CN114908171B - 人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人HHIPL2mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒。本发明首次设计出能够特异性敲低HHIPL2mRNA表达的siRNA以及特异性检测HHIPL2mRNA表达水平的引物对，并证实HHIPL2mRNA与非小细胞肺癌细胞恶性生物学行为以及患者不良预后密切相关。在此基础之上，本发明提出了HHIPL2mRNA在NSCLC靶向治疗与预后评估中的应用，以及本发明所设计的能够特异性敲低HHIPL2mRNA表达的siRNA以及特异性检测HHIPL2mRNA表达水平的引物对在非小细胞肺癌靶向治疗与预后评估中的应用。

Description

人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应 用及试剂盒

技术领域

本发明涉及人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

肺癌在中国男性人群癌症发病率中排名第一位，在中国女性人群癌症发病率中排名第2位，仅次于乳腺癌，同时肺癌在我国也是癌症相关死亡的首要病因。在所有肺癌确诊病例中，最常见的为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)，约占所有病例的85％。近年来，靶向治疗与免疫治疗的发展与应用给肺癌患者带来了确切的生存收益，但是适合上述治疗的NSCLC病人比例较少，且治疗过程中极易产生耐药性，这些因素严重制约着病人预后改善。因此，进一步发现具备潜在靶向治疗与预后评估价值的新标志物，对于NSCLC临床治疗策略的发展意义重大。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种以碱基互补配对原则为基础合成DNA片段的技术，具有很高的特异性与敏感性。PCR技术常用于体外检测mRNA表达水平，包括逆转录与实时荧光定量两个环节，其中设计出能够特异性识别目的mRNA逆转录cDNA片段的引物对，是准确定量目的mRNA表达水平的关键。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒。

本发明的技术方案如下：

人HHIPL2 mRNA在制备非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估产品中的应用。

根据本发明优选的，所述应用中HHIPL2 mRNA为非小细胞肺癌预后评估的生物标志物。

根据本发明优选的，所述预后评估产品用于评估非小细胞肺癌患者总生存期。

根据本发明优选的，所述应用中HHIPL2 mRNA为非小细胞肺癌靶向治疗的作用靶点。

根据本发明优选的，所述HHIPL2 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌预后评估产品包括特异性识别HHIPL2mRNA逆转录产物cDNA的物质。

进一步优选的，所述特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增HHIPL2 mRNA的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增HHIPL2 mRNA的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌靶向治疗产品包括特异性敲低HHIPL2mRNA表达的物质。

进一步优选的，所述特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL2mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰HHIPL2 mRNA表达的siRNA靶向识别序列如SEQ IDNO.4所示。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌预后评估产品的检测样本选自细胞、组织、血浆以及血清。

一种非小细胞肺癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的物质。

根据本发明优选的，所述特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ IDNO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。

一种非小细胞肺癌靶向治疗药物，所述药物包括特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质。

根据本发明优选的，所述特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL2mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL2mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰HHIPL2 mRNA表达的siRNA靶向识别序列如SEQ IDNO.4所示。

有益效果：

本发明通过研究发现HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌癌组织中的表达水平显著增高，且异常上调的HHIPL2 mRNA水平提示患者的总生存期较短，应用siRNA干扰非小细胞肺癌细胞中HHIPL2 mRNA表达水平能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力，在此发现的基础之上，本发明设计出能够特异性敲低HHIPL2 mRNA表达水平的siRNA与特异性识别HHIPL2 mRNA的引物对，并提出该siRNA与引物对在非小细胞肺癌靶向治疗与预后评估中的用途。

附图说明

图1为本发明分析TCGA数据库中110例临近正常肺组织与1017例NSCLC肿瘤组织样本的测序数据图；以例临近正常肺组织中HHIPL2 mRNA log₂Count值的平均数为参照，计算HHIPL2 mRNA在NSCLC癌组织中的相对表达水平，并应用Student’s t检验分析表达差异统计学意义。

图2为本发明应用逆转录-实时荧光定量PCR检测10对NSCLC样本中HHIPL2 mRNA表达水平示意图；按照2^-△△CT计算NSCLC癌组织中HHIPL2 mRNA相对表达水平，以ACTB为内参，组间差异的统计学意义通过成对t检验分析。

图3为特异性敲低H1299细胞中HHIPL2 mRNA表达水平，应用CCK-8实验检测H1299细胞增殖能力(左)，应用Transwell实验检测H1299细胞迁移与侵袭能力的示意图(右)。

图4为本发明应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析NSCLC患者肿瘤组织中HHIPL2mRNA表达水平对其预后的影响示意图；应用Log-rank检验HHIPL2 mRNA高表达与低表达的NSCLC患者之间预后差异的统计学意义。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例中所设计的非小细胞肺癌病人手术标本收集与检测是经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，所有病例都得到了患者的知情同意。

人源非小细胞肺癌细胞系H1299细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

实施例1

分析TCGA数据库中非小细胞肺癌(NSCLC)标本的测序数据，结果显示HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌肿瘤组织中表达水平相比于临近正常肺组织显著升高，具体分析结果如图1所示。

具体实施过程如下：

在TCGA数据库中下载NSCLC标本测序数据，其中NSCLC肿瘤组织1017例，临近正常肺组织110例，筛选出HHIPL2 mRNA测序所得count值，计算每个样本的log₂Count值，以110例临近正常肺组织log₂Count值的平均数为参照，计算HHIPL2 mRNA在1017例NSCLC肿瘤组织中的相对表达水平，组间差异的统计学意义应用Student’s t检验明确。

实施例2

收集10对手术切除的非小细胞肺癌(NSCLC)标本，提取RNA，应用逆转录-荧光定量PCR检测HHIPL2 mRNA在10对非小细胞肺癌标本中的表达水平，荧光定量PCR环节所用引物为本发明特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的引物对，其中上游引物序列SEQ IDNO.2，下游引物序列为SEQ ID NO.3，结果显示HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达水平相比于临近正常肺组织明显升高，这进一步验证了实施例1中的结果，具体分析结果如图2所示。

具体实施过程如下：

(1)10对NSCLC标本均来自接收手术治疗的患者，所有患者术前均未接受放化疗，且术后病理诊断为NSCLC；邻近正常肺组织取自距离肿瘤边缘大于5cm的区域，肿瘤组织均取自中心非坏死部位；

(2)应用RNA-Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)试剂盒从10对NSCLC标本中提取RNA，应用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，所提RNA的纯度与浓度使用NanoDrop2000检测，-20℃储存备用；

(3)以上述提取RNA为模板，使用lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)去除模板中混杂的基因组DNA,然后进行逆转录合成cDNA；在荧光定量PCR环节中使用本发明中的特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录cDNA产物的引物对(SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3)以及Power SYBR^TM Green PCR预混液(Thermo Fisher Scientific，4367659)在QuantStudio^TM 5System平台中进行，HHIPL2 mRNA相对表达水平按照2^-ΔΔCT方法计算，以ACTB mRNA表达水平为内参。

其中，所用引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-cgacctcttacccaagtgccta-3’(SEQ ID NO.2)；

下游引物：5’-ccgcttactcttggttctcacg-3’(SEQ ID NO.3)。

去除基因组DNA的体系：2μL RNA(250ng/μL)，2μL 5×gDNA Buffer，6μL RNase-Free ddH2O；反应条件：42℃孵育3分钟，4℃备用。

逆转录PCR体系：2μL lnR-RT Primer Mix，1μL lnR RT Enzyme Mix，2μL 10×lnRRT Buffer，5μL RNase-Free ddH₂O，10μL基因组DNA去除体系产物；反应条件：42℃孵育15分钟，95℃孵育3分钟，4℃备用。

实时荧光定量PCR体系：5μL Power SYBR^TM Green PCR预混液，1μL上述逆转录体系产物，1μL引物稀释液(1μM)，3μL RNase-Free ddH₂O。

反应条件：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，62℃退火10秒，72℃延伸20秒，共40循环；95℃变性15秒，60℃孵育60秒，95℃孵育1秒。

上述试剂均来自lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)与Power SYBR^TM Green PCR预混液试剂盒(Thermo Fisher Scientific，4367659)。

实施例3

设计siRNA-HHIPL2，然后应用siRNA-HHIPL2特异性敲低非小细胞肺癌细胞系H1299细胞中HHIPL2 mRNA表达水平，所述siRNA-HHIPL2靶向HHIPL2 mRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，应用本发明中所设计的特异性识别HHIPL2 mRNA的引物对通过反转录-荧光定量PCT检测HHIPL2 mRNA敲低水平；应用CCK-8与Transwell实验检测HHIPL2敲低表达对H1299细胞恶性生物学行为的影响，具体结果如图3所示。

由图3可知，应用siRNA-HHIPL2特异性敲低HHIPL2 mRNA表达水平能够显著抑制非小细胞肺癌细胞H1299的增殖、迁移与侵袭。

具体实施过程如下：

(1)根据HHIPL2 mRNA序列，设计能够特异性靶向该序列的siRNA-HHIPL2，靶向HHIPL2 mRNA的核苷酸序列为：5’-gctctgccttccattctaa-3’；

(2)将H1299细胞培养于6孔板中，待其生长密度达到60～70％，应用Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life technologies，13778-150)转染试剂将siRNA-HHIPL2和阴性对照siRNA-NC分别转染至H1299细胞中，24小时后，将细胞按1:3比例扩增至新的6孔板中继续培养，36-48小时后，收集其中一个孔内培养的细胞，提取RNA，并检测HHIPL2敲低效率，具体实验步骤与PCR体系同实施例2；

(3)收集其余孔板内细胞，细胞计数后用于功能试验，调整细胞浓度至20,000个/mL培养基，向96孔板中每孔加入100μL，每组6个复孔，铺板2～6小时后，向每孔加入10μLCCK-8试剂(TargetMol,C0005)，37℃孵箱中孵育1小时，简单震荡后使用酶标仪测量450nm的吸光度值，后续24小时重复上述操作，分别记录细胞生长1天，2天，3天后的吸光度值。将上述细胞悬液重新离心并使用无血清培养基重悬，调整浓度至100,000个细胞/mL培养基，向24孔板中加入完全培养基(600μL/孔)，将预先铺设基质胶或未铺设基质胶的Transwell小室(Corning，3422)放入24孔板中，并向每个小室内加入200μL细胞悬液，置于细胞培养箱，37℃、5％CO₂条件下培养48小时，弃掉培养基，PBS清洗小室后使用4％多聚甲醛室温下固定15分钟，紧接着使用甲醇处理细胞25分钟，加入0.1％结晶紫染色过夜，PBS清洗后使用棉签去除小室内侧面附着细胞，显微镜下拍照并计数穿孔细胞。

实施例4

应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析HHIPL2 mRNA表达水平高低患者间总生存期的差异，结果显示，与低表达HHIPL2 mRNA的NSCLC患者相比，HHIPL2 mRNA高表达的NSCLC患者的总生存期明显缩短，说明HHIPL2 mRNA能够作为非小细胞肺癌患者预后评估的生物标志物，具体分析结果如图4所示。

具体实施过程如下：

在Kaplan-Meier Plotter网站中收集1925例NSCLC患者的预后信息，按照HHIPL2mRNA相对表达水平将NSCLC患者分为高表达组(937例)与低表达组(988例)，应用Kaplan-Meier法分析HHIPL2 mRNA高低表达两组间总生存期的差异，其中HHIPL2 mRNA高表达组的中位生存期57个月；HHIPL2 mRNA低表达组中位生存期85个月，应用Log-rank检验确定组间生存差异的统计学意义。

以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2572

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gggcagagca gggaagccaa cctgagcaaa cacagcagcc cgagtgttcc caaggccaaa 60

atgctgagaa cgtccactcc taatctgtgt ggtggtctgc attgccgggc cccctggctc 120

tcttctggca ttctctgcct ctgcctcata ttcttgttgg gccaggtggg cttgctgcag 180

ggacaccccc agtgcctgga ttacgggccc cctttccagc cccctctgca ccttgagttt 240

tgctctgact atgagtcctt cggctgctgt gatcagcaca aggaccgccg catcgctgcc 300

cggtactggg acatcatgga atattttgat ctgaagagac atgagctgtg tggagattac 360

attaaagaca tcctttgcca ggagtgctcg ccctacgcag cccacctcta cgacgccgaa 420

aacacccaga cgcctctccg gaatctcccg ggcctctgct ctgattactg ctctgccttc 480

cattctaact gtcactcagc catttccctg ctgaccaatg accgcggcct ccaggagtct 540

catggaaggg acggtacccg cttctgccac ctcctggacc ttcctgacaa ggactattgc 600

ttccctaatg tcctgaggaa cgactatctc aaccgccacc tgggcatggt ggcccaagat 660

cctcagggct gcctgcagct ctgcctgagc gaggtggcca acgggctgag gaaccccgtc 720

tccatggtcc atgctgggga cggcacccat cgcttctttg ttgccgagca ggtaggagtg 780

gtgtgggtct acctccctga tgggagtcgc ctggagcaac ccttcctgga cctcaagaac 840

atcgtgttga ccaccccatg gatcggggat gagagaggct tcttggggtt ggcttttcac 900

cccaaattcc gccacaatcg caagttctat atttattatt cgtgcctgga caagaagaag 960

gtagaaaaga tccgaattag tgagatgaag gtttctcggg ctgatcctaa caaagctgac 1020

ctgaaatcag agagggtcat cttggagatt gaagaaccag cctcaaacca taatggcgga 1080

caacttcttt ttggcctgga tggctatatg tacatattca ctggggacgg gggacaggct 1140

ggagatccct ttggcctgtt tggaaatgct cagaacaaaa gttccctgct gggaaaagtt 1200

ttaaggatcg atgtgaacag ggcaggctca catggcaagc ggtaccgagt cccctcggac 1260

aatccatttg tttctgagcc aggggcccac cccgccatct atgcctatgg gatcaggaac 1320

atgtggcgtt gtgctgtgga ccgaggggac cccatcacgc gccagggccg aggccggata 1380

ttctgtgggg acgtgggcca gaacaggttt gaagaggttg acctcatttt gaaaggtgga 1440

aactatggct ggagagcaaa ggaagggttt gcatgttatg acaaaaaact ttgtcacaat 1500

gcctctttgg atgatgttct gccaatctat gcttatggcc atgcagtggg gaagtcagtc 1560

actggaggtt atgtctatcg tggttgtgaa tccccaaatc tcaatggcct gtatatcttt 1620

ggagacttca tgagtggtcg acttatggct ttgcaggaag atagaaaaaa caagaaatgg 1680

aagaagcagg atctttgcct gggcagcacc acgtcctgtg ccttcccagg gctgatcagc 1740

acccatagca agttcatcat ctcctttgct gaagatgaag caggggagct gtatttcctg 1800

gcgacctctt acccaagtgc ctatgcacca cgtggatcta tttacaagtt tgttgacccc 1860

tcaaggcgag cacccccagg caagtgcaaa tacaagccag tgcccgtgag aaccaagagt 1920

aagcggatcc cgttcagacc actcgccaag acagtcttgg acttgctaaa ggaacaatca 1980

gagaaagctg ctagaaaatc ttccagtgca accttagctt ctggcccagc ccagggtttg 2040

tctgagaaag gctcctccaa gaagctggct tctcctacaa gcagcaagaa tacattgcga 2100

gggcctggta caaagaagaa agccagagtg gggccccacg tccgccaggg caagaggagg 2160

aagagcctga aaagccacag tggcaggatg aggccatcag cagagcagaa gcgagctggc 2220

agaagtctcc cttgacctat tggtcaaggt ggccgacagg gtgacgtgag agaggagagc 2280

cacctcatca aatgaaagtc actgctgaat aaagacctta gaagtctggg aagccagggt 2340

agaggtgggg cagggcggtt ttcctctccc tgggaaatct tgctgtctac tgaataaata 2400

aatgcacctt ctctgtatgc agtgcttctg tgggagacca tatcccagat tgctggtgca 2460

cctgggttat ggtaagcact agtccatgag cctgcttgga atcacactgg atgtctccgt 2520

tttgtcttgt aaatgcctac aacctgaggt aataaatcaa catttgctca aa 2572

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgacctctta cccaagtgcc ta 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgcttactc ttggttctca cg 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctgcctt ccattctaa 19

Claims (3)

1.特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的siRNA在制备靶向治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述HHIPL2 mRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA靶向识别的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

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