CN107022633A - 用于诊断强直性脊柱炎的基因标志物 - Google Patents

用于诊断强直性脊柱炎的基因标志物 Download PDF

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李曙光
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Abstract

本发明公开了可用于诊断强直性脊柱炎的基因标志物。该基因标志物是ARHGAP26基因。通过检测受试者血液中ARHGAP26基因和ARHGAP26蛋白的水平，可以判断受试者是否患有强直性脊柱炎或者判断受试者是否患有强直性脊柱炎的风险。根据ARHGAP26基因和ARHGAP26蛋白可以开发通过检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的含量来诊断强直性脊柱炎的产品，该诊断产品可在临床上推广使用。

Description

用于诊断强直性脊柱炎的基因标志物
技术领域
本发明涉及强直性脊柱炎诊断领域，更具体地，本发明涉及用于诊断强直性脊柱炎的基因标志物。
背景技术
强直性脊柱炎又名别赫捷列夫氏(VonBechterev)病或马-施二氏(Maritstrumpell)病，是一种慢性、进行性，中轴关节受累的慢性炎症性疾病。主要影响骨盆的骶髂关节、脊柱关节和椎旁组织。主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限、X线显示两侧骶髂关节炎(sacroilitis)为其特征。由于该病一般先侵犯骶髂关节，并重点累及脊柱，最终导致脊柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎(AnkglosingSpondytitis，AS)。
强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种自身免疫性疾病，多发于16-40岁的青壮年，男女患病比例约为4-10：1。AS在白种人群中的发病率约为1％-3％，我国AS患病率约为0.2-0.6％，其中60％以上的患者伴有髋关节受累，致使20％以上AS患者残疾。AS属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与免疫因素在AS发病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。
但该病从发病到明确诊断往往需要5-7年的时间。虽然近几年，国内外在本病的诊断及治疗方法上均有不少进展，但由于本病是慢性进展性疾病，致残率较高，目前仍缺乏特异治疗，到后期病情不可逆转，严重影响患者生活自理能力和工作能力，给患者及家人带来沉重的精神和经济负担。因此早期诊断和合理治疗对延缓病理进展、降低致残、改善预后起到至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过检测ARHGAP26基因或蛋白表达差异来诊断强直性脊柱炎的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的产品在制备强直性脊柱炎诊断工具中的用途。
进一步，所述检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的产品包括检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合ARHGAP26基因的核酸或者能够结合ARHGAP26蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ARHGAP26基因的表达水平；所述物质能够检测ARHGAP26蛋白的表达水平。
本发明的检测ARHGAP26基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增ARHGAP26基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测ARHGAP26蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测ARHGAP26蛋白的产品包括特异性结合ARHGAP26蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测ARHGAP26蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的ARHGAP26蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对ARHGAP26蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
进一步，所述检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的产品可以是检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平升高，则诊断该受试者为强直性脊柱炎患者或诊断该受试者患有强直性脊柱炎的风险高。
作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断强直性脊柱炎的工具，所述工具能够检测受试者样本中ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合ARHGAP26基因的核酸或者能够结合ARHGAP26蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ARHGAP26基因的表达水平；所述物质能够检测ARHGAP26蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断强直性脊柱炎的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断强直性脊柱炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ARHGAP26基因的异常与强直性脊柱炎相关也属于ARHGAP26基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ARHGAP26抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合ARHGAP26即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制ARHGAP26功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ARHGAP26抗体的其他性质同前面所述。
进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断强直性脊柱炎的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取强直性脊柱炎受试者的样品；
(2)检测受试者样品中ARHGAP26基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的ARHGAP26基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与正常对照相比，ARHGAP26基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为强直性脊柱炎，或该受试者被诊断为将来患有强直性脊柱炎的风险高。
在本发明的上下文中，“诊断强直性脊柱炎”既包括判断受试者是否已经患有强直性脊柱炎、也包括判断受试者是否存在患有强直性脊柱炎的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断强直性脊柱炎的分子标志物，使用该分子标志物可以在强直性脊柱炎发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测ARHGAP26基因在强直性脊柱炎患者和正常人中的表达差异。
图2显示利用Western blot检测ARHGAP26蛋白在强直性脊柱炎患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选强直性脊柱炎患者和正常人中差异表达的基因
1、样本采集：
病例样本全部采集自门诊病人，患者的诊断由富有临床经验的风湿病科医师根据1984年提出修订的纽约标准作出，并通过多次随访确诊。对照样本来自南方中心样本库中年龄、性别匹配，无关节炎病史的个体。
在知情同意的基础上随机收集了5个病人和7个正常对照个体的外周血样本。
2、全血总RNA提取
取空腹血2ml经EDTA.NA2抗凝，全血0.3ml采用3S柱离心式血液总RNA抽提试剂盒(K3620上海博彩生物科技有限公司)抽取RNA，RNA提取物于-80℃保存。
3、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
6、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
7、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
8、Illumina x-ten上机测序
Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。
9、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；
(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。
10、结果
RNA-seq结果显示，强直性脊柱炎患者和正常人之间共筛选出523个差异表达基因，其中，上调表达基因为342个，下调表达基因为181个。根据p-value排序，选择ARHGAP26基因进行大样本验证。
实施例2大样本验证差异表达基因
1、样本采集
病例样本全部采集自门诊病人，患者的诊断由富有临床经验的风湿病科医师根据1984年提出修订的纽约标准作出，并通过多次随访确诊。对照样本来自南方中心样本库中年龄、性别匹配，无关节炎病史的个体。
在知情同意的基础上随机收集了30个病人和45个正常对照个体的外周血样本。
2、全血总RNA提取
取空腹血2ml经EDTA.NA2抗凝，全血0.3ml采用3S柱离心式血液总RNA抽提试剂盒(K3620上海博彩生物科技有限公司)抽取RNA，RNA提取物于-80度保存。
3、应用QPCR
全血总RNA合成cDNA使用TAKARA反转录反应试剂盒(DRR037S大连宝生物工程有限公司)。总反应体系为20μl，包括2*SYBR Premix Ex TapTM，1-100ng cDNA，50pmol/μl引物。两步法PCR循环条件：预变性95度30s，1个循环；变性95度 10s，退火/延伸60度 15s共40个循环。
引物序列如下：
扩增ARHGAP26基因的正向引物序列为5’-
TTGAAGATGAACGGATAC-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物序列为5’-
CTAAGATGCCACAATACT-3’(SEQ ID NO.2)；
扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-GCTGTTGTCATACTTCTC-3’(SEQ ID NO.4)。
4、相对定量分析
相对定量分析采用light cycler relative quantification(version 1.5)软件，标准化比值计算公式采用2-△△CT法，△CT(患者样本)＝CT目的基因-CT内参基因，△CT(校正品)＝CT目的基因-CT内参基因，△△CT＝△CT(患者样本)-△CT(校正品)
5、结果
结果如图1所示，与正常人相比，强直性脊柱炎患者血液中ARHGAP26基因表达量明显升高，差异具有统计学意义。
实施例2血液中ARHGAP26蛋白的差异表达
1、单核细胞分离
外周血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HPO4 0.132g，KH2PO4 0.06g，KCl 0.4g，酚红1ml，NaHCO3 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×106个/ml备用。
3、单核细胞总蛋白质提取
将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1 000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
4、Western blot检测
将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图2所示，与正常人相比，强直性脊柱炎患者血液中ARHGAP26蛋白含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 用于诊断强直性脊柱炎的基因标志物
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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ttgaagatga acggatac 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgttgtca tacttctc 18

Claims (10)

1.检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的产品在制备强直性脊柱炎诊断工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的产品包括检测ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平升高，则诊断该受试者为强直性脊柱炎患者或者诊断该受试者患有强直性脊柱炎的风险高。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合ARHGAP26基因的核酸或者能够结合ARHGAP26蛋白的物质；所述核酸能够检测ARHGAP26基因的表达水平；所述物质能够检测ARHGAP26蛋白的表达水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增ARHGAP26基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.一种诊断强直性脊柱炎的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受试者样本中的ARHGAP26基因或ARHGAP26蛋白的表达水平的工具。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合ARHGAP26基因的核酸或者能够结合ARHGAP26蛋白的物质；所述核酸能够检测ARHGAP26基因的表达水平；所述物质能够检测ARHGAP26蛋白的表达水平。
9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增ARHGAP26基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。
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