病毒转染的手段将质粒转染进目的细胞，筛选出稳转细胞系后，加入NLRP3炎性体激活剂或同时加入NLRP3激活剂和抑制剂，运用宽场高内涵成像设备捕获荧光信号，实现激活剂和/或抑制剂到荧光信号的传感。
在一种实施方式中，所述目的基因的序列为含有NLRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因的序列。
在一种实施方式中，所述目的基因的序列如SEQ ID NO:3所示。
在一种实施方式中，在宽场成像高内涵仪器下捕获到绿色荧光信号，激发波长490nm，发射波长530nm。
本发明的第四个目的是提供一种筛选炎性小体NLRP3激活剂和/或抑制剂的方法，所述方法是在本发明的稳转细胞系培养液中加入一定浓度的待测试剂，在宽场成像高内涵下连续拍摄，观察细胞荧光变化。
在一种实施方式中，所述方法是筛选炎性小体NLRP3激活剂，如果细胞荧光比不添加待测试剂的培养液相比增强，就代表加入的待测试剂为炎性小体NLRP3激活剂。
在一种实施方式中，所述细胞荧光比不添加待测试剂的培养液相比增强是指平均细胞荧光比不添加待测试剂的培养液的空白对照来说，产生了有统计学意义的增强。
在一种实施方式中，所述方法是筛选炎性小体NLRP3抑制剂，是先在稳转细胞系培养液中加入NLRP3激活剂，刺激炎性小体NLRP3的激活；然后加入一定浓度的待测试剂，如果观察到细胞荧光比起添加NLRP3激活剂的对照组出现了下降，就代表加入的待测试剂为炎性小体NLRP3抑制剂。
在一种实施方式中，所述方法是筛选炎性小体NLRP3抑制剂，是先在稳转细胞系培养液中加入NLRP3激活剂，刺激炎性小体NLRP3的激活，此时可以观察到平均细胞荧光比没有添加激活剂的空白对照相比出现有统计学意义的增强；然后加入一定浓度的待测试剂，如果观察到平均细胞荧光比添加了NLRP3激活剂的对照组出现了有统计学意义的下降，就代表加入的待测试剂为炎性小体NLRP3抑制剂。
在一种实施方式中，所述方法是筛选炎性小体NLRP3抑制剂，是将本发明的细胞传感器应用于由脂多糖(LPS)所刺激引起的炎性小体NLRP3的激活下，寻找相应的抑制剂。
在一种实施方式中，所述炎性小体NLRP3的激活是通过在细胞培养液中加入100ng/mL的LPS，在宽场成像高内涵下连续拍摄24h，观察细胞荧光变化。
在一种实施方式中，所述对LPS引起的NLRP3的激活的抑制是通过在细胞培养液中加入100ng/mL的LPS和不同浓度的多酚，在宽场成像高内涵下连续拍摄24h，观察细胞荧光变化。
在一种实施方式中，所述方法是在宽场成像高内涵仪器下捕获到绿色荧光信号，激发波长490nm，发射波长530nm。
在一种实施方式中，所述的宽场成像高内涵可以同时拍摄大量荧光图像，并同时计算荧光均值，通过比较荧光均值，可以筛选出NLRP3炎性小体激活剂及抑制剂。
在一种实施方式中，所述荧光变化的观察通过分析软件进行分析。
本发明还发现了一种新的炎性小体NLRP3抑制剂光甘草定。
本发明的优点和效果：
本发明的荧光传感器可以实现两个目的，第一，快速高效的发现可以引起NLRP3高表达的物质，第二，在NLRP3激活剂的作用下，可以快速高效的发现抑制NLRP3激活的物质。并且，宽场成像高内涵可以高通量的拍摄荧光图像，极大的提高了筛药的效率。本发明方法可以用于以NLRP3炎性体为靶点的药物的初筛，也可以用于对NLRP3炎性体的科学研究。
附图说明
图1：pHBLV-CMV-MCS-EF1-Puro载体图谱；
图2：NLRP3单克隆鉴定PCR产物；其中，Lane 1-8：NLRP3单克隆鉴定PCR产物(Marker从上至下依次为：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；
图3：病毒感染前后细胞生长曲线；
图4：LPS引起稳转细胞系荧光变化。
具体实施方案
下面是对本发明进行具体描述。
实施例1 NLRP3-GRE载体质粒的构建
1、目的是NLRP3核心启动子区与zsGREEN连接，然后以ClaI/EcoRI双酶切构入pHBLV-CMVIE-EF1-Puro，载体图谱如图1所示。由于是将两段单独的序列拼接在一起共同形成一段序列，需分段设计引物，然后以PCR出的片段为模板进行全长PCR反应。其引物设计如下：
NLRP3-claI-EcoRI-F:gcagagatccagtttatcgatATGCTGGGGAAGTGTGTCT
zsGREE(NNLRP3)-r:ccgtgcttggactgggccaTggtggcATGGAGGGAAAAATATGCAA
zsGREE(NNLRP3)-f:CCCTCCATgccaccAtggcccagtccaagcacgg
NLRP3-claI-EcoRI-R:agaactagtctcgaggaattcttagggcaaggcggagc
2、pHBLV-CMVIE-EF1-Puro载体用EcoRI、ClaI酶切，酶切体系如下：
40ul酶切体系(2ul 400ng/ul的载体、1ul EcoRI酶、1ul ClaI酶、4ul 10×buffer、32ul H2O)，于37度2小时左右。载体酶切完成后胶回收
3、NLRP3片段PCR回收
PCR扩增NLRP3序列，体系(50ul)如表1。
表1
PCR程序如表2。
表2
4、处理好的目的片段与载体连接反应体系(20ul)如表3。
表3
以上连接液在16℃过夜。
得到构建好的重组质粒。
实施例2 含有质粒NLRP3-GRE的慢病毒的包装
1、载体质粒在大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中进行大量扩增
(1)从-70℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
(2)加入质粒5μg DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
(3)42℃水浴中热击90秒，热激过程中不要移动离心管，热击后迅速置于冰上冷却3-5钟。
(4)向管中加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，吸打混匀后于37℃，220rpm摇床振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
(5)将上述菌液摇匀后，离心，去除900μL上清，余下培养基吸打混匀后取100μL涂布于含抗生素的筛选平板上。
(6)平板正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
(7)转化后的NLRP3平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。NLRP3单克隆PCR鉴定结果见图2。NLRP3序列片段大小与预测一致，说明已成功扩增出重组质粒。最终重组质粒中含有序列为SEQ ID NO:3的含有LRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因的序列。
(8)测序结果无误后，抽提收集质粒。
2、慢病毒的包装
(1)第一天：用无抗生素DMEM+10％胎牛血清FBS铺板HEK293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80％-90％融合度。
(2)第二天：500ul无血清DMEM培养基稀释2μg表达质粒+1.5μgpsPAX2+1.5μgpMD2.G；
500μL无血清培养基稀释15μL脂质体2000。5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min。从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。5.6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10％FBS。
(3)第三天：转染24h后，转染效率应达到70％以上。
(4)第四天：转染后48和72h分别收获含病毒的上清。3000rpm离心20min，0.45μm滤膜过滤，去除细胞沉淀。12000rpm离心浓缩、分装-80℃贮存。所得到的病毒液将用于后续的细胞感染、稳转细胞系的构建。
实施例3 稳转细胞系的构建
1、慢病毒感染Thp-1细胞
用无抗生素1640+2％胎牛血清FBS铺板Thp-1细胞，细胞密度为2.5×105/mL，取500μL细胞悬液加入12孔板，8字晃动12孔板使细胞均匀；加入150μL慢病毒液，用封口膜封住12孔板
后置于平板离心机中，1500rpm离心60min，离心结束后取下封口膜置于培养箱中继续感染3h；3h感染后再加入500μL培养液，继续感染8h；感染后12h，更换无病毒的完全1640培养液。
2、筛选稳转细胞系
感染72-96h后，可以开始筛选。将细胞培养液更换为含有1μg/mL嘌呤霉素的完全1640培养液，每两天对细胞换液，每三天提高一次嘌呤霉素的浓度；筛选10天后，所得到的细胞为稳转细胞系，命名为NLRP3-Thp-1细胞。
3、细胞生长曲线判断细胞活力
将筛选后的细胞与未经任何处理的细胞分别以1×105cells/mL种于细胞培养瓶中，每2-3天更换完全1640培养液，连续培养七天，每天用台盼蓝拒染法计数细胞，绘制生长曲线。
细胞生长曲线如图3所示，所筛选出的细胞生长速度与未转染细胞基本一致，随着时间的推移，筛选后的细胞生长速率略低于未处理细胞，但对后期实验影响不大，由此可以证明，经转染、筛选后的细胞活性正常。
实施例4 脂多糖(LPS)所刺激引起的炎性小体NLRP3的激活下，寻找相应的抑制剂
1、LPS引起炎性小体NLRP3的激活导致细胞荧光的变化
将获得的稳转细胞系NLRP3-Thp-1按照2×105/mL铺板于96孔板，每孔加入200μL培养液，培养液中含有50ng/mL的PMA刺激使NLRP3-Thp-1细胞贴壁。48h后，细胞完全贴壁，换含有100ng/mL的LPS的完全1640培养液，置于宽场高内涵仪器下，连续拍摄24h，每一小时获得一次荧光图像。荧光图像及平均细胞荧光折线图如图4所示，由图中可以看出，LPS刺激细胞引起了平均细胞荧光的加强，说明LPS引起了NLRP3的激活，同时，当时间推移至11h时，LPS引起的细胞荧光强度的变化趋于稳定。
2、多酚对LPS引起的NLRP3炎性体的激活的干预
将获得的稳转细胞系NLRP3-Thp-1按照2×105/mL铺板于96孔板，每孔加入200μL培养液，培养液中含有50ng/mL的PMA刺激使NLRP3-Thp-1细胞贴壁。48h后，细胞完全贴壁，换含有100ng/mL的LPS和不同浓度的光甘草定(标准品)完全1640培养液，置于宽场高内涵仪器下，连续拍摄24h，每一小时获得一次荧光图像。结果显示10小时时，LPS刺激细胞荧光达到最强，而光甘草定与LPS共同作用的细胞的荧光强度比之前者，有着有统计学意义的降低，说明光甘草定抑制了LPS导致的NLRP3的激活。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种筛选炎性体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1099
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctgggga agtgtgtctt ttagtcatct attttgttgt ctttgtcttt gtctgactga 60
aacaagtgat ggaagacatg gtctcatatc tctggtcaaa atcctggctc tgttccttcc 120
tggttctaaa cccctcggca ggcttcctag tccccctaag actcagttta tgcatctata 180
aaatggggct aggaataggt gcacctcata gagctctgtg caggttagat ggggaaaaac 240
atcagtgagt gcctagcctg tggaaagctc taaattaatg tgaattataa tgataacaat 300
tgcgaatttt gcaaggagac attaaaggat gtatgttttt atttatttta ttttattcta 360
ttttattttt tgagatggag ttttgctctt attgcccagg ctggagtgca gtggtgtgat 420
cttggctcat cgcaacctcc gcctcctggg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg 480
agtagctggg attacaggtg cctggtacca tgcccggtta atttttgtat ttttagtaga 540
gacgggattt ctccctgttg tttggtgagc ctggtctcca actcctgacc tcaggtgatc 600
cgcccacctc ggcctcccaa agtgctggga ttacagggat gtatgttttt attattctcc 660
attatgcact cccagcttca tctcacttca atccactggt tgatagaagt gcagtcaaag 720
actgtcccct cctctgcaag cttttatgtt ctctctcctc tctccctagc cacgtcctgt 780
tctgttatca acacacttac tcacctcctg gccttctcct tctattgtct ctcatccctc 840
ttccctcaca aaaacagaag caaagagcca gagccttcag tttggaggaa ctgaaaacat 900
tctcttctgc tttctcattt tgtagatgag gaaactgaag ttgaggaata gtgaagagtt 960
tgtccaatgt catagccccg taatcaacgg gacaaaaatt ttcttgctga tgggtcaaga 1020
tggcatcgtg aagtggttgt tcaccgtaaa ctgtaataca atcctgttta tggatttgtt 1080
tgcatatttt tccctccat 1099
<210> 2
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggcccagt ccaagcacgg cctgaccaag gagatgacca tgaagtaccg catggagggc 60
tgcgtggacg gccacaagtt cgtgatcacc ggcgagggca tcggctaccc cttcaagggc 120
aagcaggcca tcaacctgtg cgtggtggag ggcggcccct tgcccttcgc cgaggacatc 180
ttgtccgccg ccttcatgta cggcaaccgc gtgttcaccg agtaccccca ggacatcgtc 240
gactacttca agaactcctg ccccgccggc tacacctggg accgctcctt cctgttcgag 300
gacggcgccg tgtgcatctg caacgccgac atcaccgtga gcgtggagga gaactgcatg 360
taccacgagt ccaagttcta cggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt gatgaagaag 420
atgaccgaca actgggagcc ctcctgcgag aagatcatcc ccgtgcccaa gcagggcatc 480
ttgaagggcg acgtgagcat gtacctgctg ctgaaggacg gtggccgctt gcgctgccag 540
ttcgacaccg tgtacaaggc caagtccgtg ccccgcaaga tgcccgactg gcacttcatc 600
cagcacaagc tgacccgcga ggaccgcagc gacgccaaga accagaagtg gcacctgacc 660
gagcacgcca tcgcctccgg ctccgccttg ccctaa 696
<210> 3
<211> 1801
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgctgggga agtgtgtctt ttagtcatct attttgttgt ctttgtcttt gtctgactga 60
aacaagtgat ggaagacatg gtctcatatc tctggtcaaa atcctggctc tgttccttcc 120
tggttctaaa cccctcggca ggcttcctag tccccctaag actcagttta tgcatctata 180
aaatggggct aggaataggt gcacctcata gagctctgtg caggttagat ggggaaaaac 240
atcagtgagt gcctagcctg tggaaagctc taaattaatg tgaattataa tgataacaat 300
tgcgaatttt gcaaggagac attaaaggat gtatgttttt atttatttta ttttattcta 360
ttttattttt tgagatggag ttttgctctt attgcccagg ctggagtgca gtggtgtgat 420
cttggctcat cgcaacctcc gcctcctggg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg 480
agtagctggg attacaggtg cctggtacca tgcccggtta atttttgtat ttttagtaga 540
gacgggattt ctccctgttg tttggtgagc ctggtctcca actcctgacc tcaggtgatc 600
cgcccacctc ggcctcccaa agtgctggga ttacagggat gtatgttttt attattctcc 660
attatgcact cccagcttca tctcacttca atccactggt tgatagaagt gcagtcaaag 720
actgtcccct cctctgcaag cttttatgtt ctctctcctc tctccctagc cacgtcctgt 780
tctgttatca acacacttac tcacctcctg gccttctcct tctattgtct ctcatccctc 840
ttccctcaca aaaacagaag caaagagcca gagccttcag tttggaggaa ctgaaaacat 900
tctcttctgc tttctcattt tgtagatgag gaaactgaag ttgaggaata gtgaagagtt 960
tgtccaatgt catagccccg taatcaacgg gacaaaaatt ttcttgctga tgggtcaaga 1020
tggcatcgtg aagtggttgt tcaccgtaaa ctgtaataca atcctgttta tggatttgtt 1080
tgcatatttt tccctccatg ccaccatggc ccagtccaag cacggcctga ccaaggagat 1140
gaccatgaag taccgcatgg agggctgcgt ggacggccac aagttcgtga tcaccggcga 1200
gggcatcggc taccccttca agggcaagca ggccatcaac ctgtgcgtgg tggagggcgg 1260
ccccttgccc ttcgccgagg acatcttgtc cgccgccttc atgtacggca accgcgtgtt 1320
caccgagtac ccccaggaca tcgtcgacta cttcaagaac tcctgccccg ccggctacac 1380
ctgggaccgc tccttcctgt tcgaggacgg cgccgtgtgc atctgcaacg ccgacatcac 1440
cgtgagcgtg gaggagaact gcatgtacca cgagtccaag ttctacggcg tgaacttccc 1500
cgccgacggc cccgtgatga agaagatgac cgacaactgg gagccctcct gcgagaagat 1560
catccccgtg cccaagcagg gcatcttgaa gggcgacgtg agcatgtacc tgctgctgaa 1620
ggacggtggc cgcttgcgct gccagttcga caccgtgtac aaggccaagt ccgtgccccg 1680
caagatgccc gactggcact tcatccagca caagctgacc cgcgaggacc gcagcgacgc 1740
caagaaccag aagtggcacc tgaccgagca cgccatcgcc tccggctccg ccttgcccta 1800
a 1801
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagagatcc agtttatcga tatgctgggg aagtgtgtct 40
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgtgcttgg actgggccat ggtggcatgg agggaaaaat atgcaa 46
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccctccatgc caccatggcc cagtccaagc acgg 34
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agaactagtc tcgaggaatt cttagggcaa ggcggagc 38

Claims (4)

1.一种筛选炎性小体NLRP3抑制剂的方法，其特征在于，所述方法是在稳转细胞系培养液中加入一定浓度的待测试剂，在宽场成像高内涵下连续拍摄，观察细胞荧光变化；所述稳转细胞系的构建，是将含有NLRP3受体核心启动子区和绿色荧光蛋白基因的质粒进行慢病毒的包装，得到含目的质粒的慢病毒液，然后使用获得的含目的质粒的慢病毒液对Thp-1细胞进行感染，筛选获得稳转细胞系；所述慢病毒的包装主要通过首先将质粒通过脂质体转染的方法转入HEK293T细胞，转染进行48-72h后，收集细胞培养上清液，离心后过滤去沉淀，即为所述含目的质粒的慢病毒液；所述对Thp-1细胞进行感染，具体是：将Thp-1细胞按照2.5×105/mL接种于12孔板，采取感染复数100MOI进行感染，加入150μL的病毒液感染三天后，加入1μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，每两天更换一次新鲜培养液，每三天将嘌呤霉素的浓度提高一倍，连续筛选10天即得到稳转细胞系；所述抑制剂为光甘草定；所述NLRP3受体核心启动子区的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是筛选炎性小体NLRP3抑制剂，是先在稳转细胞系培养液中加入NLRP3激活剂，刺激炎性小体NLRP3的激活；然后加入一定浓度的待测试剂，如果观察到细胞荧光比起添加NLRP3激活剂的对照组出现了下降，就代表加入的待测试剂为炎性小体NLRP3抑制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述NLRP3激活剂为脂多糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是在宽场成像高内涵仪器下捕获绿色荧光信号，激发波长490nm，发射波长530nm。
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Initial description of the human NLRP3 promoter;JP Anderson等;《Genes Immun》;20080821;第9卷(第8期);第721-726页 *
LPS 激活巨噬细胞NLRP3炎性小体的作用研究;牟娜娜等;《热带医学杂志》;20150430;第15卷(第4期);第441-445页 *
NLRP3 inflammasome expression is driven by NF-κB in cultured hepatocytes;Sorina GeorgianaBoaru等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20150313;第458卷(第3期);第700-706页 *

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