CN107326071A - Plpp4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用 - Google Patents

Plpp4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PLPP4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用。本发明发现PLPP4(磷脂酸磷脂酶4)在非小细胞肺癌的肿瘤组织及细胞系中高表达，PLPP4在肺恶性肿瘤组织中高表达与差的临床病理分级相关，并且与患者短的总生存时间及无进展生存时间相关，通过沉默PLPP4能影响体外非小细胞肺癌细胞增殖和体内成瘤，这些信息都预示着PLPP4可作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后的靶点。本发明利用荧光定量检测PLPP4的引物，作为非小细胞肺癌诊断和预后的试剂；特异性沉默PLPP4的LNA修饰sisiRNA作为非小细胞肺癌的治疗药剂。

Description

PLPP4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用
技术领域
本发明属于PLPP4的新应用，具体涉及PLPP4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用。
背景技术
肺癌(Lung cancer)是世界发生率及死亡率最高的肿瘤，2012年的全球肺癌新发病例约为180万，占全部肿瘤病例的13％；其中男性发病率为52.4例/10万人，病死率为32.0例/10万人，女性发病率为15.4例/10万人，病死率为12.1例/10万人。肺癌也是中国发生率及死亡率最高的恶性肿瘤，2015年我国的总发病率为34.4例/10万人，病死率27.5例/10万人，均高于世界平均水平；且多项研究表明我国肺癌发生率及病死率还在上升趋势，肺癌的防治形势相当严峻。临床上，非小细胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)占全部肺癌病例的70％～80％，主要有肺腺癌及肺鳞癌等病理类型。据统计，70％～80％的NSCLC患者在就诊时已经处于肿瘤晚期，丧失了最佳手术时机，从而导致NSCLC治疗效果差，死亡率高，因此，早期诊断对于NSCLC的治疗非常关键。
目前，放化疗和靶向治疗是治疗NSCLC的主要方式，随着分子生物学的发展，多种基因突变和表达异常的分子机制被证实与NSCLC的发病或耐药相关，通过靶向药物可以更精准实现治疗。
迄今为止，以基因异常表达为基础的NSCLC预后评估尚不成熟，一方面是因为基于基因表达差异为基础的基因分型方法，无法完全反映非小细胞肺癌患者的临床预后特征；另一方面是影响非小细胞肺癌患者生存预后的因素中，除了恶性肿瘤本身进展情况外，更夹杂着患者机体本身的多方面影响。因此，开发非小细胞肺癌预后评估工具有着重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非小细胞肺癌诊断试剂盒；
本发明的另一目的在于提供一种非小细胞肺癌预后试剂盒；
本发明的再一目的在于提供一种非小细胞肺癌的治疗制剂。
本发明所采取的技术方案是：
定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂在制备非小细胞肺癌的检测和/或预后试剂中的应用。
一种非小细胞肺癌检测试剂盒，该试剂盒含有能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂。
作为上述非小细胞肺癌检测试剂盒的优选，该试剂盒含有定量检测基因PLPP4转录水平的引物。
作为上述非小细胞肺癌检测试剂盒的优选，所述引物的序列如下所示：
上游引物：5'-TTTGGATCCGTTCCAGAGAG-3'；
下游引物：5'-CAGGGGTGTGAGGAAAGAAA-3'。
一种非小细胞肺癌的预后试剂盒，该试剂盒含有能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂。
作为上述非小细胞肺癌预后试剂盒的优选，该试剂盒含有定量检测基因PLPP4转录水平的引物。
能够抑制基因PLPP4表达的试剂和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂在制备非小细胞肺癌的治疗制剂中的应用。
一种非小细胞肺癌的治疗制剂，该治疗制剂含有：能够抑制基因PLPP4表达的试剂；和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂。
作为上述非小细胞肺癌的治疗制剂的优选，该治疗制剂含有能够使基因PLPP4沉默的试剂。
作为上述非小细胞肺癌的治疗制剂的优选，能够使基因PLPP4沉默的试剂为以下LNA修饰sisiRNA序列中的任意一种：
LNA修饰sisiRNA序列sisi#1：
正义序列片段：5'-gcCagaaGa-3'5'-gauCuggcuCTaua-3'；
反义序列片段：5'-uAGagccagaucucuucuggcug-3'；
LNA修饰sisiRNA序列sisi#2：
正义序列片段5'-cuGaaauuaaGg-3'5'-aaGccuuCTua-3'；
反义序列片段5'-aGAaggcuuccuuaauuucaguc-3'；
其中，a为腺嘌呤核糖核苷酸，u为尿嘧啶核糖核苷酸，g为尿嘌呤核糖核苷酸，c为胞嘧啶核糖核苷酸，A为腺嘌呤锁核酸，T为胸腺嘧啶锁核酸，G为尿嘌呤锁核酸，C为胞嘧啶锁核酸。
本发明的有益效果是：
本发明发现PLPP4(磷脂酸磷脂酶4)在非小细胞肺癌的肿瘤组织及细胞系中高表达，PLPP4在肺恶性肿瘤组织中高表达与差的临床病理分级相关，并且与患者短的总生存时间及无进展生存时间相关，通过沉默PLPP4能影响体外肺癌细胞增殖和体内成瘤，这些信息都预示着PLPP4可作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后的靶点。本发明利用荧光定量检测PLPP4的引物，作为非小细胞肺癌诊断和预后的试剂；特异性沉默PLPP4的LNA修饰sisiRNA作为非小细胞肺癌的治疗药剂。
附图说明
图1：荧光定量聚合酶链反应检测PLPP4在配对非小细胞肺癌中RNA的表达情况；图中，ANT为癌旁正常组织，T为肿瘤组织，ADC为肺腺癌，SQC为肺鳞癌，ASC为肺腺鳞癌，P1～8为1号至8号患者；
图2：免疫印迹检测PLPP4在配对非小细胞肺癌中蛋白质的表达情况；图中，ANT为癌旁正常组织，T为肿瘤组织，ADC为肺腺癌，SQC为肺鳞癌，ASC为肺腺鳞癌，P1～8为1号至8号患者；
图3：荧光定量聚合酶链反应检测多个肺癌细胞系中PLPP4的mRNA表达情况；图中，WI-38为正常人胚肺细胞，A549、Calu-3、NCI-H226、NCI-H292、NCI-H358、NCI-H1650和NCI-H1975均为非小细胞肺癌细胞；
图4：免疫印迹检测多个肺癌细胞系中PLPP4的蛋白质表达情况；图中，WI-38为正常人胚肺细胞，A549、Calu-3、NCI-H226、NCI-H292、NCI-H358、NCI-H1650和NCI-H1975均为非小细胞肺癌细胞；
图5：免疫组化检测PLPP4在肺良性病变及恶性组织中的表达；图中，ADC为肺腺癌，SQC为肺鳞癌；
图6：PLPP4在肺部良性病变及恶性组织中的免疫组化评分；
图7：非小细胞肺癌肿瘤组织中PLPP4的高表达预示着患者较短的总生存时间；图中，HR为风险比；
图8：非小细胞肺癌肿瘤组织中PLPP4的高表达预示着患者较短的无进展生存时间；图中，HR为风险比；
图9：沉默PLPP4对PLPP4在非小细胞肺癌细胞系中表达的影响；A为荧光定量聚合酶链反应检测PLPP4的mRNA表达情况；B为免疫印迹检测PLPP4的蛋白质表达情况，图中，sisi#1和sisi#2为两条靶向PLPP4的LNA修饰sisiRNA，A549和Calu-3为非小细胞肺癌细胞；
图10：CCK-8检测非小细胞肺癌细胞的增殖；A为沉默PLPP4影响非小细胞肺癌细胞A549的体外增殖；B为沉默PLPP4影响非小细胞肺癌细胞Calu-3的体外增殖；图中，sisi#1和sisi#2为两条靶向PLPP4的LNA修饰sisiRNA；
图11：典型的肺部大体及显微切片图，图中，sisi#1和sisi#2为两条靶向PLPP4的LNA修饰sisiRNA；
图12：肺部节结数统计，图中，sisi#1和sisi#2为两条靶向PLPP4的LNA修饰sisiRNA。
具体实施方式
定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂在制备非小细胞肺癌的检测和/或预后试剂中的应用。
一种非小细胞肺癌检测试剂盒，该试剂盒含有能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂。
作为上述非小细胞肺癌检测试剂盒的优选，该试剂盒含有定量检测基因PLPP4转录水平的引物。
作为上述非小细胞肺癌检测试剂盒的优选，所述引物的序列如下所示：
上游引物：5'-TTTGGATCCGTTCCAGAGAG-3'；
下游引物：5'-CAGGGGTGTGAGGAAAGAAA-3'。
一种非小细胞肺癌的预后试剂盒，该试剂盒含有能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂。
作为上述非小细胞肺癌预后试剂盒的优选，该试剂盒含有定量检测基因PLPP4转录水平的引物。
能够抑制基因PLPP4表达的试剂和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂在制备非小细胞肺癌的治疗制剂中的应用。
一种非小细胞肺癌的治疗制剂，该治疗制剂含有：能够抑制基因PLPP4表达的试剂；和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂。
作为上述非小细胞肺癌的治疗制剂的优选，该治疗制剂含有能够使基因PLPP4沉默的试剂。
作为上述非小细胞肺癌的治疗制剂的优选，能够使基因PLPP4沉默的试剂为以下LNA修饰sisiRNA序列中的任意一种：
LNA修饰sisiRNA序列sisi#1：
正义序列片段：5'-gcCagaaGa-3'5'-gauCuggcuCTaua-3'；
反义序列片段：5'-uAGagccagaucucuucuggcug-3'；
LNA修饰sisiRNA序列sisi#2：
正义序列片段5'-cuGaaauuaaGg-3'5'-aaGccuuCTua-3'；
反义序列片段5'-aGAaggcuuccuuaauuucaguc-3'；
其中，a为腺嘌呤核糖核苷酸，u为尿嘧啶核糖核苷酸，g为尿嘌呤核糖核苷酸，c为胞嘧啶核糖核苷酸，A为腺嘌呤锁核酸，T为胸腺嘧啶锁核酸，G为尿嘌呤锁核酸，C为胞嘧啶锁核酸。
本发明中，术语“锁核酸”，简称LNA(lock mucleic acid)是一种类寡核苷酸衍生物，与其他寡核苷酸相比，具有更高的热稳定性、更好的分子杂交能力、更强的抗核酸酶降解能力、更好的脂溶性和更低的细胞毒性等优势。
本发明中，术语“sisiRNA”，是内部片段化的小干扰RNA(small internallysegmented interfering RNA,sisiRNA)。
下面结合具体实验进一步阐述本发明内容，但并不局限于此。
本发明所有临床样品均来自广东省医学分子诊断协同创新发展中心临床生物样品库(江门市中心医院)。
实验1、PLPP4在非小细胞肺癌组织及细胞系中高表达
方法：
(1)临床样品
本实施例非小细胞肺癌肿瘤及癌旁正常组织的标本来至手术过程，并保存在液氮中，所得样品经冰冻切片、HE染色后，由两名以上病理医师判读，保证肿瘤组织中肿瘤细胞多于75％，正常对照组织中无癌细胞成分，共8对样本，包括P1～P8，组织学分类上，P1和P4来自SQC(肺鳞癌)、P2和P4～P8来自ADC(肺腺癌)、P3来自ASC(肺腺鳞癌)。
(2)细胞系及其培养
正常人胚肺细胞(WI-38)和人非小细胞肺癌细胞(A549、Calu-3、NCI-H226、NCI-H292、NCI-H358、NCI-H1650和NCI-H1975)均购自中国科学院细胞库；正常人胚肺细胞(WI-38)培养基组成为MEM培养液，添加1.5g/L NaHCO3、0.11g/L丙酮酸钠和10％FBS；人非小细胞肺癌细胞(A549、Calu-3、NCI-H226、NCI-H292、NCI-H358、NCI-H1650和NCI-H1975)培养基组成为RPMI-1640培养液，添加1.5g/L NaHCO3、0.11g/L丙酮酸钠和10％FBS；所有细胞的培养环境均为，5％CO2，37.5℃恒温恒湿。
(3)荧光定量聚合酶链反应检测PLPP4mRNA
取约100mg的待测组织，在液氮中用研钵碾碎，加入TRIzol室温裂解10min，每1mlTRIzol裂解液加入0.2ml氯仿，剧烈振摇30s，静置5min。4℃12,000g离心15min，吸取上清至新离心管中，加入等体积的异丙醇，吹打均匀，静置10min，4℃12,000g离心5min，用含75％乙醇的DEPC水溶洗涤RNA沉淀3次，稍事干燥后，用DEPC水溶解RNA。测得浓度后按PrimeScript RT reagent Kit说明书操作，进行反转录；按SYBR Premix Ex Taq II Kit说明书操作(引物信息见表1)，在7500实时定量PCR系统上，选用2-ddCt相对定量法进行检测分析，其中选用正常对照组织为对照，内参基因为GAPDH，求算各目标基因的相对mRNA表达量。
表1、荧光定量检测引物序列
(4)免疫印迹检测PLPP4蛋白表达水平
取约100mg的待测组织，在液氮中用研钵碾碎，加入RIPA裂解液冰上裂解30min，收集裂解液，4℃12,000g离心15min，收集上清，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，向上清液加入体积量1/4的5×上样缓冲液，沸水浴10min后，冰浴5min。使用SDS-PAGE蛋白电泳系统，上样量为50μg总蛋白，电泳参数为10％分离胶、5％浓缩胶，100V电泳90min至溴酚蓝指示剂迁移至底部后，进行电转移，使用0.45μm的PVDF膜，300mA冰浴电转90min。电转结束后，膜使用5％脱脂奶粉封闭，TBST漂洗3遍5min，加入封闭液稀释的一抗，4℃孵育过夜，TBST漂洗3遍5min，加入封闭液稀释的二抗，室温孵育1h，TBST漂洗3遍5min，加入ECL发光液，置于压片夹中X光底片感光1min至20min，经显影定影处理；免疫印迹检测以α-tubulin为对照。
检测结果及分析：
为了观察PLPP4在非小细胞肺癌中表达情况，采用荧光定量聚合酶链反应和免疫印迹方法，检测了PLPP4在8对配对的非小细胞肺癌临床样品和8株细胞系的表达水平。结果如图1和图2所示，相对于癌旁正常组织(ANT)，8例非小细胞肺癌的肿瘤组织中均高表达PLPP4；如图3和图4所示，相对于正常人胚肺细胞(WI-38)，7株非小细胞肺癌细胞系中均高表达PLPP4。以上信息说明：PLPP4在非小细胞肺癌组织中高表达。这提示PLPP4可以作为非小细胞肺癌诊断的靶点，含有能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂可作为非小细胞肺癌的诊断试剂。
实验2、PLPP4在恶性肺肿瘤组织中高表达并与差的临床病理分级相关
方法：
(1)临床样品
48例肺部良性病变组织均来至手术过程，并通过石蜡包埋保存。265例非小细胞肺癌组织来至手术或穿刺活检，并通过石蜡包埋保存，均有详细的临床病理信息。
(2)免疫组织化学检测
先将组织切片65℃热处理1h后，置二甲苯脱蜡2次每次5min；将切片依次用100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇和纯水水化，每次1min；取出后滴加3％过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶；将切片置于盛有EDTA pH9.0修复液的容器中，高压锅高压修复10min；取出切片后用免疫组化笔包围组织并用PBS缓冲液漂洗3min，甩干后滴加山羊血清封闭液(试剂A)室温孵育20min；去除试剂A滴加用抗体稀释液稀释好的一抗工作液4℃孵育过夜；去除一抗后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴入生物素标记的羊抗兔二抗工作液(试剂B)，室温孵育20min；弃去试剂B后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液(试剂C)，室温孵育10min；弃去试剂C后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴加DAB显色液，室温孵育1min～5min；将切片浸入自来水中终止显色，苏木素染液复染1min，自来水清洗后用盐酸酒精分化5s；将切片用75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇梯度脱水，每次3min，再置37℃干燥箱处理30min，环保树脂封片剂封片。
(3)免疫组化评分
根据免疫组化的肿瘤细胞阳性率及染色深度对蛋白的表达进行综合评分。首先根据切片肿瘤细胞的阳性率进行评分，没有阳性的肿瘤细胞：0分；<10％肿瘤细胞为阳性：1分；10％～35％肿瘤细胞为阳性：2分；35％～70％肿瘤细胞为阳性：3分；>70％肿瘤细胞为阳性：4分。然后根据阳性肿瘤细胞的总体染色深度进行评分：没有染色信号为0分；淡黄色为1分；深黄色为2分；棕黄色为3分。最后将阳性率评分与染色强度评分相乘，得到0、1、2、3、4、6、8、9或12共9个等级的免疫组化染色评分(Staining index,SI)。
检测结果与分析：
利用免疫组化检测48例肺部良性病变组织和265例非小细胞肺癌组织，典型的免疫组化结果如图5所示：肺腺癌及肺鳞癌的癌组织中均显著高表达PLPP4，而良性的肉芽肿(Granuloma)组织中并无显著的PLPP4表达。
进一步利用免疫组化的评分标准，对上述临床样品进行PLPP4表达情况的判读，结果如图6所示，发现PLPP4在非恶性组织的评分集中在0至2分间，而癌组织中的评分集中在3至8分间。按>4分定义为高表达PLPP4，可明确恶性肿瘤组织中PLPP4的表达高于良性增生组织(P<0.05，详见表2)。
表2、PLPP4在良性病变及恶性病变的表达相关性分析。
进一步统计了265例非小细胞肺癌组织中PLPP4的表达与患者病理及临床数据的相关性。如表3所示，PLPP4的高表达与高级别的病理分级、T分期及临床总分期相关(P<0.05)。
表3、265例非小细胞肺癌患者中，PLPP4的免疫组化评分与患者临床及病理信息的相关性
以上信息表明：PLPP4在肺恶性肿瘤组织中高表达，并与差的临床病理分级相关。这提示PLPP4可以作为非小细胞肺癌诊断的靶点，并且定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂还可以辅助诊断非小细胞肺癌的临床病理分级。
实验3、PLPP4高表达与患者短的总生存时间及无进展生存时间相关
在实验2结果的基础上，结合265例非小细胞肺癌患者的随访数据，统计分析了PLPP4的表达情况与患者的总生存时间及无进展生存时间的相关性。结果如图4所示，肿瘤组织中PLPP4的高表达预示着患者较短的总生存时间(图7)及较短的无进展生存时间(图8)。因此，可以预料，PLPP4可作为非小细胞肺癌患者预后的潜在指标，能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂可应用于非小细胞肺癌的预后评估。
实验4、沉默PLPP4能影响非小细胞肺癌细胞体外的增殖
方法：
(1)靶向PLPP4的LNA修饰内部片段化的小干扰RNA设计
首先，采用常规方法，针对PLPP4设计和筛选出两条最有效的siRNA序列；其次，对上述两条siRNA进行优化，将正义序列分为变性温度相近的两条小片段，即得sisiRNA；最后，对两条sisiRNA进行LNA修饰、全骨架的硫代磷酸化及翻译序列片段的3’-末端胆固醇修饰，获得针对PLPP4的LNA修饰sisiRNA，分别命名为sisi#1和sisi#2，其序列和修饰情况如下：
sisi#1的正义序列片段5'-gcCagaaGa-3'5'-gauCuggcuCTaua-3'；
sisi#1的反义序列片段5'-uAGagccagaucucuucuggcug-3'(SEQ ID NO:5)；
sisi#2的正义序列片段5'-cuGaaauuaaGg-3'5'-aaGccuuCTua-3'；
sisi#2的反义序列片段5'-aGAaggcuuccuuaauuucaguc-3'(SEQ ID NO:6)；
注：a为腺嘌呤核糖核苷酸，u为尿嘧啶核糖核苷酸，g为尿嘌呤核糖核苷酸，c为胞嘧啶核糖核苷酸，A为腺嘌呤锁核酸，T为胸腺嘧啶锁核酸，G为尿嘌呤锁核酸，C为胞嘧啶锁核酸。
将设计好的sisi#1和sisi#2委托华大基因公司合成。
(2)CCK-8检测细胞活性
将1×103细胞(A549和Calu-3)接种于96孔培养板中，加入终浓度为10nmol/L的靶向PLPP4的LNA修饰sisiRNA(sisi#1和sisi#2)正常培养0d～5d，当培养时间结束时，弃去原培养液，每孔加入含10％CCK-8的培养液，5％CO2 37℃孵育2h，酶标仪检测各孔450nm处吸光度，扣除背景值后以未加药孔(对照组)为基准求算各组相对吸光度。
检测结果与分析：
将sisi#1和sisi#2分别以10nmol/L浓度作用加入正常培养的A549及Calu-3细胞中作用48h。利用荧光定量聚合酶链反应及免疫印迹检测细胞PLPP4的表达情况，实验方法同实验1。结果如图9所示，sisi#1和sisi#2处理48h后，能显著降低两种非小细胞肺癌细胞中PLPP4的表达水平。进一步利用CCK-8检测肺癌细胞活性，如图10所示，10nmol/L浓度的sisi#1和sisi#2处理后，能显著抑制两种非小细胞肺癌细胞的增殖情况。这提示PLPP4可以作为非小细胞肺癌治疗的靶点，能够使基因PLPP4沉默的试剂可以作为非小细胞肺癌的治疗制剂，进一步的，可以料想能够抑制基因PLPP4表达的试剂，和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂都可以作为非小细胞肺癌的治疗制剂。
实验5、沉默PLPP4能影响非小细胞肺癌细胞体内成瘤
动物实验：
裸鼠尾静脉注射肺癌细胞建立的肺癌细胞肺定植模型中，将6周龄的BALB/c-nu裸鼠18只，利用尾静脉注射A549肺癌细胞，其细胞量为5×105。接种7天后，随机分为3组(每组6只裸鼠)，通过每周尾静脉注射两次100μl浓度为100μmol/L的sisi#1或sisi#2，连续给药4周，最后再接种肿瘤细胞35天，安乐死动物并取出肺脏，固定并进行苏木精-伊红染色(H&E)，观察定量各组间节结数。
结果与分析：
为了进一步验证靶向PLPP4的LNA修饰sisiRNA是否具备体内抑制非小细胞肺癌细胞成瘤的能力，通过动物实验进行验证，典型的肺部大体及显微切片结果如图11所示，肺部节结数统计结果如图12所示，相对于对照组，给予sisi#1和sisi#2处理的裸鼠肺部肿瘤节结数明显减少并缩小，这提示，PLPP4可以作为非小细胞治疗的靶点，能够使基因PLPP4沉默的试剂可以作为非小细胞肺癌的治疗制剂，进一步的，可以料想能够抑制基因PLPP4表达的试剂，和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂都可以作为非小细胞肺癌的治疗制剂。
SEQUENCE LISTING
<110> 江门市中心医院
<120> PLPP4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttggatccg ttccagagag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caggggtgtg aggaaagaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaccgtcaa ggctgagaac 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggtgaagac gccagtgga 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 小写表示核糖核苷酸，大写表示锁核酸
<400> 5
uAGagccaga ucucuucugg cug 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 小写表示核糖核苷酸，大写表示锁核酸
<400> 6
aGAaggcuuc cuuaauuuca guc 23

Claims (10)

1.定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂在制备非小细胞肺癌的检测和/或预后试剂中的应用。
2.一种非小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的一种非小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有定量检测基因PLPP4转录水平的引物。
4.根据权利要求3所述的一种非小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于：所述引物的序列如下所示：
上游引物：5'-TTTGGATCCGTTCCAGAGAG-3'；
下游引物：5'-CAGGGGTGTGAGGAAAGAAA-3'。
5.一种非小细胞肺癌的预后试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有能够定量检测基因PLPP4拷贝数和/或基因PLPP4表达水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的一种非小细胞肺癌预后试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有定量检测基因PLPP4转录水平的引物。
7.能够抑制基因PLPP4表达的试剂和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂在制备非小细胞肺癌的治疗制剂中的应用。
8.一种非小细胞肺癌的治疗制剂，其特征在于：该治疗制剂含有：能够抑制基因PLPP4表达的试剂；和/或能够在体内使蛋白PLPP4活性降低或失活的试剂。
9.根据权利要求8所述的一种非小细胞肺癌的治疗制剂，其特征在于：该治疗制剂含有能够使基因PLPP4沉默的试剂。
10.根据权利要求9所述的一种非小细胞肺癌的治疗制剂，其特征在于：能够使基因PLPP4沉默的试剂为以下LNA修饰sisiRNA序列中的任意一种：
LNA修饰sisiRNA序列sisi#1：
正义序列片段：5'-gcCagaaGa-3'5'-gauCuggcuCTaua-3'；
反义序列片段：5'-uAGagccagaucucuucuggcug-3'；
LNA修饰sisiRNA序列sisi#2：
正义序列片段5'-cuGaaauuaaGg-3'5'-aaGccuuCTua-3'；
反义序列片段5'-aGAaggcuuccuuaauuucaguc-3'；
其中，a为腺嘌呤核糖核苷酸，u为尿嘧啶核糖核苷酸，g为尿嘌呤核糖核苷酸，c为胞嘧啶核糖核苷酸，A为腺嘌呤锁核酸，T为胸腺嘧啶锁核酸，G为尿嘌呤锁核酸，C为胞嘧啶锁核酸。
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Assignee: Jiangmen Yifengtang Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: JIANGMEN CENTRAL Hospital

Contract record no.: X2023980036579

Denomination of invention: Application of PLPP4 as a diagnostic, therapeutic, and prognostic target for non-small cell lung cancer

Granted publication date: 20210219

License type: Common License

Record date: 20230614

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