CN108303547A - 一种用于诊断慢性阻塞性肺疾病的分子标志物 - Google Patents

一种用于诊断慢性阻塞性肺疾病的分子标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了可用于诊断慢性阻塞性肺疾病的基因标志物。该基因标志物是GMFG基因。通过检测受试者血液中GMFG基因和GMFG蛋白的水平，可以判断受试者是否患有慢性阻塞性肺疾病或者判断受试者是否患有慢性阻塞性肺疾病的风险。根据GMFG基因和GMFG蛋白可以开发通过检测GMFG基因或GMFG蛋白的含量来诊断慢性阻塞性肺疾病的产品，该诊断产品可在临床上推广使用。

Description

一种用于诊断慢性阻塞性肺疾病的分子标志物
技术领域
本发明涉及慢性阻塞性肺疾病诊断领域，更具体地，本发明涉及GMFG基因作为慢性阻塞性肺疾病的诊断工具。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸科的常见病、多发病，也是国际上公认的严重威胁人们健康的慢性肺部疾病，其发病率及死亡率高，严重增加人们及社会的经济负担。据世界卫生组织统计，2000年COPD占全球死亡原因的第四位(Aibek E Mirrakhimov.Chronicobstructive pulmonary disease and glucose metabolism:a bitter sweetsymphony.Cardiovasc Diabetol,2012,11:132)，预计到2020年，COPD将上升为第三位致死原因，且成为全球经济负担的第五位(余国辉，陈敏.慢性阻塞性肺疾病发病机制的发展状况[J].临床肺科杂志，2010,15(1):72-74)。在中国，COPD已居疾病负担序列的第一位。其持续慢性进展严重危害患者劳动能力和生活质量。
慢性阻塞性肺疾病是一种肺部慢性疾病，它是由于慢性支气管炎和肺气肿导致气流受限的一类肺部疾病，同时也可引起肺外器官受到损害。气流受限不完全可逆，呈进行性发展，可伴有气道高反应性(Beasley V,Joshi PV,Singanayagam A,et al.microbiologyand exacerbations in COPD[J].Int J Chron Obstruct Puhnon Dis,2012,7:555-569)。目前认为慢性阻塞性肺疾病的发生发展与诸多因素有关，如感染、过敏因素、吸烟、职业性粉尘、大气污染、有毒物质等的长期吸入，以及机体的内在因素、营养状态、自主神经功能紊乱等，它们均可导致支气管慢性炎症，使支气管粘膜上皮细胞发生变性、坏死，出现纤毛倒伏、变短、粘连，甚至部分脱落，以至于粘膜上皮出现麟状上皮化生及肉芽组织、纤维组织增生导致气管及支气管管腔狭窄，气道壁结构重塑及症痕形成，从而致使气道高反应性，引起气流受限(Chih-Hsin Lee,Ming-Chia Lee,Hsien-Ho Lin,et a1.PuhnonaryTuberculosis and Delay in Anti-Tuberculous Treatment Are Important RiskFactors for Chronic Obstructive Pulmonary Disease.PLoS One,2012,7(5):e37978)。COPD的发病机制目前尚未完全阐明，是医学界研究的热点问题之一。近年来，COPD的发病机制学说主要分为以下几种：氧化/抗氧化失衡(Eirini Neofytou,Eleni G.Tzortzaki,Argiro Chatziantoniou,et al.DNA Damage Due to Oxidative Stress in ChronicObstructive Pulmonary Disease(COPD)[J].Int J Mol Sci,2012,13(12):16853-16864)、慢性炎症、细胞凋亡(Jeffrey T J Huang,Rekha Chaudhuri,OsarnaAlbarbarawi,et a1.Clinical validity of plasma and urinary desmosine asbiomarkers for chronic obstructive pulmonary disease.Thorax,2012,67(6):502-508)、蛋白酶抗蛋白酶失衡等，其中炎症介质、细胞因子等介导的气道慢性炎症反应是COPD发病的主要环节。当机体遇到过敏因素或者吸入粉尘、有害气体和颗粒时，肺组织内巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞开始增生，并释放炎症介质、趋化因子及细胞因子等，触发一系列级联反应，作用于效应细胞，导致肺泡结构的破坏，气道粘液腺体增生肥大及粘液过度地分泌，从而引起气道重建(Stockley RA.Progression of chronic obstructivepulmonary disease:impact of inflammation,comorbidities and therapeuticintervention.Curr Med Res Opin,2009,25(5):1235-1245)。
GOLD以及我国的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》均以FEV1/FVC＜0.70作为COPD的诊断标准，随着这种诊断模式的广泛宣传，近年其被越来越多的国内外呼吸科医生及肺功能检查技术人员所接受。但是，越来越多的证据发现，以FEV1/FVC＜0.70作为COPD的诊断标准可导致大量临床误诊，当前这一诊断标准正受到前所未有的挑战。因此开发一种可用于准确诊断COPD的方法是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过检测GMFG基因或蛋白表达差异来诊断慢性阻塞性肺疾病的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测GMFG基因或GMFG蛋白的产品在制备慢性阻塞性肺疾病诊断工具中的用途。
进一步，所述检测GMFG基因或GMFG蛋白的产品包括检测GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合GMFG基因的核酸或者能够结合GMFG蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测GMFG基因的表达水平；所述物质能够检测GMFG蛋白的表达水平。
本发明的检测GMFG基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增GMFG基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测GMFG蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测GMFG蛋白的产品包括特异性结合GMFG蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测GMFG蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的GMFG蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对GMFG蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
进一步，所述检测GMFG基因或GMFG蛋白的产品可以是检测GMFG基因或GMFG蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平升高，则诊断该受试者为慢性阻塞性肺疾病患者或诊断该受试者患有慢性阻塞性肺疾病的风险高。
作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断慢性阻塞性肺疾病的工具，所述工具能够检测受试者样本中GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合GMFG基因的核酸或者能够结合GMFG蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测GMFG基因的表达水平；所述物质能够检测GMFG蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断慢性阻塞性肺疾病的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断慢性阻塞性肺疾病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知GMFG基因的异常与慢性阻塞性肺疾病相关也属于GMFG基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗GMFG抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合GMFG即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制GMFG功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗GMFG抗体的其他性质同前面所述。
进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断慢性阻塞性肺疾病的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取慢性阻塞性肺疾病受试者的样品；
(2)检测受试者样品中GMFG基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的GMFG基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与正常对照相比，GMFG基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为慢性阻塞性肺疾病，或该受试者被诊断为将来患有慢性阻塞性肺疾病的风险高。
在本发明的上下文中，“诊断慢性阻塞性肺疾病”既包括判断受试者是否已经患有慢性阻塞性肺疾病、也包括判断受试者是否存在患有慢性阻塞性肺疾病的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断慢性阻塞性肺疾病的分子标志物，使用该分子标志物可以在慢性阻塞性肺疾病发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测GMFG基因在慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中的表达差异。
图2显示利用Western blot检测GMFG蛋白在慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中差异表达的基因
1、临床研究对象：
选取慢性阻塞性肺疾病患者5例，其中男性2例，女性3例，年龄范围50-79岁，诊断标准均符合我国2007年修订的《慢性阻塞性肺疾病诊疗规范》。
诊断标准：任何患有呼吸困难、慢性咳嗽或多痰的患者，并且有暴露于危险因素的病史，行肺功能检查显示，在吸入支气管舒张剂后，表明存在气流受限，可以诊断为COPD。
排除标准：①合并其它肺部疾病者，如支气管哮喘、肺间质纤维化、肺癌等；②有其它部位感染者；③伴有严重心脑血管疾病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤、脏器功能衰竭、肝炎者；④患免疫系统疾病或者近期使用过免疫抑制剂者。
正常对照：选取体检的健康人6人，其中男性3人，女性3人，年龄范围50-79。
入选标准：无慢性咳嗽、咳痰、端息等病史；近期无上呼吸道感染、肺部感染史；无全身其他部位感染者；无其他肺部疾病者；近期未使用免疫抑制剂或者无全身免疫系统疾病者；无器官功能衰竭或者严重心脑血管疾病、肿瘤者；无过敏性疾病者。入选对象行肺功能检查均排除并与慢性阻塞性肺疾病组对比，在性别、年龄上差异均无统计学意义具有可比性。
所有研究对象均签署了知情同意书。
2、样本采集
所有研究对象于清晨空腹状态下，抽取外周静脉血10ml，EDTA抗凝。
3、血液样本总RNA提取
使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液RLS。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。
(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
6、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
7、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
8、Illumina x-ten上机测序
Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。
9、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；
(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。
10、结果
用以上标准筛选得到差异表达基因3296个，其中表达上调的基因1428个，表达下调的基因有1868个。
实施例2 QPCR验证候选基因与慢性阻塞性肺疾病的关系
基于前期高通量测序的结果，根据P value的大小，我们选择GMFG基因(其表达在慢性阻塞性肺疾病患者中上调)进行验证。
1、研究对象：
按照实施例1的方法选择慢性阻塞性肺疾病患者45例，正常人35例。
2、血液总RNA提取
使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液RLS。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。
(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、测量总RNA浓度及纯度
用NanoVue Plus仪器测量样本RNA的浓度及纯度。
4、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
5、QPCR扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增GMFG基因的正向序列5’-ACAACAGATGATGTATGC-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-AACGAAAGAAAGACAACT-3’(SEQID NO.2)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-ATGTTCCAATATGATTCCA-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-GATTTCCATTGATGACAAG-3’(SEQ ID NO.4)。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃10s，60℃55s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常人相比，GMFG基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中上调，差异具有统计学意义(*P<0.05)。
实施例3免疫印迹实验验证慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中差异表达基因的表达产物
1、临床对象：同实施例2。
2、单核细胞分离
慢性阻塞性肺疾病患者和正常人取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HPO4 0.132g，KH2PO40.06g，KCl 0.4g，酚红1ml，NaHCO3 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×106个/ml备用。
3、单核细胞总蛋白质提取
将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1 000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
4、Western blot检测
细胞总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图2显示，与正常人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液中GMFG蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 一种用于诊断慢性阻塞性肺疾病的分子标志物
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaacagatg atgtatgc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgaaagaa agacaact 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttccaat atgattcca 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatttccatt gatgacaag 19

Claims (10)

1.检测GMFG基因或GMFG蛋白的产品在制备慢性阻塞性肺疾病诊断工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测GMFG基因或GMFG蛋白的产品包括检测GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平升高，则诊断该受试者为慢性阻塞性肺疾病患者或者诊断该受试者患有慢性阻塞性肺疾病的风险高。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合GMFG基因的核酸或者能够结合GMFG蛋白的物质；所述核酸能够检测
GMFG基因的表达水平；所述物质能够检测GMFG蛋白的表达水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增GMFG基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.一种诊断慢性阻塞性肺疾病的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受试者样本中的GMFG基因或GMFG蛋白的表达水平的工具。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合GMFG基因的核酸或者能够结合GMFG蛋白的物质；所述核酸能够检测GMFG基因的表达水平；所述物质能够检测GMFG蛋白的表达水平。
9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增GMFG基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。
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