CN109182561A - Arhgap26作为牛超数排卵性状分子标记的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ARHGAP26作为牛超数排卵性状分子标记的应用，以提取的牛基因组DNA为模板，设计特异性引物一对，克隆牛ARHGAP26基因的部分DNA序列，通过测序及基因型分型并将不同基因型与超数排卵性状进行关联分析，为牛的标记辅助选择提供分子标记；该位点作为牛繁殖和生产性能辅助选择的分子标记并应用于遗传改良提供了重要的理论依据并具有良好的应用前景。

Description

ARHGAP26作为牛超数排卵性状分子标记的应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，公开了ARHGAP26作为牛超数排卵性状分子标记的应用，尤其是涉及牛ARHGAP26基因片段的克隆以及其在牛超数排卵性状标记辅助选择中的应用。

背景技术

超数排卵（Superovulation）和胚胎移植（Embryo Transfer）技术在畜牧业生产，尤其是牛、羊等单胎、繁殖力相对较低的大型动物中的应用极大地提高了其繁殖性能，对不断推进畜牧业发展，特别是优良品种的快速扩繁具有重要意义（Flanders et. al.,2015；Saadi et. al.,2015； Niemann et. al.,2018）。

而众多报道也表明，遗传基础是动物性状表现的重要因素之一，而基因的多态性及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点对于动物性状影响巨大（Mapletoft et. al.,2002；Vignal et. al.,2002），可用于家畜繁殖性能，尤其是超数排卵的效果的预测甚至是种用性能的评定（Fauser et. al.,2008；Hayes et. al.,2010；Speed et. al.,2014）。目前，超数排卵的效果可简单而直接的通过获得的总胚胎数和可用胚胎数评价。

传统研究表明，ARHGAP26可促进笼形蛋白非依赖性载体蛋白/GPI-富集的早期内区室（CLIC/GEEC）通路形成的关键多结构域蛋白（Lundmark et. al.,2008）。其蛋白家族中的几个成员，包括GRAF2、GRAF3和Oligophrenin在网格蛋白非依赖性内吞事件中都可能发挥类似的作用，从而影响细胞诸如生长、发育、分化等生理过程（Barresi et al.,2011；Doherty et al.,2011；Qian et al.,2011）。ARHGAP26的SNP人类白血病、发育迟滞及自身抗体与自身免疫性有关（Jarius et. al.,2010；Doss et. al.,2013）。而在动物繁殖领域，虽然配子的形成及后续胚胎发育均与细胞生长、增殖、发育和生殖免疫具有潜在联系，但ARHGAP26在此领域的研究及应用较少。

申请人通过对该基因遗传多态性和超数排卵性状进行的关联分析，明确了ARHGAP26基因特殊位点单核苷酸遗传多态性及其准确、快速鉴定方法，并确定了该位点遗传多态性对牛超数排卵效果的影响，为将其作为牛繁殖和生产性能辅助选择的分子标记并应用于遗传改良提供了重要的理论依据和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克隆牛ARHGAP26基因片段，鉴定其特定的突变位点以作为牛超数排卵性能相关基因的多态性检测方法，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

一种通过特异性引物和PCR(Polymerase Chain Reaction)方法获得的牛超数排卵性能相关基因ARHGAP26的645bp序列，如表SEQ ID NO:1所示。

所获得ARHGAP26基因片段的DNA序列中如表SEQ ID NO:1所述的C→T的碱基突变，导致基因单核苷酸多态性（SNP）的产生。

一种筛选适用于牛超数排卵性状的分子标记的方法，按照以下步骤制备：

通过设计特异性引物一对：

正向引物ARHGAP2-F: 5’- ACCGTGGAGAAAGTGGATAAA -3’；

反向引物ARHGAP2-R: 5’- GAATCCCAGACTCAGCCTACAA -3’；

从牛血液中提取基因组DNA，进行PCR扩增。由于PCR产物片段的DNA序列第233位点（C₂₃₃T）存在C-T的碱基突变，导致SNP多态性的产生，利用序列测定可明确基因型。将检测结果所示的不同基因型与牛超数排卵性状进行关联分析后，结果表明，具备特定基因型的个体将获得更好的超数排卵效果。

以下对本发明作详细的描述：

一、牛ARHGAP26基因片段的克隆

利用生物学软件Oligo6.0设计一对特异性引物。建立PCR反应条件，具体情况如下：

正向引物：ARHGAP26-F: 5’- ACCGTGGAGAAAGTGGATAAA -3’；

反向引物：ARHGAP26-R: 5’- GAATCCCAGACTCAGCCTACAA -3’；

为较快地获得良好的结果，本发明选择Takara公司的2×Premix Taq ^TM PCR反应预混液进行PCR扩增。具体反应体系为：2×Premix Taq ^TM（产品包装盒内提供）10.0μl,正向引物与反向引物（浓度为均为10pmol/μl）各0.5μl,基因组DNA 0.5μl(含10-50ngDNA)，二馏水8.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃最后延伸5分钟。

二、PCR产物序列测定及基因型的判定

用引物ARHGAP26-F和ARHGAP26-R扩增牛基因组DNA得到645bp的特异扩增片段（图1及SEQ ID NO:1）。测序结果发现，在该645bp片段中，由于C₂₃₃T处存在C→T的突变，不同基因型CC型、CT型和TT型的产生，其中，CC型个体C₂₃₃T位点为C碱基纯合体；CT型个体C₂₃₃T位点为C/T杂合性个体；TT型个体C₂₃₃T位点为T碱基纯合体（图2）。

三、标记性状关联分析

利用申请人所拥有的实验群体为实验对象进行性状关联分析，使用SPSS22.0软件的One-Way ANOVA过程，建立如下模型进行性状关联分析：

统计分析模型为：Y_ij=μ+G_i+e_j。其中，Y_ij为被观测个体的生产性能表型值；μ为生产性能的最小二乘均值；G_i为基因型对生产性能的效应值；e_j为对应于观察值的随机残差。

本发明的效果是如下：

1、牛ARHGAP26基因部分DNA序列的克隆及不同基因型的判定

PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，如图1所示。将PCR产物回收测序，结果显示产物长度为645bp。测序结果显示该片段233bp处存在C、T的碱基突变，部分测序峰图如图2所示；

2、对标记性状进行关联分析

本发明中牛ARHGAP26基因的扩增片段序列C₂₃₃T位点与牛超数排卵性状的关联分析结果表明，此位点不同基因型所对应的个体的超数排卵性状中头均可用胚胎数和头均总数存在显著或极显著的差异，即该位点遗传多态性对牛超数排卵效果的影响。因此，本发明为将该位点作为牛繁殖和生产性能辅助选择的分子标记并应用于遗传改良提供了重要的理论依据并具有良好的应用前景。

附图说明

图1是ARHGAP26基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-8泳道为随机检测的8个PCR产物，在645bp位置具有明显而特异性的条带；

图2是三种基因型个体PCR产物的测序峰图。箭头所指位置为C₂₃₃T突变位点。CC型个体C₂₃₃T位点为C碱基；CT型个体C₂₃₃T位点为C/T碱基；TT型个体C₂₃₃T位点为T碱基；

图3是实施例1中ARHGAP26基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-6泳道为随机检测的6个PCR产物，在645bp位置具有明显而特异性的条带；

图4是实施例三种基因型个体PCR产物的测序峰图。箭头所指位置为C₂₃₃T突变位点。CC型个体C₂₃₃T位点为C碱基；CT型个体C₂₃₃T位点为C/T碱基；TT型个体C₂₃₃T位点为T碱基。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，用具体实施方式详细描述具体内容：

本发明以提取的牛基因组DNA为模板，设计特异性引物一对，克隆牛ARHGAP26基因的部分DNA序列，通过测序及基因型分型并将不同基因型与超数排卵性状进行关联分析，为牛的标记辅助选择提供分子标记。

一、牛ARHGAP26基因部分DNA片段的克隆

利用Oligo6.0软件设计特异性引物1对，为保证良好的引物质量，在本发明中，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增产物长度为645bp，引物序列如下所示：

正向引物：ARHGAP26-F: 5’- ACCGTGGAGAAAGTGGATAAA -3’；

反向引物：ARHGAP26-R: 5’- GAATCCCAGACTCAGCCTACAA -3’；

PCR反应过程中所需要的Taq酶、Buffer、镁离子、dNTP等可自行选择。为较快地获得良好的结果，本发明选择Takara公司的2×Premix Taq ^TM PCR反应预混液进行PCR扩增。具体反应体系为：2×Premix Taq ^TM（产品包装盒内提供）10.0μl,正向引物与反向引物（浓度为均为10pmol/μl）各0.5μl,基因组DNA 0.5μl(含10-50ngDNA)，二馏水8.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃最后延伸5分钟；

二、PCR产物序列测定及基因型的判定

用引物ARHGAP26-F和ARHGAP26-R扩增牛基因组DNA得到645bp的特异扩增片段（图1及SEQ ID NO:1）。测序结果发现，在该645bp片段中，由于C₂₃₃T处存在C→T的突变，导致不同基因型CC型、CT型和TT型的产生，其中，CC型个体C₂₃₃T位点为C碱基纯合体；CT型个体C₂₃₃T位点为C/T杂合型个体；TT型个体C₂₃₃T位点为T碱基纯合体（图2）；

三、标记性状关联分析

利用申请人所拥有的实验群体为实验对象进行性状关联分析，使用SPSS22.0软件的One-Way ANOVA过程，建立如下模型进行性状关联分析：

统计分析模型为：Y_ij=μ+G_i+e_j。其中，Y_ij为被观测个体的生产性能表型值；μ为生产性能的最小二乘均值；G_i为基因型对生产性能的效应值；e_j为对应于观察值的随机残差。

本发明中牛ARHGAP26基因的扩增序列C₂₃₃T多态位点与牛超数排卵性状的关联分析表明，在随机选取的149个体中，CC型个体有87个，CT型个体有43个，TT型个体有19个。拥有不同基因型个体的头均可用胚胎数、头均总胚胎数之间显著差异分析结果（最小二乘均值±标准差）见表1。

表1 不同基因型个体超数排卵性状之间显著差异分析结果

超数排卵性状	CC型个体	CT型个体	TT型个体
				头均可用胚胎数	4.42 ± 2.73<sup>a</sup>	6.81 ± 4.22<sup>b</sup>	10.31 ± 4.09<sup>c</sup>
头均总胚胎数	6.73 ± 3.94<sup>a</sup>	10.81 ± 6.62<sup>b</sup>	16.29 ± 8.37<sup>c</sup>

注：不同组数据肩标带有不同字母表示差异显著（P<0.05）。头均可用胚胎数=多次超排处理共获得的总可用胚胎数/超排处理次数；头均总胚胎数=多次超排处理共获得的总胚胎数/超排处理次数。

分析结果表明，此SNP位点不同基因型所对应的个体的超数排卵性状存在显著或极显著的差异。总体来说，TT型个体的超数排卵效果普遍优于CC型个体，用于选择超数排卵供体时，应优先选择TT型个体，而尽量不选择CC型个体。

实施例1

在河北天和肉牛养殖有限公司的待超排母牛群体中随机选定62个待测个体，采集血液进行基因组DNA提取并利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。取Takara公司的2×Premix Taq ^TM PCR反应预混液进行PCR扩增。具体反应体系为：2×Premix Taq ^TM10.0μl,正向引物与反向引物（浓度为均为10pmol/μl）各0.5μl,基因组DNA 0.5μl(含32ngDNA)，二馏水8.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃最后延伸5分钟。

扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图3、图4所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-6为随机抽取的被检测的PCR产物，在645bp位置具有明显而特异性的条带。将所有PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，结果表明，在所检的所有个体中，22个个体属于CC型；32个个体属于CT型；8个个体属于TT型。

结合这62个个体超数排卵相关记录，以相应数据进行关联分析，利用SPSS22.0软件One-Way ANOVA过程，Y_ij=μ+G_i+e_j。其中，Y_ij为被观测个体的生产性能表型值；μ为生产性能的最小二乘均值；G_i为基因型对生产性能的效应值；e_j为对应于观察值的随机残差。

在此62个个体中，不同基因型与超数排卵性状中头均可用胚胎数、头均总胚胎数之间关联分析结果（最小二乘值和标准差）见表2。

表2 不同基因型个体之间超数排卵性状显著差异分析结果

超数排卵性状	CC型个体	CT型个体	TT型个体
				头均可用胚胎数	4.72 ± 2.11<sup>A</sup>	7.59 ± 4.28<sup>B</sup>	11.13 ± 0.59<sup>C</sup>
头均总胚胎数	7.17 ± 2.62<sup>a</sup>	11.97 ± 6.80<sup>b</sup>	16.91 ± 3.31<sup>c</sup>

注：不同组数据肩标带有不同字母表示差异显著（P<0.05）；带有不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

分析结果表明，此位点不同基因型所对应的个体，其超数排卵性状存在显著或极显著的差异，TT型个体的超数排卵性状优于CT型和CC型。

序列表

<110> 吉林大学

<120> ARHGAP26作为牛超数排卵性状分子标记的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 1

accgtggaga aagtggataa aaactggact gaaaagaaga acatcaaaga gtatctgtcc 60

cctcgtaaac ccctggcagc tctagaggct gtcagcactg agatgagaaa aactcttctg 120

tggtaccttc tgtaagaata aagcatttgt ttatgacaac tgtccaggga attttctttt 180

ttacagtaat ggctaccatt ttctcattgt ggcccagtcc catgatcact ggtgatgaag 240

gagataaatg gatatgatga gttgtcactt ttcagatttc attttgattc tagtcttatt 300

ttcggtgtat cctttaacag agctatacgc agtcaaaatg atttaacttg tttaaggttt 360

ggttaccctt tgttttttct gtccttaatt ttagtggaaa aggctcatga gaattgaaat 420

tgctgaggtc tggtatagaa tggaagagag gaagaacaat tatatttatc agttgaagtg 480

gttctagagt gttttatggt ttgaagtttc tcagttttat tgatggagaa gtagatattg 540

gaaagcattt tttttaacag ccttattgag atataattca gttaccagag cattggagtt 600

agctcagggg acacctgaat agattgtagg ctgagtctgg gattc 645

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

accgtggaga aagtggataa a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gaatcccaga ctcagcctac aa 22

Claims (4)

1.一种与牛超数排卵性状相关的分子标记ARHGAP26基因片段，其特征在于：

该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在233位有一个C-T碱基的突变，导致牛超数排卵性状出现差异。

2.一对用于鉴定牛ARHGAP26基因片段的特异性引物，其特征在于，引物的序列如下：

正向引物：ARHGAP26-F: 5’- ACCGTGGAGAAAGTGGATAAA -3’；

反向引物：ARHGAP26-R: 5’- GAATCCCAGACTCAGCCTACAA -3’；

提取牛的基因组DNA，进行PCR扩增，获得ARHGAP26基因片段的DNA序列，如序列表SEQID NO:1；序列测定结果表明不同个体的该基因片段第233位存在C-T碱基突变，会导致三种基因型的产生；将检测结果所示的不同基因型与牛超数排卵性状关联分析，具备特定的基因型的个体将获得更好超数排卵效果。

3.如权利要求1所述一种与牛超数排卵性状相关的分子标记ARHGAP26基因片段在牛超数排卵性状标记辅助选择中的应用。

4.如权利要求2所述的一对用于鉴定牛ARHGAP26基因片段的特异性引物在牛超数排卵性状标记辅助选择中的应用。