CN105950714B - 一种诊断骨关节炎的产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品能够通过检测生物学样品中CRNN基因，或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物的表达水平来诊断骨关节炎。本发明进一步公开了所述产品在骨关节炎诊断中的应用。本发明公开了一种与骨关节炎相关的基因CRNN，并进一步证实该CRNN基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨关节炎组织中表达下调。利用该基因检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

一种诊断骨关节炎的产品及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种诊断骨关节炎的产品及其应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病，所述关节软骨覆盖在骨末端，形成关节的关节面。据报道有许多因素使患者易患骨关节炎，包括遗传易感性、肥胖症、意外或运动创伤、手术、药物和重体力需求。骨关节炎被认为是从关节软骨的损伤开始的。最普遍的两种对关节的损伤是运动相关损伤和长期“反复使用”关节损伤。最经常受骨关节炎影响的关节是膝、髋和手。在多数情况下，由于膝和髋必要的承重功能，这些关节中的骨关节炎比手骨关节炎更易导致残疾。随着软骨退化的发展，关节中和关节周围的其他组织(包括骨、肌肉、韧带、半月板和滑膜)中发生次级变化。软骨组织初级衰竭和其他组织次级损伤的净效应是患者发生疼痛、肿胀、虚弱和患病关节丧失机能。这些症状经常发展到具有严重影响的程度，如使患者丧失劳动力或影响生活质量。
关节软骨主要由软骨细胞、II型胶原、蛋白聚糖和水组成。关节软骨没有血或神经分布，软骨细胞是该组织中仅有的细胞类型。软骨细胞负责制造软骨基质的II型胶原和蛋白聚糖。其后该基质又具有允许用水使基质饱和的物理化学特性。这种结构-功能关系的净效应是关节软骨具有特殊的耐磨特征，并且关节软骨面之间发生几乎无摩擦的移动。在未患骨关节炎时，关节软骨经常在甚至高需求的身体条件下提供终生的无痛承重和无限制的关节移动。
与所有的活组织一样，关节软骨持续地经历更新过程，其中去除(分解代谢活性)“老”细胞和基质组分并产生(合成代谢活性)“新”细胞和分子。相对于多数组织，关节软骨的合成代谢或分解代谢周转率较低。成熟软骨结构完整性的长期维持依赖于基质合成和降解之间适当的平衡。软骨细胞通过应答于来自其环境中的化学和机械刺激维持基质平衡。软骨细胞对这些刺激合适并有效的应答是软骨动态平衡所必需的。通过合成代谢活性不足或分解代谢活性过剩破坏动态平衡可引起软骨降解和骨关节炎(Adams等，1995，Nature377Suppl：3-174)。多数受到损伤和分解代谢活性提高的组织能够启动增强的合成代谢应答，允许组织复原。不幸的是，关节软骨应答于软骨基质损伤或消耗而上调其合成代谢活性以及提高合成蛋白聚糖和II型胶原的能力非常有限。
现有的骨关节炎治疗方法包括运动、药物、休息和关节保健、手术、疼痛缓解技术、替代治疗和体重控制。治疗骨关节炎中常用的药物包括非甾族抗炎药如阿司匹林、布洛芬等；直接用于皮肤的局部疼痛缓解乳膏、橡胶和喷雾剂等。可进行手术以使骨表面重建、骨复位和置换关节。尽管各种药物疗法已被用于治疗疾病，但是它们对长期控制和预防是无效的。此外，由于骨关节炎隐匿式发生并且发展缓慢，因此骨关节炎经常在疾病发展的晚期才得到鉴定，而不是潜在治疗可能更有效的疾病发展早期。因此预防、改变或治疗骨关节炎疾病过程中的进一步发展严重依赖于鉴定疾病的早期诊断标志物，从而允许早期干涉。
发明内容
为了实现骨关节炎的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种新的骨关节炎相关基因，以及该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。
本发明的还一目的是提供该骨关节炎相关基因及其表达产物在检测骨关节炎中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品能够通过检测生物学样品中CRNN基因，或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物的表达水平来诊断骨关节炎。
更进一步地研究发现，所述CRNN基因，或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨性关节炎组织中表达下调。
进一步地，所述诊断骨关节炎的产品包括芯片或试剂盒。
优选的，所述芯片选自下组：
(1)基因芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样DNA,所述点样DNA包括特异性结合于骨关节炎相关基因转录本的探针，所述骨关节炎相关基因是CRNN基因；
(2)蛋白质芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样蛋白，所述点样蛋白包括特异性结合于骨关节炎相关基因表达产物的抗体，所述骨关节炎相关基因是CRNN基因。
优选的，所述试剂盒包括特异性扩增骨关节炎相关基因和管家基因的引物对，所述骨关节炎相关基因是CRNN基因。
优选的，所述特异扩增CRNN基因的引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
更优选的，所述试剂盒还包括具有逆转录酶活性的酶，如III；所述试剂盒还包括具有热稳定DNA聚合酶活性的酶，如Tap酶。
进一步地，本发明公开了所述诊断骨关节炎的产品在骨关节炎诊断中的应用。
具体地，应用步骤如下：
(1)检测待测样品中骨关节炎相关基因的表达水平，其中所述骨关节炎相关基因是CRNN基因；
(2)将待测细胞中骨关节炎相关基因的表达水平与对照相比较，CRNN基因表达下调，表明研究对象为骨关节炎患者。
优选地，步骤(2)中判断下调的标准是骨关节炎相关基因的表达水平比正常人群中骨关节炎相关基因的表达水平至少10％以上的降低。
优选地，步骤(2)中判断上调的标准是骨关节炎相关基因的表达水平比正常人群中骨关节炎相关基因的表达水平低60％。
优选地，步骤(2)中判断上调的标准是骨关节炎相关基因的表达水平比正常人群中骨关节炎相关基因的表达水平低90％。
进一步地，本发明提供了一种治疗骨性关节炎的制剂，所述制剂中含有促进CRNN基因表达的试剂和促进CRNN基因表达产物的试剂；所述促进CRNN基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂，促进基因翻译的试剂，促进CRNN蛋白含量提高的试剂；所述促进CRNN基因表达产物的试剂包括促进CRNN基因表达稳定性的试剂，促进CRNN基因表达产物活性的试剂，促进CRNN基因表达产物功能的试剂。
本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：激活分子标志物的启动子、激活分子标志物表达的蛋白或因子、导入促进分子标志物转录或表达的载体。
优选的，所述治疗骨性关节炎的制剂中含有促进CRNN基因的转录或表达的载体和/或激活CRNN基因的启动子和/或激活CRNN基因表达的蛋白或因子。
本发明提供的治疗骨性关节炎的制剂一方面用于补充内源性CRNN蛋白的缺失或不足，通过提高CRNN蛋白的表达，从而治疗CRNN蛋白缺失导致的骨关节炎。另一方面可以用于促进CRNN蛋白的活性或功能，从而治疗骨关节炎。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一种与骨关节炎相关的基因CRNN，并进一步证实该CRNN基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨关节炎组织中表达上调。利用该基因检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1本发明中实施例4中骨关节炎患者中CRNN基因表达下调。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明的发明人对10例骨性关节炎样本及4例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因CRNN，现有研究中并没有CRNN和骨性关节炎相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了CRNN在骨性关节炎组织中表达下调，其相关制剂可用于治疗骨性关节炎。
本发明的CRNN基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：
Genbank登录号：NCBI GeneID:49860，来源于人类基因组。
本发明还采用RT-PCR方法和基因芯片方法检测上述基因在骨关节炎患者和正常人群中的表达，并验证了该基因为骨关节炎表达下调基因。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
基因芯片(genechip)(又称DNA芯片、生物芯片)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致，相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。
基因芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。1、芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在芯片上。2、样品制备，生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。3、生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率。4、芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息。
本发明的CRNN基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次扩增，然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人,(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本文使用的术语“骨关节炎”指关节炎的特定形式，特别是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病，所述关节软骨覆盖在形成关节面的骨末端上。
本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过骨关节炎分期确定与骨关节炎不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患骨关节炎或通过骨关节炎分期确定的骨关节炎已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。
本文使用的术语“蛋白质类物质”(如蛋白质、多肽、肽和抗体)的上下文中使用的术语“类似物”指这样的蛋白质类物质：其与第二种蛋白质类物质具有相似或相同的功能，但不一定包含与所述第二种蛋白质类物质相似或相同的氨基酸序列或具有与第二种蛋白质类物质相似或相同的结构。具有相似的氨基酸序列的蛋白质类物质指满足以下至少一项的第二种蛋白质类物质：
(a)具有与第二种蛋白质类物质的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的氨基酸序列的蛋白质类物质；
(b)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质，所述核苷酸序列在严谨条件下与编码第二种蛋白质类物质的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氢基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交；
和(c)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质，所述核苷酸序列与编码第二种蛋白质类物质的核苷酸序列有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性。与第二种蛋白质类物质结构相似的蛋白质类物质指具有与第二种蛋白质类物质相似的二级、三级或四级结构的蛋白质类物质。
本文使用的术语“蛋白质”、“多肽”和“蛋白质类物质”可互换使用，指通过肽键连接在一起的氨基酸链，任选地可包含天然或非天然氨基酸。任选地，蛋白质或多肽可包含除氨基酸以外的其他分子。所述链可以为任何长度，如所述蛋白质由通过肽键连接在一起的少于200个、少于175个、少于150个、少于125个、少于100个、少于50个、少于45个、少于40个、少于35个、少于30个、少于25个、少于20个、少于15个、少于10个或少于5个氨基酸组成。在另一实施方案中，蛋白质由通过肽键连接在一起的至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多氨基酸组成。
本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。涉及本发明生物标志物对应的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接变体时，表达水平可以通过杂交或更多定量测量来测定，例如包括使用SYBR绿、TaqMan和分子信标技术的定量实时RT PCR。
本文使用的“对照”指未显示任何OA症状(包括关节痛)并且未诊断为关节损伤或OA的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响OA的药物，并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明，“对照”还指分离自正常个体的样品，包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。取自对照个体的样品可包括分离自样本组织的RNA，其中RNA分离自样本组织，所述样本组织分离自组织移除时未诊断为OA并且未显示任何OA症状的个体。在本发明的一个实施方案中，为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
本文使用的术语“引物”指存在于纯化的限制性消化物中或合成产生的寡核苷酸，置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即存在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)以及适当的温度和pH时，所述寡核苷酸能作为合成的起始点。引物可以为单链或双链，并且必须具有足够的长度，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度会取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，就诊断应用而言，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含有15-25或更多的核苷酸，尽管也可以含有更少的核苷酸。引物合适长度的确定中涉及的因素为本领域普通技术人员所公知。一般而言，根据本领域熟知的标准方法设计和选择本发明的引物，参阅Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR Primer Design.《PCR Primer，ALaboratory Manual》(Dieffenbach，CW和Dveksler，G.S.编辑)Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，133-155。
本文使用的“核酸”，通常指任何多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA或其任何组合。“核酸”包括但不限于单链和双链核酸。本文使用的术语“核酸”还包括如上文所述含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，为了稳定性或其他原因修饰了骨架的DNA或RNA为“核酸”。本文使用的术语“核酸”包括核酸的这些化学、酶或代谢修饰的形式以及病毒和细胞(包括如简单细胞和复杂细胞)DNA和RNA特征的化学形式。“核酸”或“核酸序列”还可包括单链或双链RNA或DNA的区域或其任何组合，并可包括本发明一些实施方案的表达序列标签(EST)。EST是通过逆转录mRNA区以产生cDNA而产生的基因的一部分表达序列(即序列的“标签”)。
本文使用的“核酸探针”包括能通过一组非共价结合相互作用(包括互补碱基配对相互作用)与阵列上核酸成员的互补序列结合的核酸。本文使用的核酸探针可包含天然(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外，核酸探针中的碱基可以通过磷酸二酯键以外的键结合，只要它不干扰杂交(即该核酸探针仍在标准严谨或选择性杂交条件下与其互补序列特异性结合)。因此，核酸探针可以为肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键结合。
本文使用的术语“生物学样品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、软骨、滑膜组织等样品。
本发明的生物学样品
用于本发明的生物学样品得自任何受试者的任何组织样品(如软骨、滑膜、滑液或血样)或细胞样品(如软骨细胞或血细胞样品)均可以根据本发明方法使用。可以从中获得这些样品并根据本发明方法使用这些样品的受试者实例包括但不限于无症状受试者、表现或更多骨关节炎症状的受试者、临床诊断为患有骨关节炎的受试者、易患骨关节炎的受试者(如有骨关节炎家族史的受试者、有骨关节炎遗传易感性的受试者以及生活方式使其易感骨关节炎或提高患骨关节炎可能性的受试者)、怀疑患有骨关节炎的受试者、正接受骨关节炎治疗的受试者、患有骨关节炎和非接受骨关节炎治疗的受试者、开业医生(如医师)确定为健康或无骨关节炎的受试者(即正常)、已治愈骨关节炎的受试者、正在控制其骨关节炎的受试者和未诊断为骨关节炎的受试者。在一个具体的实施方案中，可获得样品并使用的受试者患手、足、脊柱、膝、髋和/或腕骨关节炎。
软骨、滑膜
在一个方面中，根据本领域已知并描述于下文的方法从生存的正常个体或死后14小时以内的软骨组织获得软骨样品或滑膜样品。使用任何已知方法获得来自成人的正常关节软骨，如软骨或滑膜得自接受关节镜手术或全膝置换术的个体，样品在液氮中保存待用。由于伦理考虑，通常不能从活供体中广泛采样真实的正常软骨或滑膜。因此，优选地，在14小时的死后窗口中在停止对采样关节灌注后从死亡供体获得正常软骨或滑膜样品，以使观察到的RNA降解最小。在另一方面中，软骨或滑膜得自诊断为骨关节炎的受试者。使用任何已知技术获得来自骨关节炎个体的人关节样品。优选地，将关节样品保存在液氮中待用。在一个具体实施方案中，分离至少0.05g软骨或滑膜样品，以获得2μg总RNA提取物。可根据本发明使用的软骨或滑膜样品为足以检测一种或多种本发明核酸序列或氨基酸序列的量。
滑液
在一个方面中，使用本领域熟知的方法从受试者获得滑液样品。例如，可以进行关节穿刺。在关节穿刺中，使用无菌针从关节中移出滑液。可以使用关节穿刺从膝、肘、腕、指、髋、脊柱或任何其他关节收集滑液。在一个具体的实施方案中，滑液收集自患骨关节炎或怀疑患骨关节炎的关节。滑液可得自患OA、未患OA的受试者或得自测试受试者。
可根据本发明使用的滑液样品为足以检测一种或多种本发明核酸序列或氨基酸序列的量。在一个具体实施方案中，可根据本发明使用的滑液样品的量范围从0.1mL至20mL、0.1mL至15mi、0.1mL至10mL、0.1mL至5mL、0.1至2mL、0.5mL至20mL、0.5mL至15mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL或0.5mL至2mL。
在本发明的一些实施方案中，使用本领域已知的方法分离滑液中存在的细胞，并根据本发明方法使用。通常在滑液中可见以下细胞：淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、单核细胞、嗜中性粒细胞、滑膜细胞和巨噬细胞。在来自病理状态(如骨关节炎)的患者的滑液中还可见以下细胞：软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。可以根据本发明的方法分离并使用这些细胞。在一个具体实施方案中，从滑液样品中分离淋巴细胞(B和T淋巴细胞)并根据本发明方法使用。在另一实施方案中，从滑液样品中分离单核细胞或嗜中性粒细胞并根据本发明方法使用。在用于本发明方法前，可以通过标准技术冷冻分离自滑液的细胞。
血
在本发明的一个方面中，根据本领域熟知的方法从受试者中获得血样。可以使用本领域技术人员已知的技术(特别是已知的采血方法)从受试者的任何身体部位(如指、手、腕、臂、腿、足、踝、胃和颈)取血。在一个具体的实施方案中，从受试者获得静脉血并根据本发明方法使用。可以使用真空管、注射器或蝶形针取血。
采血量将取决于采血部位、本发明方法需要的量和受试者的舒适度而变化。如在多个具体的实施方案中，从受试者收集0.001mL、0.005mL、0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL或更多血。将血保存在K3/EDTA管中。
在一个方面中，根据本领域熟知的采血方法从正常个体或者从诊断为患骨关节炎或怀疑患骨关节炎的个体取全血。全血包括可直接使用的血，并包括已经根据本领域熟知的方法(例如优选在300-800×g温和离心5-10分钟)除去血清或血浆并且已经从剩余血样中分离了RNA或mRNA的血。在一个具体的实施方案中，将得自受试者的全血(即未分级血)与裂解缓冲液(如裂解缓冲液(1L)：0.6g EDTA；1.0g KHCO2，8.2gNH4Cl，用NaOH调整至到pH7.4)混合，离心样品并保留细胞沉淀，根据本领域熟知的方法提取RNA或mRNA(“裂解血”)(参阅如Sambrook等)。优选使用全血，因为它避免了昂贵耗时的分离血中细胞类型的步骤(Kimoto，1998，Mol.Gen.Genet258：233-239；Chelly J等，1989，Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：2617-2621；Chelly J等，1988，Nature333：858-860)。
在本发明的一些实施方案中，将收集自受试者的全血进行分级(即分离成组分)。在本发明的一个具体实施方案中，使用本领域已知技术从收集自受试者的全血分离血细胞。例如，可以对收集自受试者的血进行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度离心。这种离心将红细胞(血红细胞)与各种类型的有核细胞和血浆分离开。具体地，Ficoll-Hypaque梯度离心可用于分离外周血白细胞(PBL)，它们可根据本发明方法使用。其他全血分离方法按照本领域技术人员所熟知的方法进行操作。
在根据本发明方法使用前，任选地(但优选)将收集的生物学样品保存在低温如4℃下。在一些实施方案中，在第一时间根据本发明方法使用样品的一部分，而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言，可以使用本领域熟知的保存方法，例如在冷冻温度(如低于-80℃)保存。在一些实施方案中，作为保存样品的补充或替代，将分离的核酸或蛋白质保存一段时间(如1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定)以备后用。
实施例1高通量测序筛选差异表达基因
1、取样
取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊骨性关节炎患者，病例组共收集10例，对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集4例。获取所有研究对象的滑液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。
病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。根据1995年美国风湿协会骨性关节炎的诊断标准，诊断为重度骨性关节炎，有膝关节置换指征的患者病例。
其中，临床诊断标准依据1995年美国风湿病协会所制定的标准：
(1)1个月内大多数时间有膝痛；
(2)关节活动时响声；
(3)晨僵不大于30分钟；
(4)年龄不小于40岁；
(5)膝关节骨性肿胀伴弹响；
(6)膝关节骨性肿胀不伴有弹响。
最少存在((1)、(2)、(3)、(4)或(1)、(2)、(3)、(5)或(1)、(6)即可诊断OA。
2、对滑液进行总RNA提取
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把滑液放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按I mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、高通量测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因CRNN，该基因在骨性关节炎样本组织中表达下调。
实施例2RT-PCR验证骨性关节炎患者及对照滑液CRNN基因表达情况
1、材料
选取42例骨性关节炎患者软骨组织及8例对照软骨组织，对其进行分组及编号。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
2、方法
2.1对滑液进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。
2.2逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:Gene ID:69860(CRNN)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表1所示：
表1引物序列
操作过程如下：
(一)反应体系：用Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，61℃45sec，72℃35sec)×40个循环。
表2RealTime反应体系
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品RealTime-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较CRNN基因在骨性关节炎组织和对照组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CRNN基因在骨性关节炎组织中的表达水平仅为对照组织的25％，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析CRNN基因在骨性关节炎患者中表达下调的结果。
实施例3基因芯片验证骨性关节炎患者及对照滑液CRNN基因表达情况
1、材料的取得，同实施例2。
2、总RNA的提取，同实施例1的方法。
3、基因芯片验证
总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著意义。结果显示，与正常人相比，骨关节炎患者滑液中CRNN基因的mRNA水平仅为21％，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4试剂盒的制备
基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于检测骨关节炎的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增CRNN基因的引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mMKCL，2.5mM MgCL2，200mM(NH4)2SO4。
通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：
表3PCR反应体系
组分 加入量
SYBRGreen聚合酶链式反应体系 12.5μL
上游引物(10μM) 0.5μL(CRNN)+0.5μL(GAPDH)
下游引物(10μM) 0.5μL(CRNN)+0.5μL(GAPDH)
模板cDNA 2.0μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
最佳反应条件为：
95°预变性5min，(95℃变性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。
实施例5试剂盒对骨关节炎的性能验证
1、病例
取60例待检骨关节炎病人和10例正常人的滑液组织，待检骨关节炎病人为北京协和医院骨科就诊骨性关节炎患者，10例正常人来自于该医院骨科，为外伤手术病人关节滑液组织。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。
2、方法
使用常规方法或使用特定的试剂盒提取RNA，反转录成cDNA，用实施例4中的试剂盒进行检测反应。
3、结果
通过溶解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCt法进行相对定量，结果如图1所示，与正常组织相比，CRNN基因在骨关节炎患者中表达仅是正常人群的20％，证明该基因表达下调。所以，用该基因检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.检测CRNN基因或该基因编码的蛋白的表达水平的探针、抗体或引物对在制备诊断骨关节炎的产品中的应用，其特征在于，所述的CRNN基因或该基因编码的蛋白为所述产品的检测靶标，所述的CRNN基因或该基因编码的蛋白在骨关节炎组织中表达下调，所述的CRNN基因为人类CRNN基因。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述芯片选自下组：
(1)基因芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样DNA，所述点样DNA包括特异性结合于CRNN基因转录本的探针；
(2)蛋白质芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样蛋白，所述点样蛋白包括特异性结合于CRNN基因表达产物的抗体。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性扩增CRNN基因和管家基因的引物对。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异扩增CRNN基因的引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括具有逆转录酶活性的酶。
7.如权利要求4至6任意一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括具有热稳定DNA聚合酶活性的酶。
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