CN110229891A

CN110229891A - 无创诊断男性骨质疏松症的产品

Info

Publication number: CN110229891A
Application number: CN201910626069.8A
Authority: CN
Inventors: 刘跃洪; 周宇; 陈曦; 王志聪; 张建军; 杨灵; 汪红; 江伟
Original assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Current assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2019-09-13
Also published as: CN110577994A; CN110577994B

Abstract

本发明公开了一种无创诊断男性骨质疏松症的产品。本发明的产品可以检测受试者血液中UTY表达量，根据UTY表达量高低来判断受试者是否为骨质疏松症患者。本发明诊断男性骨质疏松症的方法简便，抽取受试者少量血液即可完成诊断，减少受试者痛苦，且检测结果准确可靠。

Description

无创诊断男性骨质疏松症的产品

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种无创诊断男性骨质疏松症的产品。

背景技术

骨质疏松症是中老年人的常见病，男性骨质疏松的发病率呈上升趋势，与女性相比，男性骨质疏松发生较早、速度更快。酗酒、性腺功能减退和吸烟是男性骨质疏松的主要危险因素。

骨质疏松引起的临床症状有躯干缩短、驼背、腰背疼痛；四肢骨容易发生骨折，且以股骨颈骨折最为常见。早期这些症状不是很明显，如果任其发展下去，所造成的不良后果是非常严重的，50％的人会终生残疾。

疼痛是原发性骨质疏松症最常见的症状，以腰背痛多见，但不少中年男人平时有腰腿不适的感觉时常常误以为是劳累造成的，还有人误认为是人老化的正常表现，容易忽略该病，所以骨质疏松症也被称为“寂静之病”。很多人发现自己腰背疼痛甚至骨折了才去诊治，往往已经错过了最佳治疗时机，因此步入中年的男人要引起高度注意。

男性骨质疏松诊断与PMOP相同。低骨量(低于同性别正常人群的峰值骨量的1～2.5个标准差)、骨质疏松(低于峰值骨量的2.5个标准差以上)或严重PMOP(骨质疏松伴一处或多处自发性骨折)。目前没有直接测定骨强度的临床方法，常常采用下列诊断指标：骨密度低下及(或)脆性骨折。对于继发性骨质疏松，还需要具有引起骨质疏松的明确病因。DXA的缺点是不能测得真实的骨密度，而且无法将皮质骨和小梁骨区别开来，用外周定量CT(peripheral quantitative computed tomography，pQCT)测量桡骨超远端BMD，可得到总体骨密度、小梁骨骨密度、总体骨矿含量、小梁骨骨矿含量、皮质骨骨密度、皮质骨骨矿含量。当BMD测量与临床诊断不符时，为明确骨病变性质，应进一步做骨扫描、骨活检组织形态计量及QCT、μCT、QMR等检查。单光子、单能X线、定量计算机断层照相、定量超声检查等对诊断有一定的参考价值。分析结果时应更注重Z值(Z值即为与同年龄、同性别正常人相比较)。根据原发病表现和BMD测定及脆性骨折诊断继发性低骨量/骨质疏松。脆性骨折是骨强度下降的最终后果，故有过由明确疾病或药物引起的脆性骨折即可诊断继发性骨质疏松。骨矿盐密度测定详见原发性骨质疏松。X线平片对诊断骨质疏松的敏感性和准确性低，对骨质疏松的早期诊断帮助不大。但对于发现有无骨折，与骨肿瘤和关节病变相鉴别，有较大价值。目前尚无一项生化指标可作为骨质疏松的诊断标准，主要用于骨转换分型、判断骨丢失速率、监测病情、评价药物疗效。

近年来，随着生物技术的发展，遗传因素的研究成为骨质疏松诊治领域的热门课题，已有研究表明骨质疏松与体内基因的变化相关，利用基因进行骨质疏松的早期诊断成为未来发展的趋势。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于男性骨质疏松症早期诊断的分子标志物及产品。使用基因标志物来诊断男性骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测UTY基因表达的产品在制备诊断男性骨质疏松症的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测UTY基因表达的产品包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测UTY基因表达水平以诊断男性骨质疏松症的产品。

进一步，通过反转录PCR诊断男性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增UTY基因的引物；通过实时定量PCR诊断男性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增UTY基因的引物；通过免疫检测诊断男性骨质疏松症的产品包括：与UTY蛋白特异性结合的抗体；通过原位杂交诊断男性骨质疏松症的产品包括：与UTY基因的核酸序列杂交的探针；通过芯片诊断男性骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与UTY蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与UTY基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，通过实时定量PCR诊断男性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增UTY基因的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测UTY基因表达的产品可以应用于该平台实现对UTY基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知UTY基因的异常与男性骨质疏松症相关也属于UTY基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断男性骨质疏松症的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测UTY基因转录水平的针对UTY基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的UTY蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括UTY基因在内的多个基因(例如，与男性骨质疏松症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括UTY蛋白在内的多个蛋白质(例如与男性骨质疏松症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与男性骨质疏松症的标志物同时检测，可大大提高男性骨质疏松症诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测UTY基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括UTY蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测UTY基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对UTY基因的引物和/或探针。根据UTY基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测UTY基因表达水平的引物和探针。

与UTY基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测UTY基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测UTY基因的转录水平。

进一步，所述UTY蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述UTY蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与UTY蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对UTY基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。

用于诊断男性骨质疏松症的UTY基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断男性骨质疏松症的UTY基因及其表达产物的来源是血液。

在本发明的上下文中，“UTY基因”包括UTY基因以及UTY基因的任何功能等同物的多核苷酸。UTY基因(Chromosome Y,NC_000024.10(13231827..13480670,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。

在本发明的上下文中，UTY基因表达产物包括UTY蛋白以及UTY蛋白的部分肽。所述UTY蛋白的部分肽含有与男性骨质疏松症相关的功能域。

“UTY蛋白”包括UTY蛋白以及UTY蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括UTY蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与UTY的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是UTY蛋白的融合蛋白。对于与UTY蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留UTY蛋白的生物学活性即可。

在本发明的上下文中，“诊断男性骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有男性骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有男性骨质疏松症的风险。

本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次证明了UTY基因与男性骨质疏松症相关，因此UTY基因成为了诊断男性骨质疏松症的分子标志物，同时为研究男性骨质疏松症的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊断男性骨质疏松症较现有技术中的使用方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。

附图说明

图1显示利用QPCR检测UTY基因在男性骨质疏松症患者和正常人中的表达差异；具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 QPCR检测差异表达基因

一、样品收集

选取30例男性骨质疏松症患者，入选标准：双能X线测量骨密度的T<-2.5；T<-2.5并伴有既往脆性骨折史；肝、肾功能正常者。排除标准：①既往使用过抗骨质疏松药物者；②有糖尿病、甲状腺或甲状旁腺疾病、肾上腺及性腺等内分泌疾病；③继发性骨质疏松症。平均年龄78岁。提取上述患者的外周血作为实验样品，同时收集30例正常人的外周血作为对照样品。

二、在mRNA水平上进行验证

1、总RNA提取

使用天根公司的RNAprep Pure高效血液总RNA提取试剂盒(货号：DP443)提取血液总RNA，按照说明书操作，大致步骤如下：

(1)红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液H(例如待处理的血液样品体积为200μl，则取140μl 10×红细胞裂解液H)，用RNase-Free ddH₂O稀释至1×红细胞裂解液H。

(2)向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H(需自备合适的干净管子)。

注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液H的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的1×红细胞裂解液H的使用体积也要进行相应调整。

(3)在冰上孵育10-15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。

注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20min。

(4)4℃2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。

(5)向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H(加入1×红细胞裂解液H的体积是第1步中全血用量的2倍)，重悬细胞。

(6)4℃，2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的RNA与膜的结合，导致最后RNA产率降低。

(7)向白细胞沉淀中加入裂解液RLH(使用前请加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表1进行，涡旋或使用移液器混匀。

注：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RLH的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失。

表1裂解液使用量表

裂解液μL	健康人类全血(ml)	白细胞数量
			350	多至0.5	多至2*10<sup>6</sup>
600	0.5-1.5	210<sup>6</sup>至110<sup>7</sup>

(8)将溶液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃去过滤柱CS，收集滤液。

注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750μl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。

(9)向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μl或600μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中(吸附柱CR4放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

注意：配制70％乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70％乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR4时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。

(10)如果不进行DNase I消化，可以直接向吸附柱CR4中加入700μl去蛋白液RW1H(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，直接进行步骤14。

DNase I消化：向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(11)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀。

(12)向吸附柱CR4中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

(13)向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(14)向吸附柱CR4中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(15)重复步骤14。

(16)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR4置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：离心后将吸附柱CR4在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的反转录，荧光定量等实验。

(17)将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-50μl RNase-FreeddH2O室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

2、反转录反应

总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA公司)将1000ng纯化的RNA逆转录合成cDNA。

1)去除基因组DNA反应，按表2中的如下成分于冰上配制反应混合液。

表2去除基因组DNA反应体系

2)PCR仪上进行反应

42℃2min；

4℃保存。

3)反转录反应

反应液配制在冰上进行，成分如表3所示。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μL到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

表3反转录反应体系

试剂	使用量
		前一步反应液	10μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μL
		RT Primer Mix	1.0μL
5*PrimeScript Buffer 2(for Real Time)	4.0μL
		RNase Free dH<sub>2</sub>O	4.0μL
总	20μL

4)PCR仪上进行反应:

37℃ 15min；

85℃ 5sec；

4℃保存。

3、实时定量逆转录-聚合酶链反应(QPCR)

1)采用SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA公司)，配置10μL PCR反应体系(比例如表4所示)，将除cDNA以外的其他试剂预混，每个样品单个基因制作重复三次复孔，依次加入96孔板中，以ddH₂O作为阴性对照。

表4 QPCR反应体系

试剂	使用量
		SYBR Premix Ex Taq	5.0μL
正向引物(10μM)	0.4μL
		反向引物(10μM)	0.4μL
ROX Dye II 0.2	0.2μL
		无RNase水	3.0μL
cDNA	1.0μL
		总	10μL

引物序列如下：

UTY

正向引物：5’-AACCTCAAGATGCCATTA-3’(SEQ ID NO.1)，

反向引物：5’-CCACCATTCCAGTTATCA-3’(SEQ ID NO.2)；

GAPDH

正向引物：5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’(SEQ ID NO.3)，

反向引物：5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’(SEQ ID NO.4)。

2)程序设置：

预变性Cycle:1

95℃35秒；

95℃5秒+60℃34秒，共38个循环。

3)获得每个样本的Ct值，所有目标基因的相对表达量按(2-△△Ct)计算，以同组内参基因GAPDH分别作为对照。

4、结果

结果如图1所示，与30例正常对照人群平均水平相比，30例男性骨质疏松症患者中有26例患者血液中UTY基因的mRNA水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备

根据UTY基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测UTY基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症，据此本发明提供了一种基于检测UTY基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系；扩增UTY基因和GAPDH基因的引物对。扩增UTY基因的正向引物序列为5’-AACCTCAAGATGCCATTA-3’，反向引物序列为5’-CCACCATTCCAGTTATCA-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’，反向引物序列为5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mMKCL，2.5mM MgCL₂、200mM(NH₄)₂SO₄。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 德阳市人民医院

<120> 无创诊断男性骨质疏松症的产品

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacctcaaga tgccatta 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaccattcc agttatca 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggacctga cctgccgtct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaggagtgg gtgtcgctgt 20

Claims

1.检测UTY基因表达的产品在制备诊断男性骨质疏松症的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测UTY基因表达水平以诊断男性骨质疏松症的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过反转录PCR诊断男性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增UTY基因的引物；通过实时定量PCR诊断男性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增UTY基因的引物；通过免疫检测诊断男性骨质疏松症的产品包括：与UTY蛋白特异性结合的抗体；通过原位杂交诊断男性骨质疏松症的产品包括：与UTY基因的核酸序列杂交的探针；通过芯片诊断男性骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与UTY蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与UTY基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过实时定量PCR诊断男性骨质疏松症的产品至少包括的一对特异扩增UTY基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5.一种用于诊断男性骨质疏松症的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中UTY基因的表达来诊断男性骨质疏松症。

6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测UTY基因转录水平的针对UTY基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的UTY蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测UTY基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括UTY蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测UTY基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测UTY基因转录水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测UTY基因转录水平的试剂包括针对UTY基因的引物和/或探针。

9.根据权利要求8所述的工具，其特特征在于，所述针对UTY基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。