CN102251035B - 基于ssx-2基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于SSX-2基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明的试剂盒，不仅可以应用于定性诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者SSX-2基因的表达水平。本发明为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于SSX-2基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是威胁生命的浆细胞性恶性肿瘤，在血液恶性肿瘤中发病率位于第二位。尽管干细胞移植以及新型药物治疗可以使病情得到有效控制，但很少有患者能够取得完全缓解甚至治愈，复发和死亡的结局仍不可避免。
分子生物学的发展使越来越多的肿瘤相关基因为人们所认知，这些重要的分子标志已在血液系统恶性肿瘤的诊断和治疗中发挥了极大的作用，在MM中虽然已发现涉及免疫球蛋白基因重排、C-MYC、RAS癌基因突变及人类端粒酶逆转录酶mRNA过度表达等，但缺乏公认的肿瘤相关的特异性诊断、微小残留病检测和预后评估的分子靶标。
癌睾丸抗原(Cancer testis antigen，CT抗原)基因是与恶性肿瘤相关的基因家族，编码免疫原性蛋白质，在过去15年间已鉴定了40多个家族，表达特点是限制性表达于正常组织睾丸、卵巢和胚胎滋养层细胞，其他正常组织几乎不表达，而在多种肿瘤组织中有不同频率的表达，且可诱导抗体介导和T细胞介导的免疫反应。基于其在肿瘤患者及正常组织中的表达特点和免疫原性，CT抗原已被认为是有应用前景的人类恶性肿瘤免疫治疗的靶标，并有可能成为重要的诊断和预后标志。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于SSX-2基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。
本发明保护一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有SSX-2基因(NCBI基因库序列号：NM_175698/003147)或其片段的重组质粒。所述阳性质粒可为含有序列表的序列7所示的SSX-2基因片段的重组质粒。所述阳性质粒具体可为将pMD18-T载体与序列表的序列7所示的SSX-2基因片段连接得到的重组质粒。
所述试剂盒还可包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为ABL基因(NCBI基因库序列号：NM_005157)。所述特异性引物对乙具体可为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列具体可如序列表的序列6所示。
所述试剂盒还可包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质粒。所述内参质粒可为含有序列表的序列8所示的ABL基因片段的重组质粒。所述内参质粒具体可为将pMD18-T载体与序列表的序列8所示的ABL基因片段连接得到的重组质粒。
所述特异性引物对甲和所述探针甲可用于制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。
在很多多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，SSX-2基因表达，而在正常人的骨髓或外周血中，SSX-2基因不表达。且处于不同ISS期的多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，SSX-2基因的阳性率具有差异性。本发明的试剂盒，不仅可以应用于定性辅助诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者SSX-2基因的表达水平。SSX-2基因的表达水平有希望成为MM辅助诊断、预后和疗效监测指标，对其进行深入研究有助于了解MM的病理机制，寻求新的治疗策略。本发明为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
附图说明
图1为内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线。
图2为阳性对照病人的RQ-PCR荧光标准曲线。
图3为SSX-2基因的表达量与患者生存时间的相关性结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
kits：购自Invitrogen公司。RNAsin：购自华美生物技术公司。dNTP：购自Pharmecia公司。Mo-MLV逆转录酶、5×标准缓冲液：购自Promega公司。DNA连接酶：购自TakaRa公司。Universal PCR Master mix：购自天根生物技术有限公司。Phusion High-Fidelity PCR Kit：购自New England Biolabs公司。RPMI8226细胞：购自美国ATCC(美国标准生物品收藏中心)，产品目录号为CCL-155。U266细胞：购自美国ATCC，产品目录号为TIB-196。KM3细胞：购自上海拜力生物科技有限公司。K562细胞：购自上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录：QK10269。MEG-01细胞：购自上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录：QK10748。HL60细胞：购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 23。
多发性骨髓瘤诊断及分期标准参照文献：Greipp PR，San Miguel J，Durie BG，etal.International Staging System for Multiple Myeloma.Journal of ClinicalOncology，2005，15：3412-3420.。疗效的评价标准参照文献：Durie BG，HarousseauJL，Miguel JS，et al.International uniform response criteria for multiplemyeloma.Leukemia.2006，20：1467-1473.。统计分析应用SPSS软件v.13.0。计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验。临床资料与CT抗原基因表达间的相关性用直线相关分析。p＜0.05被认为是有统计学意义。通过单因素和多因素分析评价因素与生存的相关性，采用Log-rank检验鉴定生存相关因素，p＜0.05的变量纳入Cox回归分析，p＜0.2定义为与生存预后相关的因素。
实施例3至8中的PCR参数均如下：
PCR反应体系(10μl)：上游引物0.9μM，下游引物0.9μM，探针0.25μM，2×TaqMan通用PCR公共体系5μl(ABI公司，美国)，质粒1μl；其余为去离子水。
PCR反应条件：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min，50个循环。
实施例1、特异性引物对和探针的设计
SSX-2基因(NCBI基因库序列号：NM_175698/003147)位于人染色体Xp11.22，针对SSX-2基因设计特异性引物对甲(由上游引物SSX-FP和下游引物SSX-RP组成，扩增产物为110bp)和探针甲(探针SSX-T-probe)：
上游引物SSX-FP(序列表的序列1)：5’-TAACCGTGGGAATCAGGTTGA-3’
下游引物SSX-RP(序列表的序列2)：5’-CCTCCGAATCATTTCCTTCCT-3’
探针SSX-T-probe(5’→3’)：
FAM-CCGAAGATCATGCCCAAGAAGCCAG-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列3)。
针对ABL1基因(内参基因；NCBI基因库序列号：NM_005157)设计的特异性引物对乙(由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1_R组成，扩增产物为124bp)和探针乙(探针ABL1-T-probe)：
上游引物ABL1-F(序列表的序列4)：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’；
下游引物ABL1_R(序列表的序列5)：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’；
探针ABL1_T-probe(5’→3’)：
FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(核苷酸序列为序列表的序列6)。
分别合成特异性引物对甲、探针甲、特异性引物对乙和探针乙。(可参考文献合成：Gabert J，Beillard E，van der Velden VH，et al.Standardization and qualitycontrol studies of’real-time’quantitative reverse transcriptase polymerasechain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection inleukemia-a Europe Against Cancer program.Leukemia.2003，17：2318-57.)。
实施例2、相关质粒的制备
一、阳性对照质粒(含有SSX-2基因片段的质粒)的制备
以SSX-2基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列7所示(435bp)，扩增产物经纯化后，克隆入pMD18-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了阳性对照质粒丁(骨架质粒为pMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列7所示cDNA)。
PCR扩增所用的引物对如下：
上游引物：5’-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3’；
下游引物：5’-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3’。
二、内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备
以正常人(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列8所示(124bp)，扩增产物经纯化后，克隆入pMD18-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了内参对照质粒(骨架质粒为pMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列8所示cDNA)。
PCR扩增所用的引物对如下：
上游引物：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’；
下游引物：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’。
三、阴性对照质粒
pMD18-T质粒。
实施例3、检测阳性对照质粒的灵敏度检测
将实施例2得到的内参对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(每微升分别含有106、105、104、103、102、101、100个拷贝的ABL基因片段)；通过测定吸光度值计算SSX-2基因片段或ABL基因片段的拷贝数)。将各个内参对照质粒采用实施例1得到的特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线见图1(阈值为0.082)，函数为log10ABL1＝(Ct-38.46)/-3.22，相关系数达到0.99以上，检测内参基因的灵敏度达10个拷贝。
将一例多发性骨髓瘤患者(志愿者)的cDNA，用灭菌双蒸注射用水1：10梯度稀释，采用实施例1得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪上进行RQ-PCR(美国ABI公司7500-FAST型)。扩增曲线显示Ct值和SSX-2启始模板量的对数存在线性相关(相关系数大于0.99，检测灵敏度达10-4，阈值为0.082；见图2)，其扩增效率与ABL基因相近，为减少实验误差，均用ABL标准曲线计算基因拷贝数，检测SSX-2基因片段的灵敏度可达10个拷贝。
实施例4、检测细胞系及多发性骨髓瘤患者
一、试剂盒的组装
试剂盒由如下组件组成：实施例1制备的针对SSX-2基因的特异性引物对甲和探针甲、针对ABL1基因的特异性引物对乙和探针乙；实施例2制备的阳性对照质粒和内参对照质粒。
二、应用步骤一的试剂盒检测细胞系
分别检测各个细胞系中SSX-2基因的表达水平。每个细胞系样本皆重复检测3次。步骤如下：
1、提取各个细胞的总RNA，反转录为cDNA。
2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为阈值为0.082。
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例3。
用内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各细胞系中SSX-2基因和ABL1基因的拷贝数。以SSX-2基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示SSX-2基因的相对表达水平(％)。结果见表1。
表1 在血液肿瘤细胞系中SSX-2基因的相对表达水平
| 细胞系 | 来源 | SSX 2基因的相对表达水平 |
| RPMI8226 | 多发性骨髓瘤患者 | 0.04 |
| U266 | 多发性骨髓瘤患者 | 22.63 |
| KM3 | 多发性骨髓瘤患者 | 0.14 |
| K562 | 慢性髓性白血病 | 0.00 |
| MEG-01 | 慢性髓性白血病 | 0.00 |
| HL60 | 急性髓性白血病患者 | 0.00 |
三、应用步骤一的试剂盒检测多发性骨髓瘤患者
分别对若干多发性骨髓瘤患者(志愿者)及其他志愿者进行检测。步骤如下：
1、用TRIzo1试剂盒(购自美国Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取各个志愿者的骨髓标本的RNA(或外周血标本的RNA也可)，反转录为cDNA。
2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为阈值为0.082。
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例3。
用内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各患者中SSX-2基因和ABL1基因的拷贝数。以SSX-2基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示SSX-2基因的相对表达水平(％)。结果见表2。
表2 在血液肿瘤患者和正常人骨髓中SSX-2基因的相对表达水平
注：如果相对表达量检测结果大于0，为阳性结果；否则为阴性结果，记为“—”。
多发性骨髓瘤患者骨髓中SSX-2基因的阳性率和表达水平均高于CML患者，在22例健康供者的检测结果均为阴性。
实施例5、SSX-2基因与疗效的相关性
一、SSX-2基因在不同疗效患者中的阳性率
共检测138例多发性骨髓瘤患者(志愿者)的138份骨髓样本。138例多发性骨髓瘤患者中，初治患者60例，治疗后患者78例。治疗后患者中，难治复发患者10例，治疗有效患者(部分缓解和完全缓解)17例。
各个基因的相对表达量检测方法同实施例4的步骤三。如果相对表达量检测结果大于0，为阳性结果；否则为阴性结果。结果见表3。
表3 MM患者中SSX-2基因表达的阳性率(p＜0.01)
| 阳性患者数 | 阳性率 | |
| 多发性骨髓瘤患者(n＝138) | 39 | 28.3％ |
| 初治患者和难治复发患者(n＝60+10＝70) | 23 | 32.9％ |
| 治疗有效患者(n＝17) | 0 | 0％ |
实施例6、SSX-2基因与多发性骨髓瘤ISS分期的相关性
检测处于不同ISS分期的多发性骨髓瘤患者(志愿者)中SSX-2基因的表达量。方法同实施例4的步骤三。如果相对表达量检测结果大于0，为阳性结果；否则为阴性结果。结果见表4。
表4 SSX-2基因的表达量与多发性骨髓瘤ISS分期的关系
| ISS分期 | 阳性患者个数 | 阳性率 | 均值±标准差 |
| I(n＝10) | 2 | 20％ | 0.2±0.2 |
| II(n＝24) | 5 | 20.8％ | 0.3±0.5 |
| III(n＝31) | 13 | 41.9％ | 0.7±2.1 |
ISS分期是临床常用的分期系统和预后评估系统，有很好的可比性和可重复性。ISS I期和ISS II的阳性率显著低于ISS III期患者骨髓中SSX-2基因检测结果的阳性率。
实施例7、SSX-2基因的表达量与患者病程的相关性
对若干多发性骨髓瘤患者(志愿者)治疗前后获得的107份骨髓样本进行分析。根据疗效，分为治疗有效组和治疗无效组。治疗有效组包括完全缓解(CR)，未完全缓解(nCR)或部分缓解(PR)的患者。治疗无效组，包括复发或疾病进展的患者。方法同实施例4的步骤三。结果见表5。
表5 治疗有效患者组和治疗无效患者组中SSX-2基因表达水平的变化
注：n值为样本量，p值为治疗前、治疗后组各基因表达水平的检验值。
结果表明，在个体患者的骨髓跟踪样本中SSX-2基因表达水平的变化趋势与该患者的临床病程一致。初治患者随着治疗介入获得完全缓解(CR)或部分缓解(PR)时，上述SSX-2基因表达水平下降。而治疗无效的患者，SSX-2基因稳定高表达，复发或疾病进展时，基因表达水平升高。
实施例8、SSX-2基因的表达量与患者生存时间的相关性
检测75例多发性骨髓瘤患者(志愿者)骨髓中SSX-2基因的表达量和患者生存时间的关系。方法同实施例4的步骤三。结果见图3。
SSX-2基因阳性的患者的生存时间显著少于该基因阴性的患者。
Claims (8)
1.一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有序列表的序列7所示的SSX-2基因片段的重组质粒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性质粒为将pMD18-T载体与序列表的序列7所示的SSX-2基因片段连接得到的重组质粒。
4.如权利要求1至3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为ABL基因。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内参质粒；所述内参质粒为含有序列表的序列8所示的ABL基因片段的重组质粒。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述内参质粒为将pMD18-T载体与序列表的序列8所示的ABL基因片段连接得到的重组质粒。
8.特异性引物对甲和探针甲在制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
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