CN117925859B - 一种与鸽淡色羽性状相关的分子标记特异性引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸽淡色羽性状相关的分子标记特异性引物及其应用，属于生物技术领域。本发明通过分子标记检测鸽子的淡色羽性状的基因型，其有益效果：有效快速地确定所需鸽子的基因型，为鸽子高效育种提供新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸽淡色羽性状相关的分子标记特异性引物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
单核苷酸多态性（SNP），是指在基因组上单个核苷酸的变异，在遗传物质传递过程中可以稳定遗传给后代，可以作为分子标记进行辅助育种。
羽毛是鸟类特有的一种皮肤衍生物，在进化过程中产生了十分丰富的颜色表型。鸽子的羽色可以分为有色羽和白羽两大类，其中有色羽包括银（国外又称棕）羽、灰（国外又称蓝）羽、灰红羽、红羽四种基本羽色。在这些羽色基础上，还存在其它基因会影响色素的合成与分布，从而产生了如雨点（Checker）、二线（Bar）、淡色（Faded）等丰富多样的衍生羽色表型。
鸽子淡色羽色表型存在于泰深鸽（Texon，也称泰森鸽、泰克森鸽等）品种或群体中，鸽子淡色羽基因（Faded）已经通过杂交实验被定位到Z染色体上，该基因突变后会导致鸽子的羽色在原有基础上出现不同程度的淡化，突变型的淡色羽色相对于野生型的非淡色羽色是单基因控制的显性性状，并且存在剂量效应，野生型非淡色羽等位基因用f或Zf表示，突变型淡色羽等位基因用F或ZF表示。f/f基因型的纯合公鸽（Zf/Zf）或f/.基因型的母鸽（Zf/W）羽色受其它位点影响，表现为有色羽或白羽等表型。F/F基因型的纯合公鸽（ZF/ZF）表现为重度淡色羽色，全身呈米白色，颈部有一圈五颜六色的羽毛。F/f基因型的杂合公鸽（ZF/Zf）或F/.基因型的母鸽（ZF/W）表现为轻度淡色羽色，全身呈浅灰色。鸽子不具有明显的外生殖器，且雏鸽过于弱小，很难使用翻肛等手段进行性别鉴定，因此通过伴性遗传的羽色等表型来进行早期雌雄自别在鸽育种具有重要意义。鸽子的羽色基因相互作用十分复杂，不同羽色鸽子杂交产生的后代很容易出现羽色杂乱的现象。淡色羽位点纯合突变型的鸽子羽色遗传和表型稳定，例如目前常见的泰深鸽，就是一个典型的利用淡色羽基因进行雌雄自别的品系。非淡色羽纯合公鸽（f/f或Zf/Zf）与淡色羽母鸽（F/.或ZF/W）杂交产生的F1代个体（ZF/Zf公鸽或Zf/W母鸽）可在出雏后10日龄前后根据羽色判断性别，进行雏鸽的早期雌雄鉴别，具有重要的育种价值。在鸽育种中，可以将非淡色羽纯合品系作为父本、淡色羽纯合品系作为母本，杂交后代通过羽色进行雌雄自别，具有重要价值。如果要将该性状和基因更好地应用到育种工作中，但是目前缺少利用分子标记来准确鉴定淡色羽性状的基因型，进而实现精确快速检测的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种与鸽淡色羽性状相关的分子标记特异性引物及其应用，快速鉴定鸽子的淡色羽性状的基因型，提高育种工作效率。
本发明通过以下技术方案解决技术问题：首先提供一种与鸽淡色羽性状相关的分子标记特异性引物对，分子标记所需鸽子DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
再提供与鸽淡色羽性状相关的分子标记特异性引物对的应用，用于淡色羽性状的分子检测。可以快速、准确鉴定个体的基因型。
进一步的，检测方法包括以下步骤，
步骤一、将待测鸽子DNA样品用DNA特异性引物进行PCR扩增，
得到扩增产物；
步骤二、对PCR产物进行Sanger测序；
步骤三、根据测序峰图判断该位点基因型，判断淡色羽性状基因型。
所述步骤一中，所述步骤一中，待测鸽子DNA样品中含有经过鸽子全基因组重测序及全基因组关联分析后所得位于鸽Z染色体的22409356bp位点的SNP （参考基因组版本Cliv_NAU_1.0）。具体是选取45只泰深鸽（淡色羽）和其它110只其它羽色（非淡色羽）个体进行全基因组重测序。下机数据经过比对、排序、过滤之后得到高质量的变异信息文件，然后通过使用MLM模型进行全基因组关联分析。最终找到了一个与淡色羽性状显著关联的分子标记，位于鸽Z染色体的22409356bp位点的SNP （参考基因组版本Cliv_NAU_1.0）。
所述步骤一中，PCR扩增的反应体系以50 μl计为
待测鸽子DNA 50 ng
Accurate Taq DNA 聚合酶 1.25 IU
10X PCR反应缓冲液 (含Mg2+) 5μl
10mM dNTPs 1μl
10μM 上游引物F 1μl
10μM 下游引物R 1μl
无菌水 补足至50μl；
所述的PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸5min；20℃保存。分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述步骤三中，判断标准是SNP位点基因型为A/A，公鸽ZA/ZA个体表现为重度淡色羽色，母鸽ZA/W表现为轻度淡色羽色；SNP位点基因型为A/C，公鸽ZA/ZC个体均表现为轻度淡色羽色；SNP位点基因型为C/C，公鸽ZC/ZC或母鸽ZC/W个体表现为非淡色羽色。
本发明通过分子标记检测鸽子的淡色羽性状的基因型，其有益效果：有效快速地确定所需鸽子的基因型，为鸽子高效育种提供新的途径。
附图说明
图1是重度淡色羽色的泰深鸽纯合公鸽、轻度淡色羽色的泰深鸽纯合母鸽和非淡色羽色的银王鸽个体表型。
图2是三种基因型PCR扩增产物的Sanger测序结果。
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例
1.基因型分析
（1）实验材料
选取系谱准确，羽色表型记录清晰的泰深鸽243只，银王鸽617只，（银王公鸽x泰深母鸽）杂交F1代公鸽30只，（银王公鸽x泰深母鸽）杂交F1代母鸽30只，灰羽鸽10只，黑羽鸽10只，红羽鸽10只。鸽子的个体表型如图1所示，从左至右依次为泰深鸽（公），泰深鸽（母），银羽王鸽。以上品种鸽为市售，不再赘述。
（2）基因组DNA的提取
对待测鸽子采用翅下静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用饱和氯化钠方法提取，TE溶解之后-20℃保存。
（3）PCR扩增
以上述提取的基因组DNA为模板，对包含Z染色体的22409356bp位点的片段进行PCR扩增。
上游引物F：5’-CCCATCCTCCTCTTCTTCAGG-3’（SEQ ID NO：1）
下游引物R：5’-TGCTTTGGTGGTCTGAAACAG-3’（SEQ ID NO：2）
反应体系终浓度（50μl）为：
待测鸽子DNA 50 ng
Accurate Taq DNA 聚合酶 1.25 IU
10X PCR反应缓冲液 (含Mg2+) 5μl
10mMdNTPs 1μl
10μM上游引物F 1μl
10μM 下游引物R 1μl
无菌水 补足至50μl。
所述的PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸5min；20℃保存。扩增产物的核苷酸序列如下：CCATCCTCCTCTTCTTCAGGAAAGATAGCACAAAAACCACTTCATCACCAGTTCATGAAGCTTCAAACTTTCATCTACTACACGTTGTTGTGCTAAAATGCATTTGTCTTCTTGATGAAATATGGTGAGTTTTGTTTTGTTTTGTTGTTTAATCTAGCTAGTATATGGTCATAGTGCATTTTCTTCCTGATGTTCGTACTTATATTTTTTTAAGTTTTGAAAGCTTGTCTTGTAAGGGTGATCATTCCTCCACCAGGATAAAACACTTAACTCATTTTGTA[A/C]TAAGTTATGGAAAAAACTGTAAGATGTGGTTGGCAACTTCCATTTTGGTTACAAGATGCATAGCAGCTTACTTTACTGCATATTAGCACAATCAGTGAAAGCTGCTAGGAGTAAAGGTAATGTACGATAAATTGTCTTCTGGTACTGCTAAAAACTTTCACATTAATTATGTATGTTTAACTGACACAGCACTGTTTCAGACCACCAAAGCA。（SEQ ID NO：3）
2.测序验证
分别将各个样本的PCR产物进行Sanger测序，测序峰图如图2所示。
3.结果分析
结果如表1所示，在所检测7个群体共950个个体中（其中477只公鸽、473只母鸽），A/A或A/.基因型有243个，A/C基因型有30个，C/C或C/.基因型有677个。
公鸽（Z/Z）个体中，A/A（即ZA/ZA）基因型个体均为重度淡色羽色，A/C（即ZA/ZC）基因型个体均为轻度淡色羽色，C/C（即ZC/ZC）基因型个体均为非淡色羽色。母鸽（Z/W）个体中，A/.（即ZA/W）基因型个体均为轻度淡色羽色（与ZA/ZC杂合基因型公鸽的羽色一致），C/C（即ZC/ZC）基因型个体均为非淡色羽。结果表明鸽子Z染色体的22409356bp位点与淡色羽表型完全关联。
表1. Z染色体22409356bp位点不同基因型与淡色羽性状的相关性分析
除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种与鸽淡色羽性状相关的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记位点位于参考基因组版本Cliv_NAU_1.0的鸽Z染色体的22409356bp，存在A/C多态性，所述SNP分子标记所需鸽子DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述与鸽淡色羽性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：用于淡色羽性状的分子检测。
3.根据权利要求2所述与鸽淡色羽性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：检测方法包括以下步骤，
步骤一、将待测鸽子DNA样品用DNA特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；所述待测鸽子DNA样品中含有经过鸽子全基因组重测序及全基因组关联分析后所得位于鸽Z染色体的22409356bp位点的SNP；
步骤二、对PCR产物进行Sanger测序；
步骤三、根据测序峰图判断22409356bp位点基因型，判断淡色羽性状基因型。
4.根据权利要求3所述与鸽淡色羽性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：所述步骤一中，PCR扩增的反应体系以50 μl计为
待测鸽子DNA 50 ng
Accurate Taq DNA 聚合酶 1.25 IU
含Mg2+的10X PCR反应缓冲液 5μl
10mM dNTPs 1μl
10μM 上游引物F 1μl
10μM 下游引物R 1μl
无菌水 补足至50μl；
所述的PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸5min；20℃保存。
5.根据权利要求4所述与鸽淡色羽性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：SNP分子标记所需鸽子DNA特异性引物对扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
6.根据权利要求3所述与鸽淡色羽性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：所述步骤三中，判断标准是SNP位点基因型为A/A，公鸽ZA/ZA个体表现为重度淡色羽色，母鸽ZA/W表现为轻度淡色羽色；SNP位点基因型为A/C，公鸽ZA/ZC个体均表现为轻度淡色羽色；SNP位点基因型为C/C，公鸽ZC/ZC或母鸽ZC/W个体表现为非淡色羽色。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |