CN101855348A - 肝癌相关基因、以及肝癌风险的判定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用采自患者的血液、对患者负担小、可以进行肝癌的早期发现、可检出并判定肝癌的风险的方法，以及提供可在该检出中利用的基因标志物、探针、引物以及试剂盒。本发明提供含有多核苷酸的肝癌的罹患诊断标志物，该多核苷酸可检测下述的甲基化基因或基因区的全部：(1)人SALL3c基因、(2)人ECEL1基因、(3)SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)。

Description

肝癌相关基因、以及肝癌风险的判定方法
技术领域
本发明涉及由于肝炎病毒等原因引起的肝癌罹患风险的测定方法。更具体地说，本发明涉及通过检测是否存在对肝癌风险有影响的基因的甲基化，对被检者采血得到的血细胞成分或血浆成分等含有人基因组DNA的试样判定是否有肝癌的遗传因素的方法；以及基因标志物或诊断试剂盒；以及筛选肝癌治疗药的候选物质的方法。
背景技术
肝癌也被称为是在肝脏内发生的恶性肿瘤。伴随肝癌细胞的转移，大致可分为肝细胞中原发性肝细胞癌、以及在肝脏外的器官内发生并且已经转移至肝脏内的转移性肝癌。在日本，根据1996年统计厅的癌症死亡率的相关报告，每年有1万人左右因肝癌死亡，肝癌死亡率为21.4％(1996)，是仅次于胃癌的高死亡疾病，还有报道称：在40-50岁，肝癌的死亡率比胃癌高。
最近的报告中称：肝癌死亡人数为3.4万人，占全体癌症死亡人数的约11％。其中，肝癌的90％以上为肝炎病毒感染者，在日本，据称具有肝癌发病风险的病毒性肝炎患者人数大约为300万人。肝细胞癌占原发性肝癌的95％，接近肝脏疾病死亡人数的7成。肝细胞癌是以有乙型、丙型肝炎背景的慢性肝炎、肝硬化为病因，其病例数逐年增加。在丙型肝炎病例中，约7成患者的病状缓慢发展，逐步发展为肝硬化和肝癌。已知约8成的肝癌患者的起因缘于丙型肝炎。
肝癌的治疗方法主要有肝脏切除、局部疗法、肝动脉栓塞疗法以及放射线疗法。对于肝脏切除，如果肝脏功能能够耐受手术则非常有效，最多使用。局部疗法是将注射针等由皮肤上插入肿瘤内，然后注入酒精等，以使肿瘤减少；或者，可用微波或无线电波局部烧除。肝动脉栓塞疗法通过使通向癌细胞的肝动脉闭塞、断绝其营养供给源，以杀死肿瘤细胞。放射线疗法是通过以病灶为靶照射放射线，以杀死肿瘤细胞。但是，目前采用外科手术的方法是最有效的手段。
肝癌进行早期治疗，则存活率提高的可能性高。有报道称：为肝细胞癌时，早期肝细胞癌的5年存活率为45％，而非早期肝细胞癌的5年存活率为11％。另外，临床病期为I期的患者的5年存活率为91％，II期为12％，III期为0％。因此，肝癌的早期发现很重要，人们希望开发可简便、精度良好地诊断的诊断试剂等。另外，肝癌手术后的复发率的风险也高，也很需要该复发风险的诊断方法。
现在，肝脏的功能异常的检查广泛采用AST(GOT)、ALT(GPT)和γ-GTP(γ-谷氨酰转肽酶)。通过检查这些物质，可诊断肝脏的功能异常，并且进一步通过病毒检查来诊断炎症、纤维化以及向癌化的发展。另外，肝癌的检查方法可以是图像诊断和利用血液的肿瘤标志物。可以诊断肝硬化或向肝癌发展的部位的图像诊断是采用腹部超声波检查、CT、MRI。CT检查或超声波检查可检出10mm以下的早期癌，精度高。但是，需要考虑医疗保险的认可、技术人员的水平、必要的高精密设备，频繁检查，以及任何可进行检查的医疗机构方面均有缺点。另一方面，肝细胞癌的标志物有α-甲胎蛋白(AFP)和维生素K缺乏或拮抗剂诱导蛋白(PIVKA-2，脱-γ-羧基凝血酶原)等。
但是，AFP和PIVKA-2的阳性率为3-4成左右，具有一定的缺点。AFP显示20ng/ml以上的数值时，可判定为肝细胞癌。但是在慢性肝炎或活动期的肝硬化等的非肝癌患者中也升高，因此对于轻度-中度的病例很难鉴别。所以，对于以AFP-L3区分的肝细胞癌，可能要使用更具有特异性的肿瘤标志物。一方面，PIVKA-2是对肝细胞癌的特异性高的肿瘤标志物，在其它疾病中很少升高。不过对于酒精性肝病或药物给予时(例如华法林或抗结核药等的抗生素)以及维生素缺乏时的情况下，即使不是肝细胞癌也显示高值。
在目前的诊断临床中，通过AFP和AFP-L3区分以及结合使用PIVKA-2来诊断肝癌。在利用血液中的标志物进行的肝癌诊断中，可提高肝癌的诊断率、即实现特异度和灵敏度提高的有效的诊断标志物的必要性日益增大。
因此，人们需求开发新的方法，作为其候选，将癌相关基因P16基因异常甲基化作为指标等(非专利文献1)。此外，有人提出了一种为了判定会恶化为肝癌的丙型肝炎而测定丙型肝炎患者检样中的GPC3浓度的诊断方法(专利文献1)。
非专利文献1：Wong IHN等人，Detection ofaberrant p 16 methylation inthe plasma and serum of liver cancerpatients.Cancer Res.，59，71-73，1999.
专利文献1：日本特开2007-192557C型肝炎患者の肝疾患の重篤化をモニタ一する方法および肝癌の診断方法(监测丙型肝炎患者的肝病恶化的方法和肝癌的诊断方法)
发明内容
但是，通常的肝癌标志物中，AFP和PIVKA-2对早期癌症的反应性低，PIVKA-2必须使用价值数百万日元的诊断仪器，还要结合使用2-3种癌标志物，因此较为麻烦，另外还有无法判断肿瘤种类等缺点。因此，本发明要解决的课题是提供简便的基因标志物，使其对早期癌症的反应性也高、对肝脏肿瘤的灵敏度也高，另外还提供肝癌切除后复发率风险的判定。此外，还提供以甲基化的肝癌标志基因作为靶的寻求药物候选物的方法。
本发明人为解决上述课题进行了深入的研究。结果发现：作为肝癌感受性基因，存在于人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)的甲基化的这些基因或基因区。即，可根据这些基因或基因区有否甲基化或其频率检出肝癌。本发明还证实，这些基因或基因区被甲基化，以甲基化频率高为指标，可以检出肝癌，从而完成了本发明。而且，由该发明可知，抑制或阻碍这些基因甲基化的药物候选物成为肝癌治疗药的可能性很高，因此作为药物候选物的寻求方法也非常有效。
即，本发明如下。
肝癌的检出方法，该方法通过检测人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、或人KCNIP2基因的任意1或2个以上的基因有否甲基化或其频率来检出肝癌。
肝癌的检出方法，该方法通过检测SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)所示的任意一种或两者基因区有否甲基化或其频率来检出肝癌。
肝癌的检出方法，该方法通过检测人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)所示的基因或基因区的表达量来检出肝癌。这里，表达量包含这些基因中被甲基化的基因的表达量的检测、或与有否甲基化无关，对这些基因的表达量的检测等。
检测人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)所示的基因有否甲基化或其频率的方法，该方法是为了检出肝癌。这里，试验样品可以使用被检者的血浆成分或血细胞成分的任意一种或两种。
涉及肝癌的罹患诊断标志物，该标志物含有可检测选自下述7种甲基化的基因或基因区的至少一种的多核苷酸。(1)人SALL3c基因、(2)人ECEL1基因、(3)人FOXC1基因、(4)人NRG3基因、(5)人KCNIP2基因、(6)SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)、或(7)SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)中所述的基因区。含有该多核苷酸的肝癌的罹患诊断标志物有：可个别鉴定这些甲基化的基因的引物等。
涉及肝癌的罹患诊断标志物，该标志物含有可以检测下述甲基化的基因或基因区的全部的多核苷酸。(1)人SALL3c基因、(2)人ECEL1基因、(3)SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)中所述的基因区。本发明中，通过上述7种基因或基因区中检测出对肝癌检测率特别高的三种甲基化的基因，可得到感受性更高的标志物或特异性高的标志物。这里，这些基因可以是将这些多核苷酸与固体表面结合的微阵列。
涉及判定试剂盒，该试剂盒含有上述罹患诊断标志物，可判定肝癌手术后的复发风险。
涉及SEQ ID NO.1所示的人SALL3c基因的寡核苷酸。该SALL3c基因作为SALL3基因的新型可变剪接体，是由归属财团法人癌研究会的本发明人发现的。
涉及筛选肝癌治疗药物的候选物质的方法，该方法包含以下各步骤：在试验物质存在或非存在下培养哺乳动物细胞，测定各细胞中的人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7的甲基化的频率，筛选具有抑制甲基化的效果的试验物质作为肝癌治疗药物的候选物质以及包含各个步骤的方法。
通过本发明，能够以低成本进行肝癌的检出、特别是对早期肝癌的检出或肝癌手术后的复发风险的检测等、提供非常简便且可靠性高的新型检测方法。肝癌的早期发现是减少癌症死亡率的最有效的方法，这样就有望获得早期诊断的诊断标志物或方法。另外，还可以提供在上述检出方法中使用的寡核苷酸、微阵列和诊断试剂盒。此外，还可以以这些基因的甲基化为指标，寻求抑制或阻碍这些基因的甲基化的药物候选物。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
以下将详细说明本发明。实施方式并不限于以下方式。
本发明是用于检出肝癌、特别是检测早期肝癌以及手术后癌症的复发的方法，通过本方法发现了人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)中所示的基因的甲基化或其高频率，这些是对肝癌的特异性高的指标。本发明着眼于这些基因的甲基化、以及这些甲基化的基因或基因区。
本发明中，通过测定特定基因的甲基化来检出肝癌的方法可如下步骤进行。首先，本发明的肝癌的检出方法是由被检者采集血清、血浆或血细胞成分。检样的具体例子有：间质液、血管外液、脑脊液、滑液、唾液或肝脏组织等。手术后的试样优选是手术后经过3天-7天后的试样。组织试样包含通过手术或内窥镜摘除的组织或其一部分、活检标本、器官清洗液等。另外，从上述这些试样中提取DNA的方法在该技术领域内已被广泛熟知，例如：可以采用苯酚·氯仿进行提取。或者也可以使用市场上出售的DNA提取试剂。此时可以使用GFX Genomic Blood DNA Purification Kit等市场上出售的基因组DNA提取试剂盒或者装置。此外，也可以不经过从试样中提取DNA的处理，而是直接通过PCR等进行特定基因的检测。在本发明的检出方法中，只要数ml血液样品数、或癌切除手术时的10mg左右的组织即可，对患者、被检者的侵害也极小，是一种负担很小的检出方法。
DNA的甲基化是指DNA的碱基胞嘧啶(C)被甲基化(附有CH3)。该甲基化在CpG这样的C和G相连时较常见，CpG的80％左右被甲基化。在基因组上，将CpG高密度存在的场所称为CpG岛，与基因表达的调节、癌症、印记等相关。通常CpG岛的胞嘧啶未被甲基化，除此以外的部分的CpG被甲基化。另外，由于甲基转移酶的作用，DNA复制时发生的只有一条DNA链被甲基化的CpG位点恢复为两条DNA链被甲基化的状态。因此，DNA复制后，被甲基化的CpG位点保留甲基化，未甲基化的CpG位点也保留，已知可发挥基因组上的标志物的作用。甲基化的生物学意义在于：特别是CpG岛位于基因5’区时，发挥该基因的表达开关的作用。如果是普通的基因，则基因5’区CpG岛未被甲基化，为可表达的状态。例如在癌症中，通常应该未被甲基化的癌症抑制基因5’区CpG岛被异常甲基化，表达受到抑制，近年来被广泛认为是重要的癌症发病机理。
核苷酸是指核酸。多核苷酸是由多个核苷酸结合所得，包含DNA和RNA，与所谓的引物、探针和寡聚片段具有相同含义。
为了测定DNA的甲基化程度或频率，可以采用COBRA(联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析法)法或亚硫酸盐分析法。这些方法是基于以下原理：将DNA用亚硫酸盐等的非甲基化胞嘧啶修饰试剂进行处理，则未被甲基化的胞嘧啶变换为尿嘧啶，而被甲基化的胞嘧啶不变换为尿嘧啶。另外，高灵敏度并且半定量地分析DNA的甲基化的技术有Methylight法。在Methylight法中，将识别甲基化特异性序列的引物与TaqMan探针进行组合，通过实时PCR法进行甲基化的检测。在此基础上，还可以使用特异性切断甲基化的基因序列的限制酶(Dnp1等)的方法等。
<基因序列信息>
在本发明的方法中可利用的基因的信息列举在下表1中(SEQ IDNO.1-7)。
表1中记载了在本发明中可利用的基因SEQ ID NO.、基因名称、登记号。
基因序列信息可通过使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)确认的登记号获得。未有登记号记载的SALL3C由归属财团法人癌研究会的本发明人鉴定为SALL3(NM_171999)的新型可变剪接体，预定在基因库(NCBI)进行登记。关于此SALL3C，在SEQ ID NO.1中给出基因序列。另外，没有基因名称的基因序列，其基因序列信息虽然是已知的，但是由于其基因功能尚未明确，因此没有基因名称。没有基因名称的基因序列，在本发明中已经给出利用的基因区位置。
[表1]
  SEQ ID NO.   基因名称(基因区位置)   登记号
  SEQ ID NO.1   Sal-like 3C(SALL3C)   SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.2   内皮素转化酶-类似I(Endothelinconverting enzyme-like I，ECEL 1) NM_004826
  SEQ ID NO.3   叉头盒C1(Forkhead box C1，FOXC1)   NM_001453
  SEQ ID NO.4   神经调节蛋白3(Neuregulin 3，NRG3)   NM_001010848
SEQ ID NO.5   钾离子通道相互作用蛋白(Kv channelinteracting protein 2，KCNIP2) NM_014591
  SEQ ID NO.6   1393863-1395863   NT_037622.5
  SEQ ID NO.7   7774305-7776805   NT_022135.15
<本发明的基因甲基化的检测方法>
以下举例说明在本发明的检测方法中使用特定基因的甲基化的检测方法。
高灵敏度且半定量地分析DNA的甲基化的技术有Methylight法和亚硫酸氢盐分析法。在亚硫酸氢盐分析法中，将单链DNA进行亚硫酸(亚硫酸氢钠，亚硫酸氢盐)处理，则发生磺化·水解脱氨基化反应。接着进行去磺化处理，则胞嘧啶转变为尿嘧啶。而在甲基化胞嘧啶中，由于磺化的反应速度非常慢，因此没有转变为尿嘧啶，而还是甲基化胞嘧啶，非甲基化胞嘧啶被置换为胸腺嘧啶(Frommer M，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，891827-1831，(1992)；Clark SJ，等人.Nucleic Acids Res.，22，2990(1994))。可以利用该序列的不同(C和T)来分析甲基化状态。利用亚硫酸氢盐处理的更具体的实验方法有亚硫酸氢盐分析法、联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析法(COBRA)法等多种实验方法，可根据分析目的选择适当的实验方法。
甲基化的检测中采用的DNA处理如下进行。首先，使用Dneasy血液和组织试剂盒(Qiagen)，从血细胞和血清中提取DNA。接着，对血细胞和血清的DNA样品进行亚硫酸氢盐处理。将从微量的血清DNA或500ng血细胞或组织中提取的DNA用0.2M的NaCl在37℃下处理10分钟，进行变性。接着，加入亚硫酸氢钠，使终浓度为3M，加入氢醌，使终浓度为0.5mM，反应16小时。反应液使用Wizard DNA纯化试剂盒进行脱盐。亚硫酸氢盐处理是在0.3M NaOH中反应15分钟后结束。经过修饰了的DNA用乙醇沉淀，然后用70％乙醇清洗后溶解于20μL的蒸馏水中。或者也可以使用Epi Tect亚硫酸氢盐试剂盒(Qiagen)。
在本发明中，为了检测表1中所示的基因或基因区有否甲基化或其频率，准备了能够可特异性检测甲基化的各基因的引物。在本发明的实施例中使用的、能够检测出各基因的引物组序列如表2所示(表示为5’至3’)。巢式PCR是在第一次PCR中利用引物F1·R1，在第二次PCR中利用引物F2·R2。巢式PCR是使用外侧的引物和内侧的引物进行2步PCR的方法，是以来自目标区的最初的PCR产物为模板，由最初使用的引物的位置起至两侧均在内侧设置引物进行的方法。引物序列并不限于表2所示，只要是能够特异性检测或鉴定这些基因的甲基化的引物中的任何一种即可。在本发明中，肝癌的罹患诊断标志物可以是可扩增这些特定基因的引物。通过PCR扩增基因样品时，优选地采用保真度高的DNA聚合酶等。引物可利用表2所示的基因序列信息的一部分设计合成，使作为对象的甲基化的特定基因扩增。扩增反应结束后进行扩增产物的检测，检测有否甲基化或其频率。在本发明中，无需对上述基因的全长进行测定和检测，只要特定了个别基因，即可测定和检测该基因的一部分。
[表2]
  基因SEQ ID NO，基因名称等   引物序列
  SEQ ID NO.1SALL3C   F1：gttcgggttggtcgtttatcgttc(SEQ  ID NO，8)R1：cccacacactcgacccctaacg(SEQ ID NO，9)F2：agacgtattggggcgaggggc(SEQ ID NO，10)R2：ctccccgcgatcacacgcacg(SEQ ID NO，11)
  SEQ ID NO.2ECEL1   F1：tttcgcggagacgttaatttagttc(SEQ  ID NO，12)R1：aaacgcaaaacgtatacaacgccg(SEQ ID NO，13)F2：gagggttgggaaattgcggttttc(SEQ ID NO，14)R2：ctcctcgcgctacgtcatccg(SEQ ID NO，15)
  SEQ ID NO.3FOXC1   F1：gcgggtcggtattagttcggtc(SEQ ID NO，16)R1：ctacgacgtataaaacccgtaaacg(SEQ ID NO，17)F2：ggggttatgtaggcgcgttatttc(SEQ  ID NO，18)R2：tacgaataca cgctcataaaaaccg(SEQ ID NO，19)
  SEQ ID NO.4NRG3   F I：gggattcggcgcgtaggaggc(SEQ ID NO，20)R1：caacgtaactcccgaaaaaactcg(SEQ ID NO，21)F2：gtcgttttttgatcgatcggaggc(SEQ ID NO，22)R2：aaaccgcgacaaaaacataaaaccg(SEQ ID NO，23)
  基因SEQ ID NO，基因名称等   引物序列
  SEQ ID NO.5KCNIP2   F1：ttcgtttttcggttttattcgatgtc(SEQ ID NO，24)R1：actaaacgaatctaaattaatccccg(SEQ ID NO，25)F2：gatggttattttcgaggtttattagc(SEQ ID NO，26)R2：cctccctttctaaaacgaaaatacg(SEQ ID NO，27)
  SEQ ID NO.6NT_037622.51393863～1395863   F1：agtataatatatcgcgtttataaattatc(SEQ ID NO，28)R1：aacgacgcgacttatcgaacacg(SEQ ID NO，29)F2：gcgttttttatttaatgtaaatggagc(SEQ ID NO，30)R2：taatcgcgacatcaaccatcgacg(SEQ ID NO，31)
  SEQ ID NO.7NT_022135.157774305～7776805   F1：gagagtacgttagttttggagattc(SEQ ID NO，32)R1：cacgtactttccctccttaactcg(SEQ ID NO，33)F2：ttagtattgcgaatagcgttagtatc(SEQ ID NO，34)R2：aataaatactaacttaatcgaaataaacg(SEQ ID NO，35)
本发明的实施例中的基因扩增处理(PCR)按照如下操作进行。由于作为对象的基因试样具有很多难以扩增的模板，因此使用强活力的Tth聚合酶，以2μL亚硫酸氢盐处理的DNA为模板。在第一步的PCR处理中，
该PCR反应液是使用Applied Biosystems制备的GeneAmp XL PCR试剂盒，如表3所示进行制备。
[表3]
  模板DNA   2μl
  3.3X XL缓冲液II   15μl
  25mM Mg(OAc)2   2.2μl
  10mM dNTP mix   1μl
  引物A   1μl
  引物B   1μl
  rTth聚合酶   0.5μl
  Dw   27.3μl
第一步的PCR反应循环是94℃30秒变性、53-54℃30秒退火、68℃3分钟延伸，以此作为一个循环，进行40个循环的反应。接着，在第二步的PCR处理中，该PCR反应液是使用Applied Biosystems制备的GeneAmpXL PCR试剂盒，如表4所示进行制备。模板DNA是将第一步的PCR产物用蒸馏水稀释为1/500(血清DNA)、1/1000(血细胞DNA)，使用其1μL。第二步的PCR反应循环是94℃30秒变性、53-54℃30秒退火、68℃3分钟延伸，以此作为一个循环，进行40个循环的反应。
[表4]
  模板DNA   1μl
  3.3X XL缓冲液II   15μl
  25mM Mg(OAc)2   2.2μl
  10mM dNTP mix   1μl
  引物A   1μl
  引物B   1μl
  rTth聚合酶   0.5μl
  Dw   28.3μl
<肝癌的罹患诊断试剂盒>
在本发明中，肝癌的罹患诊断试剂盒除可扩增上述各基因的引物之外，还包含用于实施本发明所需的1种以上的成分。例如：本发明的试剂盒可以含有用于保存或供给酶的物质，还包含实施PCR反应所需的反应成分。上述成分有：本发明的的寡核苷酸、酶缓冲液、dNTP、对照用试剂(例如样品、正或负对照用目标寡核苷酸等)、标记用或检测用试剂、固相支撑体、说明书等，并不限于此。
<筛选肝癌治疗药的候选物质的方法>
筛选肝癌治疗药的候选物质的方法包含以下步骤：在试验物质的存在或非存在情况下培养哺乳动物细胞，测定各细胞中的人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ IDNO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)的甲基化频率，筛选具有抑制甲基化的效果的试验物质作为肝癌治疗药物的候选物质。在本发明中，由于上述基因或基因区的甲基化与肝癌相关，因此通过鉴定可阻碍或抑制该甲基化的药物，可以发现肝癌治疗药的候选物质。这里，利用哺乳动物的培养细胞是由于在酵母或大肠杆菌等中并不发生甲基化，或者即使被甲基化，其生理学意义也不同。
以下给出实施例，更具体地来说明本发明，本发明并不受其限定。
实施例1
<各种基因标志物对肝癌各阶段的检出率>
表5是将患有肝癌的患者的癌症分为高分化(早期癌)和中·低分化(进行癌)后，针对各种基因标志物可检测出早期癌的特性进行试验的结果。患者是不分男女性别、预定要实施切除肝癌的手术的人。另外，高分化或中·低分化的分类遵从担当肝癌手术的医生的意见。为了评价本发明的肝癌的检出率，也同样对以往使用的肝癌标志物AFP和PIVKA-2的检出率进行试验。
根据表5的结果，以往使用的AFP标志物对任何阶段的肝癌的检出率都很低，但PIVKA-2标志物对高分化癌的检出率为较高的70％，对中·低分化癌的检出率为较低的44％。在本发明中，被甲基化的SALL3C、ECEL1、NT_037622.5(1393863-1395863)对高分化癌的检出率分别为80％、70％、80％，比PIVKA-2标志物的检出率高，显示其有效性。这里，检出率的计算是以在高分化癌或中·低分化癌的患者中对各基因标志物反应的人数及其比例(检测出甲基化的各基因的组)来表示。另外，实施例3的“其中一个标志物为术前阳性、术后阴性”的临床试验者或健康人中，如果鉴定任何基因均为阴性，则可以检出中·低分化癌。
[表5]
  SEQ ID NO.登记号基因名称(基因区位置)   高分化癌   中·低分化癌
  SEQ ID NO.1SALL3C   8人(80％)   24人(53％)
  SEQ ID NO.2NM_004826ECEL1   7人(70％)   17人(38％)
  SEQ ID NO.3NM_001453FOXC1   5人(50％)   10人(22％)
  SEQ ID NO.4NM_001010848NRG3   4人(40％)   8人(18％)
  SEQ ID NO.5NM_014591KCNIP2   2人(20％)   5人(11％)
  SEQ ID NO.6NT_037622.51393863-1395863   8人(80％)   28人(62％)
  SEQ ID NO.7NT_022135.157774305-7776805   4人(40％)   2人(4％)
  AFP   2人(20％)   11人(24％)
  PIVKAII   7人(70％)   20人(44％)
实施例2
<各种基因标志物对肝癌的脉管浸润的检出率>
肝癌的脉管浸润是指癌细胞浸润门静脉、肝静脉、肝动脉、胆管的周围或这些脉管内部。它包括通过图像检查或切除标本的肉眼观察，即可诊断的肉眼脉管浸润和在显微镜下可初次诊断的微小型脉管浸润。已知微小型脉管浸润是对于治疗后复发最为有力的预后因子之一，现有技术难以在手术前诊断其有无。表6的结果显示，以往使用的AFP标志物和PIVKA-2标志物的结果无法区分是否有肝癌的脉管浸润。与此相对，本发明中甲基化的ECEL1、NT_037622.5(1393863-1395863)对有脉管浸润的肝癌分别显示55％和85％的检出率，而对没有脉管浸润的肝癌分别显示为37％和54％的检出率，因此通过利用这两种基因标志物，可以预想是否有肝癌的脉管浸润。这里，检出率的计算是以有脉管浸润的癌症患者或无脉管浸润的癌症患者中各基因标志物有反应的人数及其比例(检测出甲基化的各基因的组)来表示。另一方面，甲基化的SALL3C在有脉管浸润的肝癌中为45％的检出率，在无脉管浸润的肝癌中为66％的检出率，因此可以检出无脉管浸润的肝癌。
[表6]
  SEQ ID NO.登记号基因名称(基因区位置)   有脉管浸润   无脉管浸润
  SEQ ID NO.1SALL3C 9人(45％) 23人(66％)
  SEQ ID NO.2NM_004826ECEL1 11人(55％) 13人(37％)
  SEQ ID NO.3NM_001453FOXC1 7人(35％) 8人(23％)
  SEQ ID NO.4NM_001010848NRG3 4人(20％) 8人(23％)
  SEQ ID NO.5NM_014591KCNIP2 2人(10％) 5人(14％)
  SEQ ID NO.6NT_037622.51393863-1395863 17人(85％) 19人(54％)
  SEQ ID NO.7NT_022135.157774305-7776805 4人(20％) 8人(23％)
  AFP   6人(30％)   7人(20％)
  SEQ ID NO.登记号基因名称(基因区位置)   有脉管浸润   无脉管浸润
  PIVKAII   8人(40％)   19人(54％)
实施例3
<肝癌摘除手术前后各种基因标志物的反应>
在本发明中，特别是对于肝癌的检出率高的甲基化的SALL3C、ECEL1和NT_037622.5(1393863-1395863)，在肝癌摘除手术前后试验有否检测出这些基因标志物。另外，对于患者检样(试样)，分类为血浆和血细胞进行评价。(-/-)表示手术前后两者均未检出，(+/+)表示在手术前后两者均检出。另一方面，(+/-)表示在手术前检出、在手术后未检出，(-/+)表示其相反的情况。作为工作假设，如果是有效的罹患标志物，可以推定应为在手术前检出、在手术后未检出的(+/-)。另一方面，对于其相反情况(-/+)，可预想其检出率低，而且，不管是否进行了肝癌摘除手术、预想在其前后均检出的情况(+/+)也低。不过，由于患者的体质等不同，考虑到这些罹患标志物可能无效，因此与(-/+)或(+/+)相比可以预想到显示出高检出率。
之后，通过实际的试验，计算出手术前后各基因标志物的检出率、未检出率(表7)。在表7中，(-)是未检出甲基化的基因(阴性)，(+)是检出了甲基化的基因(阳性)。由该结果显示：在手术前检出、在手术后未检出的、由血细胞提取的甲基化SALL3C、ECEL1和NT_037622.5(1393863-1395863)分别为56％、42％和64％，较高(+/-)。与此相对，手术后仍检出的基因标志物分别为20％、36％、18％，成为在癌症摘除手术中反应比较低的数值(+/+)。并且，手术前未检出、手术后检出的基因标志物均为很低的2％。相反地，无论手术前后，均未有任何反应的组(-/-)显示为低数值的22％、20％和16％。这表示：在肝癌患者中，虽然由于其遗传性体质等而没有反应的组也有一定比例，但在有反应的患者组中，甲基化SALL3C、ECEL1和NT_037622.5(1393863-1395863)的基因标志物在其手术前后的数值是理论性数值，可靠性高。另外，与没有反应的患者组的平均值19％(三种基因的平均)相比，有反应的患者组平均为54％，显示该基因标志物是有效性高的基因标志物。并且，患者的试验样品是由血细胞提取的DNA，也显示了更高的特异性和感受性。
在各实施例中，针对5位已知为HbsAg(乙型肝炎的抗原)阴性、HCVAb(丙型肝炎的抗体)阴性的健康人(34岁男、34岁女、50岁男、63岁男、64岁女)的血清、血细胞，采用同样的方法进行PCR，确认了涉及本发明的7种基因、基因区域的甲基化为阴性。
[表7]
  基因标志物   试样   -/-   +/-   +/+   -/+
  SALL3CSEQ ID NO.1   血浆血细胞   50名(91％)12名(22％)   4名(7％)31名(56％)   0名(0％)11名(20％)   1名(2％)1名(2％)
  基因标志物   试样   -/-   +/-   +/+   -/+
  ECEL1SEQ ID NO.2   血浆血细胞   46名(84％)11名(20％)   9名(16％)23名(42％)   0名(0％)20名(36％)   0名(0％)1名(2％)
  NT_037622.51393863-1395863SEQ ID NO.6   血浆血细胞   50名(91％)9名(16％)   3名(5％)35名(64％)   0名(0％)10名(18％)   2名(4％)1名(2％)
序列表
<110>东京大学；日本癌症研究基金会
<120>肝癌相关基因、以及肝癌风险的判定方法
<130>12B078001
<160>35
 
<210>1
<211>3713
<212>DNA
<213>人类
<400>1
agcgccgcta gcagcatgtc tcggcgcaag caggccaagc cccagcacct caagtcggac gaggagctgc
tgccgcctga cggggctccc gagcacgccg ccccggggga aggtgcggag gacgcagaca gcgggcccga
gagccgcagc gggggcgagg agaccagcgt gtgcgagaaa tgctgcgccg agttcttcaa gtgggcggac
ttcctggagc accagcggag ctgcaccaag ctcccgcccg tgctgatcgt gcacgaggac gcgcccgcgc
cgccccccga ggacttcccc gagccttcgc ccgccagctc ccccagcgag cgcgccgaaa gcgaggcggc
cgaggaggcg ggtgcggagg gcgcggaggg tgaggccagg ccggtggaga aggaggccga
gcccatggac gcggaacccg cgggggacac gcgcgcgccc cggcccccgc ctgcggcccc tgcaccccca
acgcccgcct acggcgcgcc cagcaccaac gtgaccctgg aggcgctgct gagcaccaag gtggcggtgg
cgcagttctc gcagggcgcg cgcgcggcag gcggctcggg agcaggtgga ggcgtggcag ctgcagccgt
gcccctgatc ctggaacagc tcatggccct gcagcagcag cagatccacc agctgcagct catcgagcag
atccgcagcc aggtggccct catgcagcgc ccgccgccgc ggccctcact cagccccgcg gccgccccga
gcgcaccggg cccggccccc agccagctgc ccgggctggc cgcgctcccg ctgtcggccg gggcccctgc
cgccgccatc gcgggctcgg gccccgccgc cccggccgcc ttcgagggcg cgcagccgct gtcccggccc
gagtctggcg ccagcacccc cggcggccct gcggagccca gcgcgcccgc cgcccccagc gccgcccctg
cccccgctgc ccccgccccg gcgccagcgc cgcagagcgc ggcctcgtcg cagccgcaga gcgcatccac
gccgcctgcc ctggccccgg ggtccctgct gggtgcggcg cccggcctgc caagtccgct tctacctcag
acttccgcca gcggcgtcat cttccccaac ccgctggtca gcatcgcggc cacggccaac gctctggacc
cgctgtccgc gctcatgaag caccgcaagg gcaagccgcc caatgtgtcg gtgttcgagc ccaaagccag
cgccgaggac ccgttcttca agcacaaatg ccgcttctgc gccaaggtct tcggcagcga cagcgcgctc
cagatccacc tgcgctcgca cacaggcgag cggcccttca agtgcaacat ctgcgggaac cgcttctcca
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gggcggccag atccccaaca cgccgctgcc ggagggcttc caggatgcca tggactccga gctggcctac
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cctcgtcggc cgtgggcgac ctggagagcc gcagcgcggg cagccccgcc ctgtccgagt cctcgtcctc
gcaggccctg tcgccggccc ccagcaatgg tgagagcttc cgctccaagt ccccgggcct gggcgccccg
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ggcagcggag gcgcccctgg ccgcgcgggc atcaaggagg aggcgccctt cagcctgctg ttcctgagca
gggagcgggg tcccagccaa agcactccta gcctgatctc cagcgccgca cccaccatga tcaaaatgga
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gccgggcctc agacagtgat gggcccgggc ctggcgccca tgctggcccc cccaccgcgc cggacgccca
agcagcacaa ctgccagtcg t9cgggaaga ccttctcctc ggccagcgcc ctgcagatcc atgagcgcac
gcacaccggc gagaagccgt tcggctgcac catctgcggc cgggccttca ccactaaggg caacctcaag
gtgcacatgg ggacacacat gtggaataac gcccccgcga gacgcggccg ccgcctgtct gtggagaacc
ccatggctct cctagggggt gatgccctga agttctctga aatgttccag aaggacctgg cagctcgggc
aatgaacgtc gaccccagtt tttggaacca gtatgctgca gccatcacta acgggctcgc catgaagaac
aacgagatct ccgtcatcca gaacggcggc atcccccagc tccccgtgag tcttgggggc agcgccctcc
cccctctggg cagcatggcc agtgggatgg acaaagcacg cactggcagt agcccaccca tcgtcagctt
ggacaaagcg agctcagaaa cagcagccag ccgcccattc acgcggttta tcgaggataa caaggagatt
ggtatcaact agccagtgac tcg
 
<210>2
<211>2872
<212>DNA
<213>人类
<400>2
1    gggcgctggg agacaccgga cgcccgctcg gctgcgctgc ggctcaggcc cccgctcggg
61   cccgacccgc tcggtcaccg ccggctcggg cgcgcacctg ccggctgcgg ccccagggcc
121  atgcggaggc ccacgaggag gccggcggcc acgcgcatcc cgtagcccag gtggcccagg
181  tctgcaccgc ggcggcctcg gcgccatgga gcccccgtat tcgctgacgg cgcactacga
241  tgagttccaa gaggtcaagt acgtgagccg ctgcggcgcg gggggcgcgc gcggggcctc
301  cctgcccccg ggcttcccgt tgggcgctgc gcgcagcgcc accggggccc ggtccgggct
361  gccgcgctgg aaccggcgcg aggtgtgcct gctgtcgggg ctggtgttcg ccgccggcct
421  ctgcgccatt ctggcggcta tgctggccct caagtacctg ggcccggtcg cggccggcgg
481  cggcgcctgt cccgagggct gccctgagcg caaggccttc gcgcgcgccg ctcgcttcct
541  ggccgccaac ctggacgcca gcatcgaccc atgccaggac ttctactcgt tcgcctgcgg
601  cggttggctg cggcgccacg ccatccccga cgacaagctc acctatggca ccatcgcggc
661  catcggcgag caaaacgagg agcgcctacg gcgcctgctg gcgcggcccg ggggtgggcc
721  tggcggcgcg gcccagcgca aggtgcgcgc cttcttccgc tcgtgcctcg acatgcgcga
781  gatcgagcga ctgggcccgc gacccatgct agaggtcatc gaggactgcg ggggctggga
841  cctgggcggc gcggaggagc gtccgggggt cgcggcgcga tgggacctca accggctgct
901  gtacaaggcg cagggcgtgt acagcgccgc cgcgctcttc tcgctcacgg tcagcctgga
961  cgacaggaac tcctcgcgct acgtcatccg cattgaccag gatgggctca ccctgccaga
1021 gaggaccctg tacctcgctc aggatgagga cagtgagaag atcctggcag catacagggt
1081 gttcatggag cgagtgctca gcctcctggg tgcagacgct gtggaacaga aggcccaaga
1141 gatcctgcaa gtggagcagc agctggccaa catcactgtg tcagagcatg acgacctacg
1201 gcgagatgtc agctccatgt acaacaaggt gacgctgggg cagctgcaga agatcacccc
1261 ccacttgcgg tggaagtggc tgctagacca gatcttccag gaggacttct cagaggaaga
1321 ggaggtggtg ctgctggcga cagactacat gcagcaggtg tcgcagctca tccgctccac
1381 accccaccgg gtcctgcaca actacctggt gtggcgcgtg gtggtggtcc tgagtgaaca
1441 cctgtccccg ccattccgtg aggcactgca cgagctggca caggagatgg agggcagcga
1501 caagccacag gagctggccc gggtctgctt gggccaggcc aatcgccact ttggcatggc
1561 gcttggcgcc ctctttgtac atgagcactt ctcagctgcc agcaaagcca aggtgcagca
1621 gctagtggaa gacatcaagt acatcctggg ccagcgcctg gaggagctgg actggatgga
1681 cgccgagacc agggctgctg ctcgggccaa gctccagtac atgatggtga tggtcggcta
1741 cccggacttc ctgctgaaac ccgatgctgt ggacaaggag tatgagtttg aggtccatga
1801 gaagacctac ttcaagaaca tcttgaacag catccgcttc agcatccagc tctcagttaa
1861 gaagattcgg caggaggtgg acaagtccac gtggctgctc cccccacagg cgctcaatgc
1921 ctactatcta cccaacaaga accagatggt gttccccgcg ggcatcctgc agcccaccct
1981 gtacgaccct gacttcccac agtctctcaa ctacgggggc atcggcacca tcattggaca
2041 tgagctgacc cacggctacg acgactgggg gggccagtat gaccgctcag ggaacctgct
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241  tatagctaca tcgcgctcat caccatggcc atccagaacg ccccggacaa gaagatcacc
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1561 tctccagtga acgggaatag tagctgtcaa atggccttcc cttccagcca gtctctgtac
1621 cgcacgtccg gagctttcgt ctacgactgt agcaagtttt gacacaccct caaagccgaa
1681 ctaaatcgaa ccccaaagca ggaaaagcta aaggaaccca tcaaggcaaa atcgaaacta
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2701 atcagccgcg gtcttaccac ggtgatgcct gtgtgccgag agatgggact gtgcggccag
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<210>7
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gacccagaca gggcagggca tggagcaggc acacagtccg actgtctggc tggactcctg
acccttacca tttggtccaa ctgcattgtg ctgagctctt gagccaccag tttatagggt
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catccatcca tccatccatc catccatgat taggaaagac atctatattt gttgagtaca
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ggctggtgcc acctataggg gttcaactgc ttgattttct ttttcttcct tgtccctacc
gccccccccg ctcccccgcc accatccctc tttgaataaa tgaagatgtt gaggttcttc
tatcgaggtt ccgctcactg atgctagata tctaaacttc atgcagagaa gccatctaca
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tgccatgctg gcacctgaat ggagtttata ttttgtttat ggagctgaat ccgaagcctt ttattttttt ggctcggcct
gtgtcattct tcatggaagc tcgaaatggc cgcggagcag ctcaatattc catttatttt acttataaaa
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Claims (10)

1.检出肝癌的方法，该方法是通过检测人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、或人KCNIP2基因的任意1或2种以上有否基因甲基化或其频率来检出肝癌。
2.检出肝癌的方法，该方法是通过检测SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)所示的任意一种或两种的基因区有否甲基化或其频率来检出肝癌。
3.检出肝癌的方法，该方法是通过检测人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)所示的基因的表达量来检出肝癌。
4.检出肝癌的方法，该方法是通过检测人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15，7774305-7776805)所示的基因有否甲基化或其频率来检出肝癌。
5.如权利要求1-4中任一项所述的检出方法，该方法是使用被检者的血浆成分或血细胞成分的任意一种或两者作为试验样品。
6.肝癌的罹患诊断标志物，该标志物含有可检测选自下述7种甲基化的基因或基因区的至少一种的多核苷酸：
(1)人SALL3c基因
(2)人ECEL1基因
(3)人FOXC1基因
(4)人NRG3基因
(5)人KCNIP2基因
(6)SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)
(7)SEQ ID NO.7(NT_022135.15、7774305-7776805)
7.肝癌的罹患诊断标志物，该标志物含有可全部检测下述甲基化的基因或基因区的多核苷酸：
(1)人SALL3c基因
(2)人ECEL1基因
(3)SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)
8.判定试剂盒，该判定试剂盒含有权利要求6或7所述的检测标志物，可判定肝癌手术后复发风险。
9.寡核苷酸，该寡核苷酸是SEQ ID NO.1所示的人SALL3c基因的寡核苷酸。
10.筛选肝癌治疗药的候选物质的方法，该方法包含以下各步骤：在试验物质的存在或非存在情况下培养哺乳动物细胞，测定各细胞中的人SALL3c基因、人ECEL1基因、人FOXC1基因、人NRG3基因、人KCNIP2基因、SEQ ID NO.6(NT_037622.5，1393863-1395863)或SEQ ID NO.7(NT_022135.15、7774305-7776805)的甲基化频率，筛选具有抑制甲基化的效果的试验物质作为肝癌治疗药物的候选物质。
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