CN110241208A

CN110241208A - Trem2作为早期诊断冠心病的分子标志物的应用

Info

Publication number: CN110241208A
Application number: CN201910711238.8A
Authority: CN
Inventors: 陈文娜; 朱敬轩; 朱思绮; 张淼; 刘馨儿; 张越时; 张琪; 金宏飞
Original assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2019-09-17

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体公开了用于早期诊断冠心病的分子标志物‑TREM2基因。本发明实验证明冠心病患者外周血单个核细胞中TREM2基因的mRNA表达水平与健康人群相比显著升高，因此TREM2基因可以成为诊断冠心病的标志物，通过检测受试者外周血单个核细胞中TREM2基因的mRNA表达水平即可判断受试者是否患有冠心病。本发明提供了一种可用于冠心病早期诊断的分子标志物TREM2及检测TREM2基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的用途，该诊断产品可以快速、无创、高灵敏性、高特异性的诊断冠心病，适于临床冠心病的早期诊断。

Description

TREM2作为早期诊断冠心病的分子标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种用于冠心病诊断的分子标志物-----TREM2在制备早期诊断冠心病的产品中的应用。

背景技术

冠心病(coronary heart disease，CHD)又称为冠状动脉粥样硬化性心脏病，是因冠状动脉发生粥样硬化病变导致血管腔狭窄或阻塞，引起斑块形成甚至破裂、完全堵塞血管，导致心肌血液供应不足，造成心肌缺血、缺氧或坏死，在临床上引起心绞痛、心肌梗死等一系列严重的心肌缺血性疾病。冠心病是现今威胁人类健康最严重的疾病之一。随着经济的快速发展，人类的疾病谱随之发生了明显的变化，心血管疾病逐渐成为了危害人类健康的主要疾病。因其发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多，严重威胁人类的生命和健康。目前，在我国居民的死亡谱中，心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，严重地危害人类身体健康和生存质量。脂质代谢异常是冠心病最重要的危险因素。冠心病患者由于血脂含量偏高，血液中的炎性细胞如单核巨噬细胞受趋化因子的作用聚焦到受损的血管壁，吞噬脂质成份，形成泡沫细胞。当单核巨噬细胞受环境因素影响免疫功能减弱，不能及时有效清除血管内的脂质成份时，就会造成脂质积聚和动脉硬化加速发展，最终导致中风、心肌梗死等严重后果。

冠心病的发生过程十分复杂，是环境因素和遗传因素共同作用的结果。众所周知，血脂异常、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病和糖耐量异常、肥胖、过多动物脂肪摄入等均是冠心病的发病的影响因素。目前，冠心病的诊断主要依赖典型的临床症状，再结合影像学辅助检查发现心肌缺血或冠脉阻塞的证据，以及心肌损伤标志物判定是否有心肌坏死。实验室检查多以血脂水平和心肌酶谱表达做为辅助诊断冠心病的主要指标，目前尚无特异性强、敏感性高、可用于早期诊断的指标。家族遗传因素是冠心病的一个重要独立危险因素，因此基因检测可用于冠心病的防治，并预测冠心病的发展和疗效，对于疾病诊断和治疗均具有十分重要的意义和应用前景。

TREM2基因可编码II型髓样细胞激发受体蛋白，是高表达于小胶质细胞上的一类免疫球蛋白样受体，其最初被发现是与常染色体隐性遗传的早发性痴呆相关。接下来人们发现TREM2能够通过DAP-12传递抑制性免疫信号下调树突状细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞的吞噬功能及炎性因子释放，进而抑制炎症反应，在自身免疫及炎症过程中发挥“负性调节”的有益作用。后来学者们发现TREM2是调控小胶质细胞活化状态的重要信号蛋白，认为TREM2变异型参与了阿尔茨海默病的病理过程。调控TREM2的表达能够改善缺血损伤后的神经功能，通过减轻神经炎症产生脑保护作用，有助于缺血性脑中风的治疗。但是，TREM2基因或蛋白的表达在冠心病发病中的确切机制尚未见报道。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于冠心病早期诊断的分子标志物，相比传统的冠心病的诊断方法，使用基因标志物来诊断冠心病具有早期、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取有效的预防措施，有利于临床医生采取相应的治疗手段。

本发明提供了检测TREM2基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测TREM2基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、基因芯片、蛋白芯片或高通量测序平台检测TREM2基因表达水平以诊断冠心病的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增TREM2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增TREM2基因的引物；所述用免疫检测诊断冠心病的产品包括与TREM2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断冠心病的产品包括与TREM2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断冠心病的产品包括蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与TREM2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与TREM2基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增TREM2基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种诊断冠心病的工具，所述诊断工具包括芯片、检测试剂盒、试纸或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TREM2基因转录水平的针对TREM2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TREM2蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括TREM2基因在内的与冠心病相关的多个基因的表达水平；所述蛋白质芯片可用于检测包括TREM2蛋白在内的多个与冠心病相关的蛋白质的表达水平。通过将多个与冠心病的标志物同时检测，可大大提高冠心病诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测TREM2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TREM2蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测TREM2基因表达水平过程中所需的试剂。所述试剂包括针对TREM2基因的引物和/或探针。根据TREM2基因的核苷酸序列信息设计出可以用于检测TREM2基因表达水平的引物和探针。与TREM2基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。所述高通量测序平台包括检测TREM2基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测TREM2基因的转录水平。

进一步，所述TREM2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TREM2蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等。只要所述片段能够保留与TREM2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时，本领域技术人员可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对TREM2基因的引物序列如下：上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQID NO.4所示。

用于诊断冠心病的TREM2基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、骨髓液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断冠心病的TREM2基因及其表达产物的来源是血液。

在本发明的上下文中，“TREM2基因”包括TREM2基因以及TREM2基因的任何功能等同物的多核苷酸。TREM2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中TREM2基因(NC_000006.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

优选地，TREM2基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述TREM2基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，TREM2基因表达产物包括TREM2蛋白以及TREM2蛋白的部分肽。所述TREM2蛋白的部分肽含有与冠心病相关的功能域。

“TREM2蛋白”包括TREM2蛋白以及TREM2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括TREM2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与TREM2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，TREM2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个；

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述TREM2蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。对于与TREM2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TREM2蛋白的生物学活性即可。

本发明的TREM2蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留TREM2蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断冠心病”既包括判断受试者是否已经患有冠心病，也包括判断受试者是否存在患有冠心病的风险。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明首次发现了TREM2基因表达与冠心病相关，通过检测受试者中TREM2的表达，可以判断受试者是否患有冠心病、或者判断受试者是否存在患有冠心病的风险，从而指导临床医师为受试者提供有效的预防手段或者治疗方案；

(2)本发明发现了一种新的分子标记物-TREM2基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现冠心病的早期诊断，从而降低冠心病的死亡率。

附图说明

图1为冠心病患者外周血单核细胞内TREM2 mRNA的表达水平图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明的目的在于提供一种TREM2的新用途。本发明人经前期研究，发现TREM2基因能够用于冠心病的的早期诊断，从而完成了本发明。

本发明提供采用如下技术方案：

检测TREM2基因mRNA表达水平的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。

具体的说，本发明以人外周血单核细胞为材料进行mRNA分子的实时荧光定量PCR分析。采用常规分子生物学技术，从细胞和组织中提取总RNA，经过特异性的引物进行反转录和PCR扩增。采用荧光实时定量(qRT-PCR)技术检测结果表明，TREM2在冠心病患者外周血单个核细胞中表达量明显增高。

因此本发明提供TREM2基因及蛋白表达在冠心病早期诊断中的应用。

实施例1健康人(15例)与冠心病患者(15例)外周血单核细胞内TREM2 mRNA表达量比较。

1.研究对象

收集冠心病患者15例，男9例，女6例，年龄45-75岁，病程3个月-1年。冠心病诊断标准：要求符合冠心病稳定型心绞痛诊断标准；稳定型心绞痛诊断标准参照中华医学会2007年公布的《慢性稳定型心绞痛诊断与治疗指南》和第七版《内科学》教材制定。冠心病纳入标准：①西医符合冠心病稳定型心绞痛诊断标准；②既往心肌梗死患者；PCI术后；冠脉CT显示冠脉狭窄超过50％；冠脉造影显示冠脉狭窄超过50％；运动心电图阳性；近期心电图有心肌缺血改变；上述六项满足一项者；③病史三个月以上，近一个月发作；④年龄：男性：45岁≤年龄≤75岁；女性：50岁≤年龄≤75岁；⑤自愿参加试验并签署知情同意书。排除标准：①急性冠脉综合征(ST段抬高性心肌梗死、非ST段抬高性心肌梗死、不稳定型心绞痛)、无症状性心肌缺血、缺血性心肌病、试验前3个月内心肌梗死者；②颈椎病、胆心综合症、胃及食管反流、主动脉夹层等非冠状动脉粥样硬化性心脏病所致胸痛及神经官能症者；③急性脑梗塞及脑出血者；④合并有严重心衰、肺、肝(血AST、ALT超过参考值上限1.5倍)、肾(血BUN、Cr超过参考值上限)、造血系统和内分泌系统等严重原发性疾病、恶性肿瘤、消化道出血、胃溃疡及有出血倾向等预计不能完成试验者；⑤严重心律失常(室早二联律、室速、室颤、三度房室传导阻滞、停搏、严重窦性心动过缓、病窦综合征、折返性室上性心动过速等引起血流动力学改变的心律失常)；⑥加拿大心血管病学会(CCS)心绞痛严重程度分级为IV级；⑦1个月内参加其他临床试验者；青光眼患者；妊娠、哺乳期妇女或过敏体质者；有神经、精神疾病、文盲或筛选过程中依从性差等不能合格填写问卷者。此项研究己通过辽宁中医药大学附属医院伦理委员会批准且所有患者签署知情同意书。

正常组：选取年龄35-60岁的健康志愿者15例，男9例，女6例。

两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。

2.人外周血单核细胞分离

采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞，具体操作方式如下：

(1)将10ml肝素抗凝静脉全血转入50ml离心管中，加入10ml磷酸缓冲液(PBS)溶液稀释，轻轻混匀；

(2)取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的Ficoll液体上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各加10ml稀释血液；

(3)800g离心30分钟，注意降速设置中一定要设置成no break，离心完毕，管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞。在上、下层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中；

(4)加入5倍以上体积的PBS，室温离心800g×5分钟，洗涤细胞两次；

(5)重悬细胞后加入红细胞裂解液，室温放置3分钟后离心800g×5分钟；

(6)离心后弃上清，加入不含血清的RPMI1640培养液重悬细胞，室温离心800g×5分钟，用不含血清的RPMI1640洗涤细胞两次。最后加入含有10％小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞；

(7)取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数细胞总数并检测细胞活力；活细胞百分率在95％以上可以继续后续实验。

3.细胞总RNA提取(TRIzol法)

(1)收获细胞1-5×10⁷细胞，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min；

(2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min；

(3)4℃离心，12000g×15min，取上清；

(4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)4℃离心，12000g×10min，弃上清；

(6)加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃，7500g×5min，弃上清；

(7)晾干标本，加入适量的DEPC水溶解；测定OD260和OD280值，初步断定RNA质量；

(8)总RNA提取采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。

3.qRT-PCR检测细胞中TREM2 mRNA的表达量

以细胞总RNA作为模板，进行qRT-PCR检测。

(1)利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录；

(2)采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μl，上游引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，DEPC水8.5μl；扩增TREM2基因的上游引物序列为5’-AGCCCACAACACCACAGT-3’(SEQ IDNO.3)，下游引物序列为5’-AAGGACAGCAGCCACAAG-3’(SEQ ID NO.4)；扩增GAPDH基因的上游引物序列为5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’(SEQ ID NO.5)，下游引物序列为5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’(SEQ ID NO.6)。扩增程序为：95℃7min，(95℃10s，60℃60s)*45个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在ABI QuantStudio3实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应，采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。

4.统计学处理

采用Prism Graphpad软件对结果进行统计分析及作图，所有数据以均数±标准差表示，两样本之间比较用Student t检验，以p<0.05具有统计学意义。

结果显示，冠心病患者外周血单个核细胞内TREM2的mRNA表达量显著高于健康对照人群(p<0.01)，差异具有统计学意义(图1)。

序列表

<110> 辽宁中医药大学

<120> TREM2作为早期诊断冠心病的分子标志物的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4681

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

1 gggcagcgcc tgacatgcct gatcctctct tttctgcagt tcaagggaaa gacgagatct

61 tgcacaaggc actctgcttc tgcccttggc tggggaaggg tggcatggag cctctccggc

121 tgctcatctt actctttgtc acaggtagga tcccctccgt gccctgtgat gccttctctc

181 cctcactttg agcatgtggt tggggcgcgg gtggtgggcc ctggggtgaa ttatgaaggc

241 ggtggcagtc ctcgcatgcc tgagtgccct gttctgcact cctctcctcc ccaccctgcc

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361 catgtggaca tgtaaggggc tggtggactc tggttgcatt ggaagggaag gagtgctaac

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4321 ttggagagca cagccatcaa gggtggactg ggcagggatg ggaggcggtg ccgagagggg

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Claims

1.检测TREM2基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测TREM2基因mRNA表达水平以诊断冠心病的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述RT-PCR检测TREM2基因mRNA表达水平以诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增TREM2基因的引物；所述实时定量PCR检测TREM2基因mRNA表达水平以诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增TREM2基因的引物；所述原位杂交检测TREM2基因mRNA表达水平以诊断冠心病的产品包括与TREM2基因的核酸序列杂交的探针；所述芯片检测TREM2基因mRNA表达水平以诊断冠心病的产品是基因芯片，基因芯片包括与TREM2基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述实时定量PCR检测TREM2基因mRNA表达水平以诊断冠心病的产品至少包括的一对特异扩增TREM2基因的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具能够通过检测人外周血单个核细胞中TREM2基因mRNA表达水平来诊断冠心病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芯片是基因芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TREM2基因转录水平的针对TREM2基因的寡核苷酸探针；所述试剂盒是基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测TREM2基因转录水平的试剂；所述试纸包括用于检测TREM2基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测TREM2基因转录水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测TREM2基因转录水平的试剂包括针对TREM2基因的引物和/或探针。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述针对TREM2基因的引物序列如下：上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物如SEQIDNO.4所示。