CN108070649A - Kcne1基因在诊断慢性阻塞性肺疾病中的应用 - Google Patents

Kcne1基因在诊断慢性阻塞性肺疾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了KCNE1基因可以作为慢性阻塞性肺疾病早期诊断的分子标志物。本发明利用基因芯片和QPCR的方法发现KCNE1基因在正常人和慢性阻塞性肺疾病患者的血液中的表达存在显著差异，即可以通过检测血液中KCNE1基因表达情况来判断受试者是否患有慢性阻塞性肺疾病。根据两者的相关性，本发明开发了一种诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒，该试剂盒通过检测KCNE1基因的表达从而进行帕金森的诊断。本发明的诊断试剂盒可用于疾病的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

KCNE1基因在诊断慢性阻塞性肺疾病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒以及KCNE1基因在制备慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒中的用途。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种常见的气流受限性呼吸系统疾病，其气流受限通常呈进行性发展，伴有吸入有害气体或颗粒后形成的慢性气道炎症反应。临床主要表现为呼吸困难和慢性咳嗽、咳痰(中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学組，慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)[J]，中华结核和呼吸杂志，2014，36(2)：8-17)。
世界范围内，各国慢阻肺的患病率变异性较大。一项针对拉丁美洲墨西哥城、蒙得维的亚等五大城市40岁以上人群的调查数据显示，慢阻肺的患病率从7.8％到19.7％不等(Menezes AMB，Perez-Padilla R，Jardim JR，et al.Chronic obstructive pulmonarydisease in five Latin American cities(the PLATINO Study)：a prevalence study.[J],Lancet,2005,366(9500):1875-1881)；同时中国的慢阻肺形势也不容乐观，2007年的一份调查数据显示，在北京、天津、上海、广州等7个地区40岁及以上人群中慢阻肺患病率己达8.2％，其中男性的患病率甚至己经达到12.4％(Zhong N，Wang C,Yao W，etal.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China:a large,population-based survey.[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176(8)：753-760)。尽管调查数据有竖差异，但是仍可以看出慢阻肺总体患病率形势的严峻。随着人口的老龄化、缺血性心脏病与感染性疾病死亡率的下降以及吸烟人口的增多，慢阻肺的死亡率也逐年增高。
世界卫生组织调查数据显示，2012年全球共有310万人死于慢阻肺，占全球总死亡人数的5.6％，慢阻肺成为2012年全球第3大死因，据全球疾病负担项目估计，到2020年慢阻肺将继续占据全球死亡原因第3位(Lozano R,et al,Global and regional mortalityfrom 235causes of death for 20age groups in 1990and 2010:a systematicanalysis for the Global Burden of Disease Study 2010.Lancet,2012,380(9859):2095-2128)。与患病率、死亡率相应的还有慢阻肺带来的巨大经济和社会负担。欧盟2003年的数据显示，居民呼吸道疾病花费占整个医疗支出的6％，而其中慢阻肺相关费用占据了整个呼吸道疾病花费的56％(Loddenkemper R.European Lung White Book.The firstcomprehensive survey on respiratory health in Europe.[J].NewcastleUniversity,2003)。同样在2003年，美国国家心肺血液研究所估计美国公民全年慢阻肺相关的花费总额达321亿美元，其中与慢阻肺间接相关的花费达180亿美元。因此，做好慢阻肺的预防、诊断和治疗不仅有着医疗方面的意义，而且兼具着巨大的经济和社会意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于慢性阻塞性肺疾病早期诊断的分子标志物。相比传统的慢性阻塞性肺疾病的诊断方法，使用基因标志物来诊断慢性阻塞性肺疾病的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测KCNE1基因表达的产品在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测KCNE1基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测KCNE1基因表达水平以诊断慢性阻塞性肺疾病的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增KCNE1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增KCNE1基因的引物；所述用免疫检测诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与KCNE1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与KCNE1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KCNE1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KCNE1基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增KCNE1基因的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测KCNE1基因表达的产品可以应用于该平台实现对KCNE1基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知KCNE1基因的异常与慢性阻塞性肺疾病相关也属于KCNE1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断慢性阻塞性肺疾病的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KCNE1基因转录水平的针对KCNE1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KCNE1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括KCNE1基因在内的多个基因(例如，与慢性阻塞性肺疾病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括KCNE1蛋白在内的多个蛋白质(例如与慢性阻塞性肺疾病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与慢性阻塞性肺疾病的标志物同时检测，可大大提高慢性阻塞性肺疾病诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KCNE1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KCNE1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测KCNE1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对KCNE1基因的引物和/或探针。根据KCNE1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测KCNE1基因表达水平的引物和探针。
与KCNE1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
所述高通量测序平台包括检测KCNE1基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测KCNE1基因的转录水平。
进一步，所述KCNE1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述KCNE1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KCNE1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对KCNE1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
用于诊断慢性阻塞性肺疾病的KCNE1基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断慢性阻塞性肺疾病的KCNE1基因及其表达产物的来源是血液。
在本发明的上下文中，“KCNE1基因”包括KCNE1基因以及KCNE1基因的任何功能等同物的多核苷酸。KCNE1基因(NC_000021.9(34446688..34512275,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，KCNE1基因表达产物包括KCNE1蛋白以及KCNE1蛋白的部分肽。所述KCNE1蛋白的部分肽含有与慢性阻塞性肺疾病相关的功能域。
“KCNE1蛋白”包括KCNE1蛋白以及KCNE1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括KCNE1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与KCNE1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是KCNE1蛋白的融合蛋白。对于与KCNE1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留KCNE1蛋白的生物学活性即可。
在本发明的上下文中，“诊断慢性阻塞性肺疾病”既包括判断受试者是否已经患有慢性阻塞性肺疾病、也包括判断受试者是否存在患有慢性阻塞性肺疾病的风险。
本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次证明了KCNE1基因与慢性阻塞性肺疾病相关，因此KCNE1基因成为了诊断慢性阻塞性肺疾病的分子标志物，同时为研究慢性阻塞性肺疾病的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊断慢性阻塞性肺疾病较现有技术中的使用方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。
附图说明
图1显示利用QPCR检测KCNE1基因在慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中的表达差异；
图2显示利用免疫印迹检测KCNE1蛋白在慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选慢性阻塞性肺疾病患者和正常人的差异表达基因
1、临床研究对象：
选取慢性阻塞性肺疾病患者5例，其中男性2例，女性3例，年龄范围50-79岁，诊断标准均符合我国2007年修订的《慢性阻塞性肺疾病诊疗规范》。
诊断标准：任何患有呼吸困难、慢性咳嗽或多痰的患者，并且有暴露于危险因素的病史，行肺功能检查显示，在吸入支气管舒张剂后，表明存在气流受限，可以诊断为COPD。
排除标准：①合并其它肺部疾病者，如支气管哮喘、肺间质纤维化、肺癌等；②有其它部位感染者；③伴有严重心脑血管疾病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤、脏器功能衰竭、肝炎者；④患免疫系统疾病或者近期使用过免疫抑制剂者。
正常对照：选取体检的健康人6人，其中男性3人，女性3人，年龄范围50-79。
入选标准：无慢性咳嗽、咳痰、端息等病史；近期无上呼吸道感染、肺部感染史；无全身其他部位感染者；无其他肺部疾病者；近期未使用免疫抑制剂或者无全身免疫系统疾病者；无器官功能衰竭或者严重心脑血管疾病、肿瘤者；无过敏性疾病者。入选对象行肺功能检查均排除并与慢性阻塞性肺疾病组对比，在性别、年龄上差异均无统计学意义具有可比性。
所有研究对象均签署了知情同意书。
2、样本采集
所有研究对象于清晨空腹状态下，抽取外周静脉血10ml，EDTA抗凝。
3、血液样本总RNA提取
使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液RLS。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。
(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
6、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
7、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
8、Illumina x-ten上机测序
Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。
9、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；
(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。
10、结果
用以上标准筛选得到差异表达基因3296个，其中表达上调的基因1428个，表达下调的基因有1868个。
实施例2 QPCR验证候选基因与慢性阻塞性肺疾病的关系
基于前期高通量测序的结果，根据P value的大小，我们选择KCNE1基因(其表达在慢性阻塞性肺疾病患者中上调)进行验证。
1、研究对象：
按照实施例1的方法选择慢性阻塞性肺疾病患者45例，正常人35例。
2、血液总RNA提取
使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液RLS。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。
(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、测量总RNA浓度及纯度
用NanoVue Plus仪器测量样本RNA的浓度及纯度。
4、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
5、QPCR扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增KCNE1基因的正向序列5’-GCTACAGGTCGTGCTATG-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-AAGGCTTCGTCTCAGGAA-3’(SEQ ID NO.2)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-ATGTTCCAATATGATTCCA-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-GATTTCCATTGATGACAAG-3’(SEQ ID NO.4)。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃5s，60℃55s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常人相比，KCNE1基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中上调，差异具有统计学意义(*P<0.05)。
实施例3免疫印迹实验验证慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中差异表达基因的表达产物
1、临床对象：同实施例2。
2、单核细胞分离
慢性阻塞性肺疾病患者和正常人取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HPO40.132g，KH2PO40.06g，KCl 0.4g，酚红1ml，NaHCO3 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×106个/ml备用。
3、单核细胞总蛋白质提取
将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1 000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
4、Western blot检测
细胞总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图2显示，与正常人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液中KCNE1蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> KCNE1基因在诊断慢性阻塞性肺疾病中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctacaggtc gtgctatg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggcttcgt ctcaggaa 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttccaat atgattcca 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatttccatt gatgacaag 19

Claims (10)

1.检测KCNE1基因表达的产品在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测KCNE1基因表达水平以诊断慢性阻塞性肺疾病的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增KCNE1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增KCNE1基因的引物；所述用免疫检测诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与KCNE1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与KCNE1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KCNE1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KCNE1基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括的一对特异扩增KCNE1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.一种用于诊断慢性阻塞性肺疾病的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中KCNE1基因的表达来诊断慢性阻塞性肺疾病。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KCNE1基因转录水平的针对KCNE1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KCNE1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KCNE1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KCNE1蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测KCNE1基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测KCNE1基因转录水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测KCNE1基因转录水平的试剂包括针对KCNE1基因的引物和/或探针。
9.根据权利要求8所述的工具，其特特征在于，所述针对KCNE1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103890193A (zh) * 2011-08-29 2014-06-25 心脏Dx公司 用于确定吸烟状态的方法和组合物
CN107267662A (zh) * 2017-08-22 2017-10-20 常州市第二人民医院 慢性阻塞性肺疾病的诊断工具

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