CN105112551B - 检测eps8l3基因表达的试剂在制备骨质疏松症诊断产品中的应用 - Google Patents

检测eps8l3基因表达的试剂在制备骨质疏松症诊断产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于诊断骨质疏松症的分子标志物，该分子标志物是EPS8L3基因。本发明研究证明与正常人相比，骨质疏松症患者血液中EPS8L3基因的mRNA表达水平显著下降。根据EPS8L3基因与骨质疏松症之间的存在的相关性，可以制备诊断骨质疏松症的试剂盒，该试剂盒可在临床上广泛应用。

Description

检测EPS8L3基因表达的试剂在制备骨质疏松症诊断产品中的 应用
技术领域
本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于骨质疏松症诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-EPS8L3基因在制备诊断骨质疏松症的产品中的应用。
背景技术
骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。
流行病学资料显示，美国约8百万人患骨质疏松症，2千万人骨量减少，每年有150万患者由于骨质疏松引发骨折。绝经后白人妇女骨质疏松发病率为17％，黑人妇女发病率为6％。年龄大于50岁人群中，将近50％女性和25％男性存在骨质疏松性骨折的潜在风险。我国是老年人口绝对数数量最多的国家，《骨质疏松症防治中国白皮书》根据2006年全国性汉族人群抽样调查结果显示，估算全国50岁以上人群中，约有6944万人(男1534万，女5410万)患有骨质疏松症，有2.1亿人患低骨量，存在骨质疏松症风险，预计到2020年我国骨质疏松和低骨量患者将增加至2.8亿。
目前诊断骨质疏松症主要依赖骨密度影像学检测方法，骨密度测定方法包括以下几种：X线光密度法、单光子吸收法、双光子吸收法、双能x线吸收法、定量计算机体层摄影、中子活化分析法、超声定量测量、磁共振测量、定量磁共振成像、高分辨率磁共振成像。上述方法主要的局限在于不能在骨质疏松症发生的早期给出可靠的判断。
为了提高骨质疏松症的治疗有效率，降低患者和国家的经济负担，寻找一种用于骨质疏松症早期诊断的方法是亟待解决的问题。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨质疏松症(Osterarthritis，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨质疏松症的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测EPS8L3基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测EPS8L3基因的表达水平以诊断骨质疏松症的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增EPS8L3基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增EPS8L3基因的引物；所述用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括：与EPS8L3蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括：与EPS8L3基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与EPS8L3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与EPS8L3基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增EPS8L3基因的引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测EPS8L3基因表达的产品可以应用于该平台实现对EPS8L3基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知EPS8L3基因的异常与骨质疏松症相关也属于EPS8L3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测EPS8L3基因转录水平的针对EPS8L3基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的EPS8L3蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括EPS8L3基因在内的多个基因(例如，与骨质疏松症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括EPS8L3蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨质疏松症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨质疏松症的标志物同时检测，可大大提高骨质疏松症诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测EPS8L3基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括EPS8L3蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测EPS8L3基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对EPS8L3基因的引物和/或探针。根据EPS8L3基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测EPS8L3基因表达水平的引物和探针。
所述高通量测序平台包括检测EPS8L3基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测EPS8L3基因的转录水平。
与EPS8L3基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述EPS8L3蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述EPS8L3蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与EPS8L3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对EPS8L3基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。
用于诊断骨质疏松症的EPS8L3基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断骨质疏松症的EPS8L3基因及其表达产物的来源是血液。
在本发明的上下文中，“EPS8L3基因”包括EPS8L3基因以及EPS8L3基因的任何功能等同物的多核苷酸。EPS8L3基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中EPS8L3基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，EPS8L3基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述EPS8L3基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，EPS8L3基因表达产物包括EPS8L3蛋白以及EPS8L3蛋白的部分肽。所述EPS8L3蛋白的部分肽含有与骨质疏松症相关的功能域。
“EPS8L3蛋白”包括EPS8L3蛋白以及EPS8L3蛋白的任何功能等同物。
所述功能等同物包括EPS8L3蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与EPS8L3的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，EPS8L3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述EPS8L3蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是EPS8L3蛋白的融合蛋白。对于与EPS8L3蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留EPS8L3蛋白的生物学活性即可。
本发明的EPS8L3蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留EPS8L3蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了EPS8L3基因表达与骨质疏松症相关，通过检测受试者中EPS8L3的表达，可以判断受试者是否患有骨质疏松症、或者判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-EPS8L3基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨质疏松症的早期诊断，从而降低骨质疏松症的死亡率。
附图说明
图1显示利用高通量测序检测EPS8L3基因在骨质疏松症患者和正常人中的表达差异；
图2显示利用QPCR检测EPS8L3基因在骨质疏松症患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
随机选择即将进行髓关节置换术的患者，检测骨密度，选择骨质疏松症患者8例，正常骨密度对照组(为外伤骨折，检测无骨质疏松症)8例，年龄52-68岁。问卷方式调查受试者生活方式和健康状况等情况。
骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。
骨质疏松症患者的排除标准：继发性骨质疏松症者。
2、血液总RNA提取
使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取
(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液RLS。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。
(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
5、高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
6、结果
RNA-seq结果显示(如图1所示)，与正常人相比，骨质疏松症患者血液中EPS8L3基因的mRNA水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2QPCR实验验证骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
随机选择即将进行髓关节置换术的患者，检测骨密度，选择骨质疏松症患者50例，正常骨密度对照组(为外伤骨折，检测无骨质疏松症)40例，年龄52-68岁。问卷方式调查受试者生活方式和健康状况等情况。
骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。
骨质疏松症患者的排除标准：继发性骨质疏松症者。
2、血液中总RNA的提取
2、血液总RNA提取
使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液RLS。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。
(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
5、QPCR
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增EPS8L3基因的正向引物序列为5’-GACCAGCAGGAAGAAGAA-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-TGGAAGCAGTCAATGTACT-3’(SEQ ID NO.4)；，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR
Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，
6、结果
结果如图2所示，与正常人相比，骨质疏松症患者血液中EPS8L3基因的mRNA水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果同RNA-seq实验。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.检测EPS8L3基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片、或高通量测序平台检测EPS8L3基因的表达水平以诊断骨质疏松症的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增EPS8L3基因的引物；用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增EPS8L3基因的引物；用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括：与EPS8L3蛋白特异性结合的抗体；用原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括：与EPS8L3基因的核酸序列杂交的探针；用芯片诊断骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，蛋白芯片包括与EPS8L3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与EPS8L3基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括的一对特异扩增EPS8L3基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测EPS8L3基因表达的样本是血液。
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