CN117305452A - 人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 - Google Patents
人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117305452A CN117305452A CN202311254111.0A CN202311254111A CN117305452A CN 117305452 A CN117305452 A CN 117305452A CN 202311254111 A CN202311254111 A CN 202311254111A CN 117305452 A CN117305452 A CN 117305452A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- snrk
- mrna
- human
- seq
- nsclc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 72
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 title claims abstract description 66
- 101000617778 Homo sapiens SNF-related serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000052684 human SNRK Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102100022010 SNF-related serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 claims abstract 13
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 101150042690 Snrk gene Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 abstract description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 4
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 4
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241001116468 Cunninghamia Species 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000003849 large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒。本发明首次发现人SNRK mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达水平相较于癌旁正常肺组织明显下调，并设计出能够特异性识别NSCLC肿瘤组织与临近正常组织中SNRK mRNA水平的引物对，以及特异性上调SNRK mRNA表达水平的外源性人SNRK mRNA表达质粒。并且通过实验明确了SNRK mRNA在NSCLC肿瘤组织中的异常下调与患者不良预后密切相关；同时发现应用外源性人SNRK mRNA表达质粒恢复NSCLC细胞中SNRK mRNA表达水平能够显著抑制其增殖、迁移与侵袭能力，提出了SNRK mRNA在NSCLC诊断、靶向治疗和预后评估中的用途，尤其是在制备NSCLC诊断、靶向治疗和预后评估产品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒，属于生物医学技术领域。
背景技术
肺癌是最常见的人类恶性肿瘤之一，并且已成为癌症相关死亡的首要病因，给人类健康带来了巨大威胁。肺癌主要分为两大类，即小细胞肺癌与非小细胞肺癌(Non-smallcell lung cancer，NSCLC)。NSCLC最为常见，约占所有肺癌确诊病例的85％，主要包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞癌。近年来，随着测序技术的发展与靶向药物的临床应用，部分中晚期的NSCLC患者获得了确切的生存收益，但由于NSCLC肿瘤的高异质性与恶性进展的复杂性，仍有相当多的NSCLC患者缺乏有效治疗靶点和预后评估手段。因此，进一步探究NSCLC发生、发展进程中的关键驱动基因，对于NSCLC诊断、靶向治疗和预后评估具有重要意义。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于体外检测目的基因mRNA表达水平的技术。该技术以碱基互补配对原则为基础合成DNA片段，在靶基因mRNA表达水平检测方面展现出了非常高的敏感性与特异性。PCR包括逆转录与实时荧光定量两大步骤，其中特异性识别目的mRNA逆转录产物(cDNA片段)的引物对是准确定量目的基因mRNA表达水平的关键所在。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒。
本发明的技术方案如下：
检测人SNRK mRNA表达水平的试剂在制备非小细胞肺癌诊断和预后评估产品中的应用。
根据本发明优选的，所述SNRK mRNA的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
根据本发明优选的，所述检测人SNRK mRNA表达水平的试剂包括特异性识别人SNRK mRNA逆转录产物cDNA的物质；
所述特异性识别人SNRK mRNA逆转录产物cDNA的物质为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。
根据本发明优选的，所述检测人SNRK mRNA表达水平的试剂的检测样本选自细胞、组织、血浆或血清。
特异性上调SNRK mRNA表达水平的物质在制备靶向治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
根据本发明优选的，所述SNRK mRNA的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
根据本发明优选的，所述特异性上调SNRK mRNA表达水平的物质为外源性人SNRKmRNA表达质粒。
进一步优选的，所述特异性上调SNRK mRNA表达水平的外源性人SNRK mRNA表达质粒含有SNRK基因编码序列；所述SNRK基因编码序列如SEQ ID NO.4所示。
一种非小细胞肺癌诊断和预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增SNRKmRNA逆转录产物cDNA的引物对；
所述特异性扩增SNRK mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。
根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。
一种非小细胞肺癌靶向治疗药物，所述药物包括特异性上调SNRK mRNA表达水平的外源性人SNRK mRNA表达质粒；
所述外源性人SNRK mRNA表达质粒含有SNRK基因编码序列；所述SNRK基因编码序列如SEQ ID NO.4所示。
有益效果：
本发明首次发现人SNRK mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达水平相较于癌旁正常肺组织明显下调，并设计出能够特异性识别NSCLC肿瘤组织与临近正常组织中SNRK mRNA水平的引物对，以及特异性上调SNRK mRNA表达水平的外源性人SNRK mRNA表达质粒。并且通过实验明确了SNRK mRNA在NSCLC肿瘤组织中的异常下调，且与患者不良预后密切相关；同时发现应用外源性人SNRK mRNA表达质粒恢复NSCLC细胞中SNRK mRNA表达水平能够显著抑制其增殖、迁移与侵袭能力。因此，本发明以SNRK mRNA作为NSCLC诊断、预后评估的生物标志物与NSCLC治疗的靶点，提出了SNRK mRNA在NSCLC诊断、靶向治疗和预后评估中的用途，尤其是在制备NSCLC诊断、靶向治疗和预后评估产品中的应用。
附图说明
图1为应用本发明提供的引物对与逆转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测20对NSCLC肿瘤组织与临床正常肺组织中SNRK mRNA表达水平，以临近正常肺组织中SNRKmRNA表达水平为参照，计算SNRK mRNA在NSCLC肿瘤组织中的相对表达水平，并应用成对t检验分析表达差异统计学意义。
图2应用受试者工作特性曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)评估SNRK mRNA表达水平在NSCLC诊断中的特异性与敏感性。
图3为应用本发明提供的外源性人SNRK mRNA表达质粒(SNRK)和空载体质粒(Vector)，分别转染至NSCLC细胞系(A549细胞)中，应用CCK-8实验评估细胞增殖能力的示意图；应用单向方差检验验证组间差异的统计学意义。
图4为应用本发明提供的外源性人SNRK mRNA表达质粒(SNRK)或空载体质粒(Vector)，分别转染至NSCLC细胞系(A549细胞)中，应用Transwell实验检测细胞迁移(左图)与侵袭(右图)能力的示意图；应用Student’s t检验组间差异的统计学意义。
图5为本发明应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析NSCLC患者肿瘤组织中SNRKmRNA表达水平对其预后影响的示意图；应用Log-rank检验明确SNRK mRNA高表达与低表达的NSCLC患者组之间预后差异的统计学意义。
图6为应用本发明提供的引物对与逆转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测20例NSCLC肿瘤组织SNRK mRNA表达水平，并应用Kaplan-Meier法分析SNRK mRNA表达水平对NSCLC患者预后的影响，组间差异的统计学意义通过Log-rank检验明确。
具体实施方式
下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例中所设计的非小细胞肺癌病人手术标本收集与检测是经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，所有病例都得到了患者的知情同意。
人源非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
实施例1
收集20对手术切除的非小细胞肺癌标本(包括肿瘤及其临近正常组织)，从样本中提取总RNA，应用本发明提供的引物对与逆转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测SNRKmRNA表达水平，所用特异性识别SNRK mRNA逆转录产物cDNA的引物对序列如SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示，检测结果如图1所示。
由图1可知，NSCLC肿瘤组织中SNRK mRNA表达水平显著低于邻近正常肺组织，这表明SNRK mRNA可能成为NSCLC潜在的诊断标志物，本发明提供的引物对也可以应用于NSCLC的诊断。
上述入组的20例患者术后病理结果均证实为NSCLC，且术前均未接受过放化疗或免疫治疗。
具体实施过程如下：
(1)样本收集：20对手术切除的NSCLC标本均来自于山东大学第二医院胸外科，其中肿瘤组织均取自中心非坏死部位，邻近正常肺组织取自距离肿瘤边缘大于5cm的区域，并进行液氮速冻，-80℃保存备用；
(2)RNA提取：使用RNA-Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)试剂盒并按照说明书内所述步骤提取总RNA，应用NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度，应用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；
(3)RT-qPCR：应用lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)去除步骤(2)所提mRNA中混入的基因组DNA，并以mRNA为模版进行逆转录；应用特异性识别SNRKmRNA的引物对(SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3)与Power SYBRTMGreen PCR预混液(ThermoFisher Scientific，4367659)进行qPCR反应以检测SNRK mRNA表达水平，qPCR反应在实时荧光定量PCR仪器QuantStudioTM 5System(Thermo Fisher Scientific)中进行；再选取ACTB mRNA表达水平为内参，SNRK mRNA相对表达水平按照2-ΔΔCT法计算。应用成对t检验分析表达差异统计学意义。
其中，引物对的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-cctgccggctgaggaaaaaga-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物：5’-ccatgctggtccaacagaaga-3’(SEQ ID NO.3)。
去除基因组DNA的体系：5×gDNA Buffer 2μL，RNase-Free ddH2O 6μL，RNA(250ng/μL)2μL；反应条件：42℃孵育3分钟，然后置于冰上备用。
逆转录PCR体系：2μL lnR-RT Primer Mix，1μL lnR-RT Enzyme Mix，2μL 10×lnR-RT Buffer，5μL RNase-Free ddH2O，10μL上述基因组DNA去除体系产物；反应条件：42℃孵育15分钟，95℃孵育3分钟，4℃保存备用。
实时荧光定量PCR体系：上述逆转录体系产物1μL，引物稀释液(1μM)1μL，PowerSYBRTMGreen PCR预混液5μL，RNase-Free ddH2O 3μL。反应条件：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，62℃退火10秒，72℃延伸20秒，共40循环；95℃变性15秒，60℃孵育60秒，95℃孵育1秒。
上述步骤所用试剂均来自lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)与Power SYBRTMGreen PCR预混液试剂盒(Thermo Fisher Scientific，4367659)。
实施例2
针对实施例1中所收集的20对NSCLC样本，检测SNRK mRNA表达水平，具体方法如实施例1所述，应用受试者工作特性曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)评估SNRK mRNA表达水平在NSCLC诊断中的特异性与敏感性，检测结果如图2所示。
由图2可知，曲线下面积(Area under the ROC curve，AUC)为0.8650(95％ CI:0.7550-0.9750)。当约登指数最大时，其特异性为75％，敏感性为80％，表明SNRK mRNA对非小细胞肺癌具有良好的诊断价值。
实施例3
设计特异性上调SNRK mRNA表达水平的外源性人SNRK mRNA表达质粒(SNRK)及其空载体质粒(Vector)，SNRK质粒所含SNRK基因编码序列如SEQ ID NO.4所示，该质粒可以过表达SNRK mRNA。选取NSCLC细胞系(A549)，将SNRK以及Vector质粒分别转染至A549细胞中，然后应用如SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3的引物对进行反转录-荧光定量PCR，以检测SNRKmRNA表达水平；应用CCK-8实验检测SNRK表达上调对A549细胞增殖的影响，具体结果如图3所示。
由图3可知，外源性人SNRK mRNA表达质粒特异性上调SNRK mRNA表达水平后，能够显著抑制A549细胞的增殖能力。
具体实施过程如下：
(1)设计外源性人SNRK mRNA表达质粒(SNRK)及其空载体质粒(Vector)，SNRK质粒所含SNRK基因编码序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)消化、离心并收集A549细胞，将其铺板于6孔板中，待其生长密度达到60～70％，应用Lipofectamine 3000Reagent(Invitrogen，L3000001)转染试剂将SNRK或Vector质粒分别转染至A549细胞中，48小时后，收集细胞，部分细胞用于提取RNA，并检测SNRK表达效率，具体实验步骤以及PCR体系同实施例1；剩余细胞用于CCK-8实验；
(3)细胞计数并调整细胞浓度至20,000个/mL培养基，将细胞悬液加入96孔板中(100mL/孔)，每组铺板4个复孔，共设4组(用于起始与第1，2，3天测量)，置于细胞培养箱中2～6小时后，每孔加入10μL CCK-8试剂(TargetMol,C0005)，然后37℃孵箱中孵育1小时，简单震荡后使用酶标仪测量450nm处的吸光度值，此为铺板细胞起始吸光度值，后续24小时重复上述操作，分别记录细胞生长1天，2天，3天后的吸光度值。应用单向方差检验明确组间差异的统计学意义。
实施例4
选取A549细胞，将SNRK或Vector质粒分别转染至A549细胞中，具体实验方法同实施例3；应用Transwell实验检测外源性人SNRK mRNA表达对A549细胞迁移与侵袭能力的影响，具体结果如图4所示，图4中左图为细胞迁移结果，右图为细胞侵袭结果。
由图4可知，应用外源性人SNRK mRNA表达质粒上调A549细胞中SNRK mRNA表达水平后，能够显著削弱其细胞迁移与侵袭能力。
具体实施过程如下：
(1)设计外源性人SNRK mRNA表达质粒(SNRK)及其空载体质粒(Vector)，SNRK质粒所含SNRK基因编码序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)收集A549细胞并铺板于6孔板中，待其生长密度达到60～70％，应用Lipofectamine3000Reagent(Invitrogen，L3000001)转染试剂将SNRK或Vector分别转染至A549细胞中，置于细胞培养箱中培养48小时后，收集细胞，部分细胞用于提取RNA，应用逆转录-荧光定量PCR检测SNRK表达水平，具体实验步骤与PCR体系同实施例1；
(3)使用无血清培养基重悬剩余细胞沉淀，并调整浓度至100,000个细胞/mL培养基，向24孔板中加入完全培养基(600μL/孔)，将预先铺设基质胶或未铺设基质胶的Transwell小室(Corning，3422)放入24孔板中，将200μL细胞悬液加入至每个小室内，将24孔板小心转移至细胞培养箱中，37℃、5％CO2条件下培养48小时，弃掉培养基并用PBS清洗小室，4％多聚甲醛室温下固定15分钟，向小室内加入0.1％结晶紫并置于室温条件下过夜，PBS清洗后使用棉签去除小室内侧面附着细胞，显微镜下拍照并计数穿孔细胞。应用Student’s t检验明确组间差异的统计学意义。
实施例5
应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析SNRK mRNA表达水平对NSCLC预后的影响，具体分析结果如图5所示。
由图5可知，SNRK mRNA高表达组的NSCLC患者的总生存期显著高于低表达SNRKmRNA组的患者，这表明SNRK mRNA的表达水平能够应用于NSCLC患者的预后评估
具体实施过程如下：
应用Kaplan-Meier Plotter数据库收集2166例NSCLC患者的预后信息以及SNRKmRNA表达水平，根据SNRK mRNA表达水平的中位数将NSCLC患者分为高表达组(1074例)与低表达组(1092例)，应用Kaplan-Meier法分析SNRK mRNA高低表达两组NSCLC患者间总生存期(Overall Survival,OS)的差异，SNRK mRNA低表达组中位生存期56.5个月，SNRK mRNA高表达组的中位生存期80个月，组间生存差异的统计学意义采用Log-rank检验。
实施例6
针对实施例1中所收集的20对NSCLC样本，应用本发明提供的引物对(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)与逆转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测其SNRK mRNA表达水平，具体方法如实施例1所述，应用Kaplan-Meier法分析SNRK mRNA表达水平对NSCLC患者预后(OS)的影响，并应用Log-rank检验明确组间生存差异的统计学意义。同时收集上述20例NSCLC病人的预后随访信息，分析结果如图6所示。
由图6可知，以20例NSCLC肿瘤组织中SNRK mRNA表达水平的中位数为参照，将20例NSCLC病人分为SNRK mRNA高表达与低表达组，Kaplan-Meier法分析结果显示，SNRK mRNA高表达组患者相比于低表达组具有更长的OS。结合实施例5所得结果说明SNRK mRNA对非小细胞肺癌具有良好的预后评估价值。
以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.检测人SNRK mRNA表达水平的试剂在制备非小细胞肺癌诊断和预后评估产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNRK mRNA的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测人SNRK mRNA表达水平的试剂包括特异性识别人SNRK mRNA逆转录产物cDNA的物质；
所述特异性识别人SNRK mRNA逆转录产物cDNA的物质为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测人SNRK mRNA表达水平的试剂的检测样本选自细胞、组织、血浆或血清。
5.特异性上调SNRK mRNA表达水平的物质在制备靶向治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述SNRK mRNA的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述特异性上调SNRK mRNA表达水平的物质为外源性人SNRK mRNA表达质粒；
进一步优选的，所述特异性上调SNRK mRNA表达水平的外源性人SNRK mRNA表达质粒含有SNRK基因编码序列；所述SNRK基因编码序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种非小细胞肺癌诊断和预后评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增SNRK mRNA逆转录产物cDNA的引物对；
所述特异性扩增SNRK mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。
10.一种非小细胞肺癌靶向治疗药物，其特征在于，所述药物包括特异性上调SNRKmRNA表达水平的外源性人SNRK mRNA表达质粒；
所述外源性人SNRK mRNA表达质粒含有SNRK基因编码序列；所述SNRK基因编码序列如SEQ ID NO.4所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311254111.0A CN117305452B (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311254111.0A CN117305452B (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117305452A true CN117305452A (zh) | 2023-12-29 |
| CN117305452B CN117305452B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=89245604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311254111.0A Active CN117305452B (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117305452B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118186079A (zh) * | 2024-02-27 | 2024-06-14 | 山东大学第二医院 | 人HHIP mRNA在食管鳞状细胞癌诊断、靶向治疗中的应用及检测试剂盒与外源性表达质粒 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004005484A2 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-15 | Exelixis, Inc. | Snrks as modifiers of chk and branching morphogenesis and methods of use |
| US20100130527A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Lehrer Raphael | Individualized cancer treatment |
| US20150284735A1 (en) * | 2014-01-28 | 2015-10-08 | Academia Sinica | Skin gene silencing plasmid, and transformed plant cell and transgenic plant comprising the same |
| CN107326071A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-07 | 江门市中心医院 | Plpp4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用 |
| CN111088362A (zh) * | 2020-02-06 | 2020-05-01 | 至本医疗科技（上海）有限公司 | Swi/snf复合体相关基因变异在预测非小细胞肺癌患者对ici疗法敏感性中的应用 |
| US20200263264A1 (en) * | 2017-10-16 | 2020-08-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Markers of active hiv reservoir |
| CN114921545A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-08-19 | 山东大学第二医院 | 人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒 |
| WO2023072215A1 (zh) * | 2021-10-27 | 2023-05-04 | 蚌埠医学院第一附属医院 | 非小细胞肺癌靶点arid1a及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途 |
-
2023
- 2023-09-27 CN CN202311254111.0A patent/CN117305452B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004005484A2 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-15 | Exelixis, Inc. | Snrks as modifiers of chk and branching morphogenesis and methods of use |
| US20100130527A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Lehrer Raphael | Individualized cancer treatment |
| US20150284735A1 (en) * | 2014-01-28 | 2015-10-08 | Academia Sinica | Skin gene silencing plasmid, and transformed plant cell and transgenic plant comprising the same |
| CN107326071A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-07 | 江门市中心医院 | Plpp4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用 |
| US20200263264A1 (en) * | 2017-10-16 | 2020-08-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Markers of active hiv reservoir |
| CN111088362A (zh) * | 2020-02-06 | 2020-05-01 | 至本医疗科技（上海）有限公司 | Swi/snf复合体相关基因变异在预测非小细胞肺癌患者对ici疗法敏感性中的应用 |
| WO2023072215A1 (zh) * | 2021-10-27 | 2023-05-04 | 蚌埠医学院第一附属医院 | 非小细胞肺癌靶点arid1a及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途 |
| CN114921545A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-08-19 | 山东大学第二医院 | 人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ALI NAJAFI等: "A systems biology approach for miRNA-mRNA expression patterns analysis in non-small cell lung cancer", CANCER BIOMARK, vol. 16, no. 1, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 31 * |
| AMY K.RINES等: "Snf1-related kinase inhibits colon cancer cell proliferation through calcyclin-binding protein-dependent reduction of β-catenin", FASEB J., vol. 26, no. 11, 30 November 2012 (2012-11-30), pages 4686 * |
| CONSTANTINOS KOLLIOPOULOS等: "Transforming growth factor β (TGFβ) induces NUAK kinase expression to fine-tune its signaling output", J.BIOL.CHEM., vol. 294, no. 1, 31 March 2019 (2019-03-31), pages 4133 * |
| 李钰娜等: "miR-107靶基因的生物学分析", 长治医学院学报, vol. 33, no. 02, 15 April 2019 (2019-04-15), pages 102 - 106 * |
| 葛明建等: "肺腺癌患者淋巴转移的分子指纹鉴定", 癌症, vol. 28, no. 03, 5 March 2009 (2009-03-05), pages 262 - 267 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118186079A (zh) * | 2024-02-27 | 2024-06-14 | 山东大学第二医院 | 人HHIP mRNA在食管鳞状细胞癌诊断、靶向治疗中的应用及检测试剂盒与外源性表达质粒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117305452B (zh) | 2024-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2014003053A1 (ja) | 膵臓がんの検出方法及び検出用キット | |
| CN117305452B (zh) | 人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 | |
| CN114807372B (zh) | 人HHIPL2 mRNA在食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 | |
| CN106755344A (zh) | 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用 | |
| CN101855348A (zh) | 肝癌相关基因、以及肝癌风险的判定方法 | |
| Rao et al. | Identification of plasma exosomes long non-coding RNA HAGLR and circulating tumor cells as potential prognosis biomarkers in non-small cell lung cancer | |
| WO2018219264A1 (zh) | 一种长链非编码rna作为前列腺癌分子标志物的应用 | |
| Xu et al. | Clinical significance of lncRNA MIR31HG in melanoma | |
| CN107519193A (zh) | 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用 | |
| CN113832232A (zh) | 用于预测肺腺癌对含铂双药化疗反应性的生物标志物其及相关产品 | |
| Zhuang et al. | Proteomic characteristics reveal the signatures and the risks of T1 colorectal cancer metastasis to lymph nodes | |
| CN114921545B (zh) | 人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒 | |
| KR102194215B1 (ko) | 위암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| CN114277132B (zh) | 免疫相关的lncRNA表达谱预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后的应用 | |
| CN106755309A (zh) | 分子标记物在制备胰腺癌预后评估产品中的应用 | |
| CN113652487A (zh) | 人C11orf86 mRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒 | |
| CN113862369A (zh) | 与肺腺癌对含铂双药化疗敏感性相关的标志物及其应用 | |
| CN114908171B (zh) | 人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 | |
| CN113789381B (zh) | 人CLDN10-AS1 lncRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒 | |
| Arenberger et al. | Early detection of melanoma progression by quantitative real-time RT-PCR analysis for multiple melanoma markers | |
| CN118186079A (zh) | 人HHIP mRNA在食管鳞状细胞癌诊断、靶向治疗中的应用及检测试剂盒与外源性表达质粒 | |
| CN110541034B (zh) | Linc01992在乳腺癌诊疗中的应用 | |
| CN114015781B (zh) | 一种LncRIM基因的检测试剂盒及其应用 | |
| CN110592218B (zh) | 一种诊治乳腺癌的生物标志物 | |
| CN114908100B (zh) | 人HHIPL1 mRNA在食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |