CN107904305B

CN107904305B - Heatr4基因作为诊断骨质疏松症的生物标志物

Info

Publication number: CN107904305B
Application number: CN201711483595.0A
Authority: CN
Inventors: 肖枫; 李曙光; 孙耀兰; 常鹏
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN107904305A

Abstract

本发明公开了HEATR4基因可以作为骨质疏松症早期诊断的分子标志物。本发明首先利用高通量测序检测小样本研究对象差异基因的表达情况，然后使用QPCR在大样本中进行差异表达基因的验证。本发明的研究成果表明可以通过检测血液中HEATR4基因表达情况来判断受试者是否患有骨质疏松症，该检测方法可用于骨质疏松症的早期诊断，具有及时性、准确性的特点。

Description

HEATR4基因作为诊断骨质疏松症的生物标志物

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于骨质疏松症诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-HEATR4基因在制备诊断骨质疏松症的产品中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。

世界卫生组织已将骨质疏松列为仅次于心血管疾病的第二大危害人类健康的疾病。据中国健康促进基金会最新发布的《2013中国骨质疏松骨折防治蓝皮书》显示，骨质疏松骨折是一种脆性骨折，即在受到轻微创伤或日常活动中遭受低能量外伤即可发生的骨折。骨质疏松骨折的常见部位是脊椎、髋骨和前臂远端。我国50岁以上人群约6944万人患有骨质疏松症，约2.1亿人骨量偏低。北京等地区流行病学调查显示，50岁以上女性脊椎骨折的患病率为15％，相当于每7个50岁以上的女性中就有一个发生过脊椎骨折。

骨质疏松症的检测包括实验室检查指标的检测和辅助检测。

实验室检查指标：

骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换(包括骨形成和骨吸收)状态，在骨的高转换状态(例如Ⅰ型骨质疏松症)下，这些指标可以升高，也可用于监测治疗的早期反应。但其在骨质疏松症中的临床意义仍有待于进一步研究。这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶(Bone-specific alkaline phosphatase，反应骨形成)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrated resistant acid phosphatse，反应骨吸收)、骨钙素(Osteocalcin，反应骨形成)、Ⅰ型原胶原肽(Type I procollagenpeptidase，反应骨形成)、尿吡啶啉(Urinary pyridinoline)和脱氧吡啶啉(Urinary deoxypyridinoline，反应骨吸收)、Ⅰ型胶原的N-C-末端交联肽(cross-linked N-and C-telopeptide of type I collagen，反应骨吸收)。正如前面所提到的，使用生化指标检测骨质疏松症的精确度不够。

辅助检查：包括骨影像学检查和骨密度检测。辅助检查的对象一般都是骨质疏松症的晚期患者，不能用于早期骨质疏松症患者的筛查。

基于现有技术中检测骨质疏松症的手段的局限性，寻找一种有效的能够在早期即可诊断骨质疏松症发生的方法是亟待解决的问题。

近年来，遗传因素已经成为了骨生物学中最活跃的研究领域之一，很多基因已经被确定为调节古骨密度的候选基因。这些候选基因大多数都是影响骨代谢的基因。如维生素D受体(VDR)、脂蛋白受体相关基因5(LRP5)、I型胶原蛋白(COLIA1)、雌激素受体α、转化生长因子TGFβ1、骨形态发生蛋白(BMPs)、Runx2、Osterix(Osx)、Sclerostin、TCIRG1、IGF-1、IL-1(骨质疏松症，张弛，中国骨质疏松杂志，2010年10月，802-813)。此外，已经有相当数量的专利申请涉及骨质疏松症的基因诊断，如申请号为：201610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.X、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的专利。可见利用基因来诊断骨质疏松症成为了今后骨质疏松症早期诊断的发展趋势。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨质疏松症早期诊断的分子标志物。相比传统的骨质疏松症的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测HEATR4基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。

进一步，所述检测HEATR4基因表达的产品包括检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品。

更进一步，所述检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或高通量测序平台检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品。

更进一步，所述反转录PCR检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品至少包括一对特异扩增HEATR4基因的引物；所述实时定量PCR检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品至少包括一对特异扩增HEATR4基因的引物；所述原位杂交检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品包括：与HEATR4基因的核酸序列杂交的探针；所述基因芯片检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品包括：与HEATR4基因的核酸序列杂交的探针。

优选地，所述实时定量PCR检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品至少包括的一对特异扩增HEATR4基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述检测HEATR4基因表达的产品包括检测HEATR4蛋白表达水平的产品。

更进一步，所述检测HEATR4蛋白表达水平的产品包括通过免疫检测、蛋白芯片检测HEATR4蛋白表达水平的产品。

更进一步，所述免疫检测来检测HEATR4蛋白表达水平的产品包括：与HEATR4蛋白特异性结合的抗体；所述蛋白芯片检测HEATR4蛋白表达水平的产品包括：与HEATR4蛋白特异性结合的抗体。

本发明还提供了一种用于诊断骨质疏松症的工具，所述工具能够通过检测样本中HEATR4基因表达来诊断骨质疏松症。

进一步，所述工具能够通过检测样本中HEATR4基因mRNA表达，和/或，HEATR4蛋白表达来诊断骨质疏松症。

优选地，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测HEATR4基因表达的产品可以应用于该平台实现对HEATR4基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知HEATR4基因的异常与骨质疏松症相关也属于HEATR4基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测HEATR4基因转录水平的针对HEATR4基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的HEATR4蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括HEATR4基因在内的多个基因(例如，与骨质疏松症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括HEATR4蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨质疏松症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨质疏松症的标志物同时检测，可大大提高骨质疏松症诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测HEATR4基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括HEATR4蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测HEATR4基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对HEATR4基因的引物和/或探针。根据HEATR4基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测HEATR4基因表达水平的引物和探针。

与HEATR4基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测HEATR4基因转录水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测HEATR4基因的转录水平。

进一步，所述HEATR4蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述HEATR4蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与HEATR4蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对HEATR4基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

用于诊断骨质疏松症的HEATR4基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断骨质疏松症的HEATR4基因及其表达产物的来源是血液。

在本发明的上下文中，“HEATR4基因”包括HEATR4基因以及HEATR4基因的任何功能等同物的多核苷酸。HEATR4基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中HEATR4基因(NC_000020.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，HEATR4基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述HEATR4基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，HEATR4基因表达产物包括HEATR4蛋白以及HEATR4蛋白的部分肽。所述HEATR4蛋白的部分肽含有与骨质疏松症相关的功能域。

“HEATR4蛋白”包括HEATR4蛋白以及HEATR4蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括HEATR4蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与HEATR4的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，HEATR4蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述HEATR4蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是HEATR4蛋白的融合蛋白。对于与HEATR4蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留HEATR4蛋白的生物学活性即可。

本发明的HEATR4蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留HEATR4蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了HEATR4基因表达与骨质疏松症相关，通过检测受试者中HEATR4的表达，可以判断受试者是否患有骨质疏松症、或者判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-HEATR4基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨质疏松症的早期诊断，从而降低骨质疏松症的死亡率。

附图说明

图1显示利用高通量测序检测HEATR4基因在骨质疏松症患者和正常人中的表达差异；

图2显示利用QPCR检测HEATR4基因在骨质疏松症患者和正常人中的表达差异。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

骨质疏松组：随机抽取医院骨科收治的10例原发性骨质疏松症患者，男、女各5例，年龄最小50岁，最大75岁。纳入标准：符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。

正常组：选取年龄50-75岁的健康志愿者10例，男女各5例。

两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。

所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。

2、血液中总RNA的提取

(1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。

(2)加入TRIzol(10⁶-10⁷细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。

(3)加入氯仿(氯仿：TRIzol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。

(4)离心，12,000g 15min，4℃。

(5)小心吸取上清液，转移到新EP管中,加入异丙醇(异丙醇：TRIzol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。

(6)离心，12,000g 10min，4℃。

(7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：TRIzol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。

(8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即RNA略微出现透明时)，加入60μl DEPC水溶解沉淀。

3、高通量转录组测序

(1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

(2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

(3)差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示(如图1所示)，正常人相比，骨质疏松症患者血液中HEATR4基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2QPCR实验验证骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

骨质疏松组：随机抽取医院骨科收治的50例原发性骨质疏松症患者，男、女各25例，年龄最小50岁，最大75岁。纳入标准：符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。

正常组：选取年龄50-75岁的健康志愿者46例，男女各23例。

所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。

2、血液中总RNA的提取

(3)加入氯仿(氯仿：TRIzol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。

(4)离心，12,000g 15min，4℃。

(6)离心，12,000g 10min，4℃。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、QPCR

(1)引物设计

根据Genbank中HEATR4基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：HEATR4基因：正向引物为5’-CACTAACACTCCAGACTT-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物为5’-TTCACAGGCTTTATCACT-3’(SEQ IDNO.4)，GAPDH基因：正向引物为5’-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’(SEQ ID NO.5)；反向引物为5’-GCTGTTGTCATACTTCTC-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1PCR反应体系

(3)PCR反应条件：95℃12min，(95℃15s，60℃50s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2所示，与正常人相比，骨质疏松症患者血液中HEATR4基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果同RNA-seq实验。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> HEATR4基因作为诊断骨质疏松症的生物标志物

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3081

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 1

atgaccagga cccagaaggg aaagaccttt ctcccccatt gcttctatca gtcactgccc 60

ccacgactgg gatggggcat gattttaaac tactcaaaat tgaaaggcaa ggaggagtgt 120

gcctctgtct ccagtgtgcc tatggtcttc ttcagctcac agtaccgtct acaccgcaag 180

agccaatatt tgaaaatggc tgctgcaaac cttaccttct ctcaggaggt ggtgtggcag 240

cgaggcctgc ccagcattcc ttatagccag tacagctttg accacctcta caataccaat 300

gacatcatcc atactcccca gatcaggaag gcccggcctc agaaacctgt tagcttcaag 360

ttcctgggtt cctcaagtcc cttaacagga gacacctccc tggctgtgaa gacagaaagc 420

tctgccaatc ccgaaaagaa gctgaagaaa tcaaagccag ccagcaccgt ccgggaagca 480

ccccgccctc tcatccatca tccctgcatg catccagata tgctgggtcg gccaccttct 540

ctagatgtga acctggagga aagagaagcc tggcttctgc ctcctgagaa ggaggccaga 600

gcgtgggagg ccactgtgct ggaaaagctg aacgagcgca cagcccgatg gatccagagc 660

aagcgtcctc gaaggcctgg ggcatccccc aacaagtggc agagcttcct gcgccagcag 720

tacgactgga gtcacattcg ggatgagctt acctctgcca gtgacctgga gctcctgaaa 780

cagctggagg cagaagagac agcagagttt gaggatcaaa gtgtcatcct gcccccacag 840

gaaaagaaga agccagaact gctgcttccc gtttactaca gattgcccag ttacttccaa 900

caagcagaga cagttgagat catgcctggc aacaagagca ctgaggatat ccatgaaaag 960

acgagcctct cccagcccca aacccagagc tactttcgcc aggtgactcc ccgagctgga 1020

aagtttgcct actccacaga caacaccttt gaacaggaga tttactttga tgaagtccag 1080

atcatccacc agattggtgc aaagagagac cagattgtcc tggaaaacct aaatcggtac 1140

aacaagcagc tatctaaggt cttccctgaa actccagaaa agtggagtgc ccaggcaatt 1200

cctgaagcat cttacagacc tgtgcaagga gccctgcgct ggactgcttt gcccaccccc 1260

gccaaggata tgctgctgca ggtgggtgag aaggatgtgc ctattaagac caggagattg 1320

aagaagcagg caaaatcact gcaggaggat gtgacctggg aactggtggt cctgcggagg 1380

atgctgaagg aatggaagac tgcctgggct ctgatcatag agtggcacca tgagacagta 1440

gagaacctgc ttcagagctt gggagacctg catgatgacg ttcggatcaa agctatcacc 1500

acatgtgcca cagctgcttt ggaacggccc cggattgcca ccagccagag agactcagac 1560

aagaccatcc aggacttgcc ggaggttcta ctgcctgccc tagaggctgc tctttgtgac 1620

aagaatgccc atgtgcggat ggcagcagca atatgccaat atgccataca gtcacataat 1680

ccccttgccc ggaacatcat gcagactgcc cttctgaagg gtaacagtgt ggatagctgg 1740

gctgcagctc agtgcttggc tctggaaggt actgctactt accctgtgat taagaggatc 1800

ctccaccagc tgtttacaaa gaagaatgag gacactgagg aacagtctta tatcctcctg 1860

agctatctga gtgagaagac aaccctgata cacaccatgc ttgctgtgga gctgaacagc 1920

tgtcaatgga agaaccggat tgtggcctgc caggctttct cccggatcag tggaaatgtc 1980

tgcttggata tgaaacataa gttgatccag ctgatgtgga atgactggaa taaggaagtg 2040

aggagagcag ctgcacaggc gcttgggcaa atgagcctcg ggaaagaggt gcacgacata 2100

atcagggtca agctaggtca aggaaattcc caggagcgtg tggaagctct ctacctgata 2160

ggtgagctca agcttatgac cgccaagctt ctcccaagct tcctgcactg cttctctgat 2220

gacttcacag cagttcggcg ggcagcctgt ttggcagctg gtgccctgca gatccgcgac 2280

aagatggtgc ttgaatgcct cctgaacctg atgcagagag atccttactg gaaaatcaag 2340

gcctttgcca ttcgagcttt gggacagatt gggcaagtaa gtcccgagct gacggatctt 2400

ctgctctggg ctatccacta tgaagagtca ccaggtgtac ggctggaagc ttgccgtagc 2460

atcctagccc tgaaacttca aggggaccgg gtcagggaca ccttcctaga cgtgctgctc 2520

ctggagaacc acgatgctgt tctaaaagaa atgtaccaga caatgaagat actcaactta 2580

ggaaatgaag gaaaccaaga aatgcttcag gagatcaaga acaggattaa aacactaagc 2640

caaaaggact tgctgacaca caaaatactc aagctggaga tggtcatggg aaaagtgagg 2700

gaggaagcaa aacgtgttta cttgaaaccc aaaggagaac aaggaccact aacactccag 2760

actttactcc aagaaacttt tcaggatgag atggttcttc ctagaagacc ttccgaggtt 2820

tgtgacactg aagcagtgat aaagcctgtg aagccccgcg caccaaatcc ctggttacaa 2880

agttcagtcc caggcctaac cacacgaagc aaagttcgtt catcacttgt caaagatcta 2940

cgcacctccc ccgagaaaag gattgctgtg ggaccattta gatccgacta cccagctctt 3000

tatctgggta aattctcaga gagaacattt ttttctccca tcatgtcttc tccctctgga 3060

aagaaaggtg ctcatctcta a 3081

<210> 2

<211> 1026

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 2

Met Thr Ala Thr Gly Leu Gly Leu Thr Pro Leu Pro His Cys Pro Thr

1 5 10 15

Gly Ser Leu Pro Pro Ala Leu Gly Thr Gly Met Ile Leu Ala Thr Ser

20 25 30

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Gly Cys Ala Ser Val Ser Ser Val Pro Met

35 40 45

Val Pro Pro Ser Ser Gly Thr Ala Leu His Ala Leu Ser Gly Thr Leu

50 55 60

Leu Met Ala Ala Ala Ala Leu Thr Pro Ser Gly Gly Val Val Thr Gly

65 70 75 80

Ala Gly Leu Pro Ser Ile Pro Thr Ser Gly Thr Ser Pro Ala His Leu

85 90 95

Thr Ala Thr Ala Ala Ile Ile His Thr Pro Gly Ile Ala Leu Ala Ala

100 105 110

Pro Gly Leu Pro Val Ser Pro Leu Pro Leu Gly Ser Ser Ser Pro Leu

115 120 125

Thr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Val Leu Thr Gly Ser Ser Ala Ala Pro

130 135 140

Gly Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ser Thr Val Ala Gly Ala

145 150 155 160

Pro Ala Pro Leu Ile His His Pro Cys Met His Pro Ala Met Leu Gly

165 170 175

Ala Pro Pro Ser Leu Ala Val Ala Leu Gly Gly Ala Gly Ala Thr Leu

180 185 190

Leu Pro Pro Gly Leu Gly Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Val Leu Gly

195 200 205

Leu Leu Ala Gly Ala Thr Ala Ala Thr Ile Gly Ser Leu Ala Pro Ala

210 215 220

Ala Pro Gly Ala Ser Pro Ala Leu Thr Gly Ser Pro Leu Ala Gly Gly

225 230 235 240

Thr Ala Thr Ser His Ile Ala Ala Gly Leu Thr Ser Ala Ser Ala Leu

245 250 255

Gly Leu Leu Leu Gly Leu Gly Ala Gly Gly Thr Ala Gly Pro Gly Ala

260 265 270

Gly Ser Val Ile Leu Pro Pro Gly Gly Leu Leu Leu Pro Gly Leu Leu

275 280 285

Leu Pro Val Thr Thr Ala Leu Pro Ser Thr Pro Gly Gly Ala Gly Thr

290 295 300

Val Gly Ile Met Pro Gly Ala Leu Ser Thr Gly Ala Ile His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Ser Leu Ser Gly Pro Gly Thr Gly Ser Thr Pro Ala Gly Val Thr

325 330 335

Pro Ala Ala Gly Leu Pro Ala Thr Ser Thr Ala Ala Thr Pro Gly Gly

340 345 350

Gly Ile Thr Pro Ala Gly Val Gly Ile Ile His Gly Ile Gly Ala Leu

355 360 365

Ala Ala Gly Ile Val Leu Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Gly Leu

370 375 380

Ser Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Gly Leu Thr Ser Ala Gly Ala Ile

385 390 395 400

Pro Gly Ala Ser Thr Ala Pro Val Gly Gly Ala Leu Ala Thr Thr Ala

405 410 415

Leu Pro Thr Pro Ala Leu Ala Met Leu Leu Gly Val Gly Gly Leu Ala

420 425 430

Val Pro Ile Leu Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Gly Ala Val Thr Thr Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Met Leu Leu Gly

450 455 460

Thr Leu Thr Ala Thr Ala Leu Ile Ile Gly Thr His His Gly Thr Val

465 470 475 480

Gly Ala Leu Leu Gly Ser Leu Gly Ala Leu His Ala Ala Val Ala Ile

485 490 495

Leu Ala Ile Thr Thr Cys Ala Thr Ala Ala Leu Gly Ala Pro Ala Ile

500 505 510

Ala Thr Ser Gly Ala Ala Ser Ala Leu Thr Ile Gly Ala Leu Pro Gly

515 520 525

Val Leu Leu Pro Ala Leu Gly Ala Ala Leu Cys Ala Leu Ala Ala His

530 535 540

Val Ala Met Ala Ala Ala Ile Cys Gly Thr Ala Ile Gly Ser His Ala

545 550 555 560

Pro Leu Ala Ala Ala Ile Met Gly Thr Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ser

565 570 575

Val Ala Ser Thr Ala Ala Ala Gly Cys Leu Ala Leu Gly Gly Thr Ala

580 585 590

Thr Thr Pro Val Ile Leu Ala Ile Leu His Gly Leu Pro Thr Leu Leu

595 600 605

Ala Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ser Thr Ile Leu Leu Ser Thr Leu Ser

610 615 620

Gly Leu Thr Thr Leu Ile His Thr Met Leu Ala Val Gly Leu Ala Ser

625 630 635 640

Cys Gly Thr Leu Ala Ala Ile Val Ala Cys Gly Ala Pro Ser Ala Ile

645 650 655

Ser Gly Ala Val Cys Leu Ala Met Leu His Leu Leu Ile Gly Leu Met

660 665 670

Thr Ala Ala Thr Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Leu

675 680 685

Gly Gly Met Ser Leu Gly Leu Gly Val His Ala Ile Ile Ala Val Leu

690 695 700

Leu Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ala Val Gly Ala Leu Thr Leu Ile

705 710 715 720

Gly Gly Leu Leu Leu Met Thr Ala Leu Leu Leu Pro Ser Pro Leu His

725 730 735

Cys Pro Ser Ala Ala Pro Thr Ala Val Ala Ala Ala Ala Cys Leu Ala

740 745 750

Ala Gly Ala Leu Gly Ile Ala Ala Leu Met Val Leu Gly Cys Leu Leu

755 760 765

Ala Leu Met Gly Ala Ala Pro Thr Thr Leu Ile Leu Ala Pro Ala Ile

770 775 780

Ala Ala Leu Gly Gly Ile Gly Gly Val Ser Pro Gly Leu Thr Ala Leu

785 790 795 800

Leu Leu Thr Ala Ile His Thr Gly Gly Ser Pro Gly Val Ala Leu Gly

805 810 815

Ala Cys Ala Ser Ile Leu Ala Leu Leu Leu Gly Gly Ala Ala Val Ala

820 825 830

Ala Thr Pro Leu Ala Val Leu Leu Leu Gly Ala His Ala Ala Val Leu

835 840 845

Leu Gly Met Thr Gly Thr Met Leu Ile Leu Ala Leu Gly Ala Gly Gly

850 855 860

Ala Gly Gly Met Leu Gly Gly Ile Leu Ala Ala Ile Leu Thr Leu Ser

865 870 875 880

Gly Leu Ala Leu Leu Thr His Leu Ile Leu Leu Leu Gly Met Val Met

885 890 895

Gly Leu Val Ala Gly Gly Ala Leu Ala Val Thr Leu Leu Pro Leu Gly

900 905 910

Gly Gly Gly Pro Leu Thr Leu Gly Thr Leu Leu Gly Gly Thr Pro Gly

915 920 925

Ala Gly Met Val Leu Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Cys Ala Thr Gly

930 935 940

Ala Val Ile Leu Pro Val Leu Pro Ala Ala Pro Ala Pro Thr Leu Gly

945 950 955 960

Ser Ser Val Pro Gly Leu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ala Ser Ser Leu

965 970 975

Val Leu Ala Leu Ala Thr Ser Pro Gly Leu Ala Ile Ala Val Gly Pro

980 985 990

Pro Ala Ser Ala Thr Pro Ala Leu Thr Leu Gly Leu Pro Ser Gly Ala

995 1000 1005

Thr Pro Pro Ser Pro Ile Met Ser Ser Pro Ser Gly Leu Leu Gly Ala

1010 1015 1020

His Leu

1025

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cactaacact ccagactt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcacaggct ttatcact 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaagggtcat catctctg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgttgtca tacttctc 18

Claims

1.检测HEATR4基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测HEATR4基因表达的产品包括检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或高通量测序平台检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述反转录PCR检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品至少包括一对特异扩增HEATR4基因的引物；所述实时定量PCR检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品至少包括一对特异扩增

HEATR4基因的引物；所述原位杂交检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品包括：与HEATR4基因的核酸序列杂交的探针；所述基因芯片检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品包括：与HEATR4基因的核酸序列杂交的探针。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述实时定量PCR检测HEATR4基因mRNA表达水平的产品至少包括的一对特异扩增HEATR4基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测HEATR4基因表达的产品包括检测HEATR4蛋白表达水平的产品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测HEATR4蛋白表达水平的产品包括通过免疫检测、蛋白芯片检测HEATR4蛋白表达水平的产品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫检测来检测HEATR4蛋白表达水平的产品包括：与HEATR4蛋白特异性结合的抗体；所述蛋白芯片检测HEATR4蛋白表达水平的产品包括：与HEATR4蛋白特异性结合的抗体。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中HEATR4基因表达来诊断骨质疏松症。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中HEATR4基因mRNA表达来诊断骨质疏松症。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中HEATR4蛋白表达来诊断骨质疏松症。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的应用，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测HEATR4基因转录水平的针对HEATR4基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的HEATR4蛋白的特异性抗体。

14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测HEATR4基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括HEATR4蛋白的特异性抗体。

15.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测HEATR4基因转录水平。

16.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述高通量测序平台包括用于检测HEATR4基因转录水平的试剂。

17.根据权利要求14或16所述的应用，其特征在于，所述检测HEATR4基因转录水平的试剂包括针对HEATR4基因的引物和/或探针。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述针对HEATR4基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

19.根据权利要求9-11中任一项所述的应用，其特征在于，所述样本是血液。

20.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述样本是血液。

21.根据权利要求13-16中任一项所述的应用，其特征在于，所述样本是血液。

22.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述样本是血液。

23.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述样本是血液。