CN116769891A - 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的snp标记及其引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记及其引物和应用，所述SNP标记为P9655，SNP标记为SEQ ID NO:1所示序列自5’端起第290位碱基为A/G，所述SNPs标记为AG基因型的个体为雌性中华鳖，SNP标记为AA基因型的个体为雄性中华鳖。本发明所述的分子标记的应用可解决中华鳖在性腺发育成熟之前，其性别通过肉眼难以准确、稳定判别的问题，可用于单性苗种培育，有助于中华鳖单性育种研究的开展。本发明所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其仅需对1个SNP位点进行鉴定即可快速、准确确认性别，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记及其引物和应用。
背景技术
雌性中华鳖在保护和育种方面具有重要的经济价值，而雄性中华鳖生长速度更快，肉质更佳，具有更好的食用价值，因此进行性别决定与分化机制相关的研究对中华鳖水产养殖和单性育种具有重要意义。然而现有的常规技术主要通过对中华鳖外形进行生理性别的鉴定，在中华鳖规格较小或外形特征不明显时，无法进行准确鉴定，且中华鳖群体中同时存在未性逆转个体和性逆转个体，通过外形鉴定无法获得真正的遗传性别。
现有技术对中华鳖的性别鉴定进行了广泛的研究，其中性别分子标记是研究的热点。公开号为CN 108841945 B的中国专利公开了一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物、方法及试剂盒，其开发了一对特殊的的PCR扩增引物，通过PCR扩增后，将PCR产物进行电泳检测，在500-600bp之间显示出一条单一的亮带，判定为雌性，反之则判定为雄性。在性别分子标记研究当中，SNP是极具优越性的新一代分子标记技术，具有数量多，遗传稳定性好，检测简便等优点，在水产动物性别特异性分子标记开发领域的应用十分广泛。公开号为CN 114990233 A的中国专利公开了一种中华鳖遗传性别相关的SNPs标记及其引物和应用，其提到通过六个不同的SNPs标记，从而鉴定中华鳖的性别，公开号为CN 115232882A的中国专利公开了一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和应用，其公开了通过三个不同的SNPs标记，从而鉴定中华鳖的性别。这些方法成为中华鳖性别鉴定的重要手段，极大提升了中华鳖鉴定的效率，然而这些技术存在的问题是标记位点较多，且在实际分子标记开发过程中存在一定的不确定性，部分个体难以获得正常扩增。因此，找到更多的中华鳖性别决定关键基因以及特异的性别分子标记在中华鳖的水产养殖中具有重要的实践意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明所解决的技术问题在于提供一种快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记。
本发明提出了所述的SNP标记的引物及其在中华鳖性别鉴定中的应用。
本发明提出了一种快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其仅需对该一个SNP位点进行鉴定即可确认中华鳖性别，操作简便，准确度高。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记，所述SNP标记为P9655，SNP标记为SEQID NO:1所示序列自5’端起第290位碱基为A/G。
进一步地，所述SNPs标记为AG基因型的个体为雌性中华鳖，SNP标记为AA基因型的个体为雄性中华鳖。
根据所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记的引物，所述引物包括如SEQ IDNO:2所示的正向引物(9655-F)、如SEQ ID NO:3所示的反向引物(9655-R)以及如SEQ IDNO:4所示的和SNP标记特异性引物(9655-FT)。所述SNP标记特异性引物(9655-FT)的3’端碱基为G，且在倒数第三位碱基引入人为错配，提高该引物与雌性模板的特异性结合效率。
所述的引物在鉴定中华鳖遗传性别中的应用。
一种用于快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物。
一种快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其特征在于，通过所述的SNP标记进行中华鳖的遗传性别鉴定。
进一步地，快速鉴定中华鳖遗传性别的方法包括如下步骤：提取中华鳖基因组DNA；将待测中华鳖的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据PCR扩增条带的数目及大小来确定中华鳖的遗传性别。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μL；正向引物0.5μL；反向引物0.5μL；SNP标记特异性引物0.5μL；TaqPCRMix 12.5μL；灭菌水补至25μL。该扩增体系中，引物用量控制极为重要，当正向引物、反向引物及SNP标记特异性引物的用量及比例设置不当，则在雄性个体中会产生非特异性条带，从而影响测试结果的准确性。
进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min后进行30个循环，然后72℃继续延伸7min；其中30个循环包括：94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，15个循环。
进一步地，若所述PCR扩增条带为大小分别为713bp和424bp的两条条带，则中华鳖为雌性；若所述PCR扩增条带为大小424bp的一条条带时，则中华鳖为雄性。
有益效果：本发明所述的一种快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记，所述SNP标记为P9655，该分子标记的应用可解决中华鳖在性腺发育成熟之前，其性别通过肉眼难以准确、稳定判别的问题，可用于单性苗种培育，有助于中华鳖单性育种研究的开展。
本发明所述的SNP标记的引物和试剂盒，该引物和试剂盒可应用于对中华鳖早期遗传性别进行鉴定，从而对中华鳖的性别进行准确、高效的筛分。
本发明所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，不受年龄、样本限制，成本低、操作简便、可进行大批量鉴定，鉴别快速、结果直观，准确度高，其仅需对1个SNP位点进行鉴定即可确认性别，不仅能快速准确的鉴定中华鳖遗传性别，还可为顺利开展中华鳖的性别控制育种工作、发展单性养殖提供可靠的技术手段，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明提出的中华鳖雌性个体特异SNP位点与引物设计示意图；
图2为4只雌性中华鳖和4只雄性中华鳖所示SNP位点的测序峰图(图中方框标识为SNP位点)；
图3为中华鳖遗传性别鉴定电泳结果图(M1-M12为雄性个体，F1-F12为雌性个体)。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1
一种快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记，所述SNP标记为P9655。本发明所述的SNP位点基于全基因组重测序数据筛选分析而得到。中华鳖是二倍体生物且为ZW/ZZ型性别决定系统，雌性是ZW，雄性是ZZ。对性别相关SNP位点进行过滤，过滤标准如下：(1)过滤掉多种基因型的SNP位点；(2)过滤掉支持度小于4的SNP位点；(3)随后筛选在雌性混池中均为杂合(2个等位基因支持的reads数的比例等于或接近1∶1)而在雄性混池中均为纯合或接近纯合(等位基因分离比偏离1∶0的概率小于0.001)的位点，并对候选SNP位点进行分析和注释。
通过对中华鳖雌雄混合池(3个雌鳖混合池和3个雄鳖混合池)全基因组重测序数据分析筛选，得到所述的SNP位点。SNP标记为SEQ ID NO:1所示序列自5’端起第290位碱基为A/G，当所述SNPs标记为AG基因型的个体为雌性中华鳖，SNP标记为AA基因型的个体为雄性中华鳖。
其中SEQ ID NO:1所示序列为:
atgggcaggg aggtgtgaat gggggtgctc aagaccttct ggaaagtccaggaggcatttctaaatgaag tgcttcgacttttgggaatc caggctgcaa atcctggctagcaggtctggctgtgaccgt gggttctcac tctcccagct gctttgcctt tgacatacaggcctgtgggtgagtcccctg tgccataaaa caaacctccc ccacccaccc accattaccaaccgggggcatgatttgtgg caagctgagt cagcggtgtt ttctctcgggctcttttggttgcataggaacttgggcaaa agggtgaaaa ccactgacgg tttcccctcc ccctctttgcttctgttttccttttccagg acctggccat gtctcccttc ggaagcttcttcccctatccctatacctacctccgcagcc accagctcgg tgcaccggcatcctttcctc agcgcagtgcgcccccgactgaggtacagc ccctactcca tacctgtgcc cctgccagac agcagcagcctcctgaccactgctctcccc agcgtggcca gcagcacagg ggaaggcaaatcgagcaacatggcagagtccgtagctttg gactctggct cagaactcaa cagcaggtcc tccactctct cctcgggatccgtgtccttgtcccctaaac tctgctctga aaaggaagcg accagcgaac tgc。
实施例2
快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记的引物，其基于所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记进行设计，所述SNP标记为P9655，SNP标记为SEQ ID NO:1所示序列自5’端起第290位碱基为A/G。
所述引物针对SNP位点的侧翼序列设计，包括如SEQ ID NO:2所示的正向引物(9655-F)、如SEQ ID NO:3所示的反向引物(9655-R)以及如SEQ ID NO:4所示的和SNP标记特异性引物(9655-FT)。引物设计如图1所示，其中9655-FT的3’末端碱基与SNP位点P9655重合，在3’倒数第三位引入人为错配，提高引物的特异性，配合9655-F和9655-R进行AS-PCR扩增，从而达到区分性别的目的。
9655-F：ATGGGCAGGGAGGTGTGAATGG；
9655-R：GCAGTTCGCTGGTCGCTTCCTT；
9655-FT：TTGCATAGGAACTTGGGCAAACGG。
所述的SNP标记及引物在鉴定中华鳖遗传性别中的应用，比如快速鉴定中华鳖遗传性别的鉴定产品以及分析产品中的应用。
一种用于快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物，从而可对中华鳖遗传性别进行快速鉴定。
实施例3
一种快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，包括如下步骤：
剪取中华鳖的裙边，放入95％的酒精溶液中，-20℃保存；利用DNA提取试剂盒分别提取基因组DNA，用EB洗脱液将浓度稀释成50ng/μL左右备用；
将待测中华鳖的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物:其中PCR反应体系为：DNA模板1μL；9655-F 0.5μL；9655-R 0.5μL；9655-FT 0.5μL；Taq PCR Mix 12.5μL；灭菌水补至25μL。
所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min后进行30个循环，然后72℃继续延伸7min；其中30个循环包括：94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，15个循环。
对所述PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，0.5V/cm电泳45min。根据PCR扩增条带的数目及大小来确定中华鳖的遗传性别，若所述PCR扩增条带为大小分别为713bp和424bp的两条条带，则中华鳖为雌性；若所述PCR扩增条带为大小424bp的一条条带时，则中华鳖为雄性。
采用上述方法，对多个经解剖确认性别的中华鳖(雌雄各半)的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增结束后，各取5μL产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察结果，并将PCR产物进行Sanger测序。测序结果如图2所示，4只雌性中华鳖在本发明所述的位点的基因型全部为杂合型，4只雄性中华鳖在该位点全部表现为纯合型。
进一步的，采用上述方法对鉴定结果的准确度进行验证，随机提取24只已知性别的中华鳖个体(雌雄各半)的DNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，0.5V/cm电泳45min。结果如图2所示，结果表明在所检测的雌性个体中均扩增出两条特异条带(713bp和424bp)，而在所检测的雄性个体中均只能扩出一条条带(424bp)，且扩大试验后结果同样精准、稳定，本发明所述的方法仅用所述的单标记位点即可对中华鳖的性别进行快速鉴定，适合推广应用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为P9655，SNP标记为SEQ ID NO:1所示序列自5’端起第290位碱基为A/G。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记，其特征在于，所述SNPs标记为AG基因型的个体为雌性中华鳖，SNP标记为AA基因型的个体为雄性中华鳖。
3.根据权利要求1～2任一所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的SNP标记的引物，其特征在于，所述引物包括如SEQ ID NO:2所示的正向引物(9655-F)、如SEQ ID NO:3所示的反向引物(9655-R)以及如SEQ ID NO:4所示的和SNP标记特异性引物(9655-FT)。
4.根据权利要求3所述的引物在鉴定中华鳖遗传性别中的应用。
5.一种用于快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3所述的引物。
6.一种快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其特征在于，通过如权利要求1～2任一所述的SNP标记进行中华鳖的遗传性别鉴定。
7.根据权利要求6所示的快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取中华鳖基因组DNA；将待测中华鳖的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据PCR扩增条带的数目及大小来确定中华鳖的遗传性别。
8.根据权利要求7所示的快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μL；正向引物0.5μL；反向引物0.5μL；SNP标记特异性引物0.5μL；Taq PCR Mix 12.5μL；灭菌水补至25μL。
9.根据权利要求7所示的快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min后进行30个循环，然后72℃继续延伸7min；其中30个循环包括：94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，15个循环。
10.根据权利要求7所示的快速鉴定中华鳖遗传性别的方法，其特征在于，若所述PCR扩增条带为大小分别为713bp和424bp的两条条带，则中华鳖为雌性；若所述PCR扩增条带为大小424bp的一条条带时，则中华鳖为雄性。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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