CN107267662B

CN107267662B - 慢性阻塞性肺疾病的诊断工具

Info

Publication number: CN107267662B
Application number: CN201710722207.3A
Authority: CN
Inventors: 张倩; 毛正道; 施宇佳
Original assignee: Changzhou Second Peoples Hospital
Current assignee: Changzhou Second Peoples Hospital
Priority date: 2017-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2037-08-22
Also published as: CN107267662A

Abstract

本发明公开了一种慢性阻塞性肺疾病的诊断工具，该诊断工具是通过检测血液中该MTRNR2L1基因及其表达产物来实现诊断目的的。本发明研究证明与正常人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液中MTRNR2L1基因的mRNA表达水平显著下降。根据MTRNR2L1基因与慢性阻塞性肺疾病之间的存在的相关性，可以制备诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒，该试剂盒可在临床上广泛应用。

Description

慢性阻塞性肺疾病的诊断工具

技术领域

本发明属于诊断领域，涉及一种慢性阻塞性肺疾病的诊断工具，还涉及血液中MTRNR2L1基因在制备慢性阻塞性肺疾病诊断工具中的应用。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种重要的慢性呼吸系统疾病，患病人数多，病死率高。由于COPD呈缓慢进行性发展，严重影响患者的劳动能力和生活质量。目前COPD在全球已成为第4位致死原因，引起了世界各国的重视。

随着人口老龄化、大气污染的日益严重以及吸烟人数的增加，慢性阻塞性肺疾病的患病率和病死率逐年增高，目前该病居全球死亡病因第4位，COPD的防治已成为一个重要的公共卫生问题。为了促进社会、政府和患者对COPD的关注，提高COPD的诊治水平，降低COPD的患病率和病死率，继欧、美等国制定COPD诊治指南以后，2001年4月美国国立心、肺、血液研究所和WHO共同发表了《慢性阻塞性肺疾病全球防治倡议》(Global Initiative forChronic Obstructive Lung Dis-ease，GOLD)，GOLD的发表对各国COPD的防治工作发挥了很大促进作用。我国也参照GOLD分别于1997年、2002年、2007年制定了中国的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》。COPD的肺功能特征是不完全可逆性气流受限，肺功能测定是诊断COPD的金标准。无论是GOLD，还是我国的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》均将COPD的肺功能诊断标准定义为:“吸入支气管舒张剂后第1秒钟用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)＜0.70”。值得注意的是该诊断标准中的“0.70”是无需区分性别、年龄、身高、体重、种族等变数的固定数值，然而肺功能的测量值恰恰与受试者的上述因素相关。

GOLD以及我国的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》均以FEV1/FVC＜0.70作为COPD的诊断标准，随着这种诊断模式的广泛宣传，近年其被越来越多的国内外呼吸科医生及肺功能检查技术人员所接受。但是，越来越多的证据发现，以FEV1/FVC＜0.70作为COPD的诊断标准可导致大量临床误诊，当前这一诊断标准正受到前所未有的挑战。因此开发一种可用于准确诊断COPD的方法是亟待解决的问题。

发明内容

本发明首次发现MTRNR2L1基因在慢性阻塞性肺疾病患者的血液中的含量比正常人低很多，MTRNR2L1基因的差异表达可作为诊断慢性阻塞性肺疾病的一种方法，据此可以开发诊断慢性阻塞性肺疾病的工具。

具体的，本发明提供了检测MTRNR2L1基因表达的产品在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测MTRNR2L1基因的表达水平以诊断慢性阻塞性肺疾病的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增MTRNR2L1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增MTRNR2L1基因的引物；所述用免疫检测诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与MTRNR2L1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与MTRNR2L1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MTRNR2L1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MTRNR2L1基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增MTRNR2L1基因的引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测MTRNR2L1基因表达的产品可以应用于该平台实现对MTRNR2L1基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知MTRNR2L1基因的异常与慢性阻塞性肺疾病相关也属于MTRNR2L1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断慢性阻塞性肺疾病的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MTRNR2L1基因转录水平的针对MTRNR2L1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的MTRNR2L1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括MTRNR2L1基因在内的多个基因(例如，与慢性阻塞性肺疾病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括MTRNR2L1蛋白在内的多个蛋白质(例如与慢性阻塞性肺疾病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与慢性阻塞性肺疾病的标志物同时检测，可大大提高慢性阻塞性肺疾病诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测MTRNR2L1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MTRNR2L1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测MTRNR2L1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对MTRNR2L1基因的引物和/或探针。根据MTRNR2L1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测MTRNR2L1基因表达水平的引物和探针。

所述高通量测序平台包括检测MTRNR2L1基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测MTRNR2L1基因的转录水平。

与MTRNR2L1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述MTRNR2L1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MTRNR2L1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与MTRNR2L1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对MTRNR2L1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

用于诊断慢性阻塞性肺疾病的MTRNR2L1基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等体液，或组织。在本发明的具体实施方案中，用于诊断慢性阻塞性肺疾病的MTRNR2L1基因及其表达产物的来源是血液。在发明的具体实施方案中，血液是取自慢性阻塞性肺疾病患者和正常人的外周血液。

本发明的MTRNR2L1基因(NC_000017.11(22523111..22524665))的具体序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。

本发明的MTRNR2L1基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述MTRNR2L1基因的编码序列是SEQ IDNO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，MTRNR2L1基因表达产物包括MTRNR2L1蛋白以及MTRNR2L1蛋白的部分肽。所述MTRNR2L1蛋白的部分肽含有与慢性阻塞性肺疾病相关的功能域。

“MTRNR2L1蛋白”包括MTRNR2L1蛋白以及MTRNR2L1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括MTRNR2L1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与MTRNR2L1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，MTRNR2L1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述MTRNR2L1蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是MTRNR2L1蛋白的融合蛋白。对于与MTRNR2L1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留MTRNR2L1蛋白的生物学活性即可。

本发明的MTRNR2L1蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留MTRNR2L1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断慢性阻塞性肺疾病”既包括待检测者是否已经患有慢性阻塞性肺疾病、也包括判断待检测者是否存在患有慢性阻塞性肺疾病的风险，还包括预测慢性阻塞性肺疾病患者的预后。

具体的实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中差异表达的基因

1、临床研究对象：

选取慢性阻塞性肺疾病患者5例，其中男性3例，女性2例，年龄范围51-78岁，诊断标准均符合我国2007年修订的《慢性阻塞性肺疾病诊疗规范》。

诊断标准：任何患有呼吸困难、慢性咳嗽或多痰的患者，并且有暴露于危险因素的病史，行肺功能检查显示，在吸入支气管舒张剂后，表明存在气流受限，可以诊断为COPD。

排除标准：①合并其它肺部疾病者，如支气管哮喘、肺间质纤维化、肺癌等；②有其它部位感染者；③伴有严重心脑血管疾病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤、脏器功能衰竭、肝炎者；④患免疫系统疾病或者近期使用过免疫抑制剂者。

正常对照：选取体检的健康人5人，其中男性3人，女性2人，年龄范围51-78。

入选标准：无慢性咳嗽、咳痰、端息等病史；近期无上呼吸道感染、肺部感染史；无全身其他部位感染者；无其他肺部疾病者；近期未使用免疫抑制剂或者无全身免疫系统疾病者；无器官功能衰竭或者严重心脑血管疾病、肿瘤者；无过敏性疾病者。入选对象行肺功能检查均排除并与慢性阻塞性肺疾病组对比，在性别、年龄上差异均无统计学意义具有可比性。

所有研究对象均签署了知情同意书。

2、样本采集

所有研究对象于清晨空腹状态下，抽取外周静脉血10ml，EDTA抗凝。

3、血液样本总RNA提取

使用博凌科为TRIpure LS Reagent血液(血液样本)RNA抽提试剂进行血液总RNA的提取。

基本步骤：

(1)按照3:1的体积比例加入TRIpure LS reagent和血液振荡混匀；

(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；

(3)异丙醇沉淀RNA；

(4)漂洗RNA沉淀；

(5)RNase-free H₂O重新溶解RNA沉淀。

4、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

5、片段化RNA

Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

6、反转合成cDNA

在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。

7、连接adaptor

双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。

8、UNG酶消化cDNA二链

在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。

9、Illumina x-ten上机测序

Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。

10、生物信息学分析

测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：

(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；

(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；

(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。

11、结果

RNA-seq结果显示，以正常人血液中MTRNR2L1基因的mRNA相对表达水平为1，慢性阻塞性肺疾病患者血液中MTRNR2L1基因的mRNA表达水平是0.62±0.21。上述结果表明，与正常人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液中MTRNR2L1基因的mRNA水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2验证慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

按照实施例1的方法选择慢性阻塞性肺疾病患者45例，正常人50例。

2、血液总RNA提取

基本步骤：

(1)按照3:1的体积比例加入TRIpure LS reagent和血液振荡混匀；

(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；

(3)异丙醇沉淀RNA；

(4)漂洗RNA沉淀；

(5)RNase-free H₂O重新溶解RNA沉淀。

3、测量总RNA浓度及纯度

用NanoVue Plus仪器测量样本RNA的浓度及纯度。

4、逆转录合成mRNA cDNA

采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0μl，Total RNA1μg，加Rnase FreeddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RT Buffer 2.0μL，RTEnzyme Mix 1.0μL，FQ-RT Primer Mix 2.0μL，RNase Free ddH2O 5.0μL，混合后加入上述试管中一起混合共20μL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。

5、QPCR

5.1仪器及分析方法

用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2^-△△CT法进行数据的相对定量分析。

5.2操作过程如下：

(1)反应体系：用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。反应体系见表1所示。

表1反应体系

试剂	使用量
		2×SuperReal PreMix Plus	10μl
上游引物(10uM)	0.6μl
		下游引物(10uM)	0.6μl
50×ROX Reference Dye<sup>△</sup>	2μl
		DNA模板	2ul
灭菌蒸馏水	4.8ul

(2)扩增程序为：95℃15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40个循环，95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec)。

引物序列如下：

扩增MTRNR2L1基因的正向引物序列为5’-GTCTGAATGGCTCCACGAGG-3’(SEQ IDNO.3)，反向引物序列为5’-CTGGTAGTTTAGGGCCTGCG-3’(SEQ ID NO.4)；

扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ IDNO.5)，反向引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.6)。

5、结果

结果显示，以正常人血液中MTRNR2L1基因的mRNA相对表达水平为1，慢性阻塞性肺疾病患者血液中MTRNR2L1基因的mRNA表达水平是0.68±0.19。上述结果表明与正常人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液中MTRNR2L1基因的mRNA水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果同RNA-seq实验。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 常州市第二人民医院

<120> 慢性阻塞性肺疾病的诊断工具

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctccac gagggttcag ctgtctctta ctttcaacca gtgaaattga cctgcccgtg 60

aagaggcgga cataa 75

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Cys Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu Ile

1 5 10 15

Asp Leu Pro Val Lys Arg Arg Thr

20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctgaatgg ctccacgagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggtagttt agggcctgcg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims

1.检测血液中MTRNR2L1基因mRNA表达水平的产品在制备诊断慢性阻塞性肺疾病工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片、或高通量测序平台检测MTRNR2L1基因mRNA表达水平以诊断慢性阻塞性肺疾病的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增MTRNR2L1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增MTRNR2L1基因的引物；所述用原位杂交诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与MTRNR2L1基因的核酸序列杂交的探针；所述用基因芯片诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与MTRNR2L1基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括的一对特异扩增MTRNR2L1基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具能够通过检测血液中MTRNR2L1基因mRNA表达水平来诊断慢性阻塞性肺疾病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述工具包括基因芯片、基因检测试剂盒、试纸或高通量测序平台。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MTRNR2L1基因转录水平的针对MTRNR2L1基因的寡核苷酸探针；所述基因检测试剂盒包括用于检测MTRNR2L1基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测MTRNR2L1基因转录水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测MTRNR2L1基因转录水平的试剂包括针对MTRNR2L1基因的引物和/或探针。

9.根据权利要求8所述的应用，其特特征在于，所述针对MTRNR2L1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。