CN113832239B - 牛mc1r基因型快速鉴定方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：先通过牛MC1R基因的PCR扩增产物进行sanger测序确定牛不同毛色的基因型；然后对牛MC1R基因编码区c.296T>C位点和c.310delG位点同时进行PCR扩增并结合高分辨率熔解曲线方法（High‑resolution melting，简称HRM）完成牛毛色基因型鉴定。本发明可在一次PCR扩增的情况下利用MC1R基因编码区c.296T>C位点和c.310delG位点并结合HRM方法达到对牛毛色基因型的准确区分，过程简捷，准确率高达100%，突破了肉牛传统育种方法无法实现的毛色基因型鉴定技术，极大的缩短毛色提纯时间，在牛毛色的分子遗传标记辅助育种中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于动物遗传育种技术领域，尤其涉及一种牛MC1R基因型的鉴定与应用方法。
背景技术
在牛杂交育种过程中，如果利用黑毛品种对本地黄牛杂交改良，在利用杂交个体进行横交固定选育新品种过程中，将出现毛色性状分离现象。由于黑毛对黄毛是显性，因此横交固定后代中黑毛个体的基因型可能是黑毛纯合或黑毛杂合，后续群体选育过程中如果黑毛杂合个体与黑毛杂合个体交配则会有25%的概率出现黄毛个体。如果不对黑毛杂合个体进行剔除，选育群体容易出现黄毛个体，群体毛色提纯困难。由于牛繁殖周期长且为单胎动物，传统测交方法无法应用于牛的毛色基因型鉴定过程。因此，迫切需要采用分子遗传标记技术对毛色进行黑毛纯合基因型鉴定。
ED，E+，e三种位点分别控制牛毛色呈显性黑色（dominant black）、隐性黑色（recessive black）和红色（纯合基因型，red），三者显隐性关系为ED>E+>e。前期的分子遗传学认为MC1R基因的c.296T>C位点T等位基因控制E+，C等位基因控制ED（Joerg et al.1996），c.310delG位点缺失G碱基等位基因控制e（Klungland et al. 1995）。已有研究方法主要采用PCR-RFLP法进行MC1R位点基因型鉴定，其基本原理是：限制性内切酶MspA1可以识别CA/CGCG/TG序列，当c.296T>C位点为C碱基时该位点形成了CCGCTG可被MspA1的识别序列；限制性内切酶MspⅠ识别CCGG序列，当310位点缺失G碱基后无法被MspⅠ识别。通过对两个位点分别进行PCR-RFLP检测后，可以实现对c.296T>C位点和c.310delG位点基因型检测。多篇文献利用该PCR-RFLP策略对日本和牛、韩牛、中国黑白花奶牛、中国红白花奶牛、渤海黑牛进行毛色基因型鉴定（Sasazaki et al. 2005；Gan et al. 2007；Matsumoto et al.2020）。在此过程中，通常利用2对引物分别对c.296T>C位点和c.310delG位点进行PCR扩增，随后分别利用限制性内切酶MspA1和MspⅠ对c.296T>C位点和c.310delG位点的PCR产物进行酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳根据酶切片段大小进行基因型区分。该方法相对比较繁琐和复杂，耗时也比较长。同时凝胶电泳时添加的核酸染料（如溴化乙锭，EB）对人体有一定的毒性作用。此外，由于对两个位点独立分开来定义ED，E+，e位点，当这两个位点都处于杂合状态时，容易误判基因型，这也可能是已有两篇文献中都出现E+/e存在与黑毛个体、红毛/黄毛个体中（Sasazaki et al. 2005；Gan et al. 2007）。因此，对牛毛色的遗传选育，迫切需要更快捷、安全且准确的区分基因型的新型分子遗传标记技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、准确率高的牛MC1R基因区分牛毛色的鉴定方法及其应用。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：先通过牛MC1R基因的PCR扩增产物进行sanger测序确定牛不同毛色的基因型；然后对牛MC1R基因编码区c.296T>C位点和c.310delG位点同时进行PCR扩增并结合高分辨率熔解曲线方法（High-resolutionmelting，简称HRM）完成牛毛色基因型鉴定。
进一步的，上述牛MC1R基因的PCR扩增方法采用的引物为MC1R-F：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， MC1R-R：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示； 其反应体系为20μl：10μl2xTaq PCR Master Mix（市售产品），6.4μl ddH2O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl；反应程序：95℃变性3min，95℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min。
上述牛不同毛色的基因型采用c.296T>C位点和c.310delG位点组成的单倍型来定义，具体为：黑毛纯合个体基因型EDED（CG/CG），黑毛杂合个体基因型EDE+（CG/TG）和EDe（CG/T-）；横交固定后代黄毛个体基因型E+e（TG/T-）和ee（T-/T-）；纯种本地黄牛基因型ee（T-/T-）。
为了进一步提高牛毛色基因型鉴定的方便性和准确率，上述对牛MC1R基因编码区c.296T>C位点和c.310delG位点同时进行PCR扩增过程采用的引物为HRM-F：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示， HRM-R：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
进一步，上述高分辨率熔解曲线方法具体是采用上述引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行高分辨熔解曲线分析。
进一步的，上述PCR扩增采用的反应体系为10μl：5μl Precision Melt Supermix（市售产品），上下游引物各0.5μl，DNA模板4μl；其反应程序：95℃变性3min，95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
进一步的，上述对PCR产物进行高分辨熔解曲线分析的反应程序为95℃ 30s，随后从65℃开始每次10s，按0.2℃温度递增开始进行熔解曲线分析，温度递增到95℃完成熔解曲线分析。
结合牛不同毛色基因单倍型和HRM方法得到的溶解曲线，从而达到对牛毛色基因型的准确区分。
采用上述牛MC1R基因型鉴定方法的试剂盒，其特征在于，该试剂盒原料包括：上述HRM引物，牛不同毛色基因型的标准品：黑毛纯合个体基因型EDED（CG/CG），黑毛杂合个体基因型EDE+（CG/TG）和EDe（CG/T-）；横交固定后代黄毛个体基因型E+e（TG/T-）和ee（T-/T-）；纯种本地黄牛基因型ee（T-/T-）；饱和荧光染料和DNA聚合酶的预混液，ddH2O。
本发明具有如下有益效果：
针对本发明采用的两个目标位点的核苷酸组成情况，本发明创造性的将两个位点同时进行PCR扩增，从而使得DNA序列的熔解温度具有显著差异，能有效的使用HRM方法，最终实现简便、高效的鉴定牛毛色基因型。同时通过大量试验，本发明各步骤与引物等的合理配合，能够对两个位点同时进行特异性扩增，增加了熔解曲线的峰值的单一性，从而实现精准的对每个曲线代表的基因型进行定义，不会出现杂峰来混淆判断。
本发明以MC1R作为控制牛毛色的主效基因，利用MC1R基因编码区c.296T>C位点和c.310delG位点组成的单倍型来定义ED（CG），E+（TG），e（T-）位点，由单倍型组合作为区分毛色基因型的标准，并基于高分辨率熔解曲线技术（High-resolution melting，简称HRM）实现一次PCR闭管性完成对牛毛色基因型鉴定。过程简捷，准确率高达100%，实现快速、准确、高通量的鉴定区分黑毛纯合个体和黑毛杂合个体，突破了牛传统育种方法无法实现的毛色基因型鉴定技术，极大的缩短毛色提纯时间，在牛毛色的分子遗传标记辅助育种中具有良好的应用前景。
附图说明
图1：本发明不同基因型的熔解温度值（Tm）。
图2：本发明均一化的不同基因型熔解曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
一种牛MC1R基因型的鉴定与应用方法：
步骤1：获取牛血液或组织样本，进行DNA提取。
取牛血（200µL）或组织（30mg），基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取。
步骤2：根据牛MC1R基因遗传变异位点确定控制毛色的单倍型。
根据牛MC1R基因序列，先设计扩增MC1R编码区全长引物MC1R-F：核苷酸序列如SEQID No.1所示，MC1R-R：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。PCR反应体系为20μl：10μl 2xTaqPCR Master Mix（含有DNA聚合酶，buffer，dNTPs等），6.4μl ddH2O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl。反应程序：95℃变性3min，95℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min。电泳条件：将2.5%的EB琼脂糖凝胶放入电泳缓冲液中，用180V的电压电泳20min。PCR产物为1142bp。PCR扩增产物送测序公司采用Sanger法测序。在所测定个体共鉴定到8个SNP。
为筛选出控制牛黑毛与非黑毛的主效位点，选择以下特定类型个体进行MC1R基因遗传变异分析：（1）根据遗传规律，黑安格斯牛与本地黄牛杂交F1代牛为黑毛杂合个体（n=10）；（2）根据系谱信息，黑安格斯牛对本地黄牛级进杂交的横交固定后代中，如果出现黄毛后代，则产生该黄毛后代的父母本都为黑毛杂合个体（n=10）；（3）黑毛公牛与10头黑毛母牛交配，如果任一后代出现黄毛个体则公牛为黑毛杂合个体（n=5），如任一后代都为黑毛个体则判定该公牛为黑毛纯合个体（n=3）；（4）纯种本地黄牛（n=10）；（5）横交固定所产生的黄毛个体（n=5）。
结合以上个体的表型及预测基因型，确定c.296T>C位点和c.310delG位点是控制黑毛与非黑毛的致因位点，并且发现利用c.296T>C位点和c.310delG位点组成的单倍型来定义ED（CG），E+（TG），e（T-）位点时，横交固定后代黑毛个体中，黑毛纯合个体基因型表现为EDED（CG/CG），黑毛杂合个体基因型为EDE+（CG/TG）和EDe（CG/T-）；横交固定后代黄毛个体基因型表现为E+e（TG/T-）和ee（T-/T-）；纯种本地黄牛为ee（T-/T-）基因型。因此，ED（CG）对E+（TG）和e（T-）完全显性；E+（TG）是隐性黑色位点，只有E+E+才表现为黑色，E+e杂合基因型时为黄色；利用c.296T>C位点和c.310delG位点组成的单倍型进行基因型鉴定更为准确。
步骤3：根据牛MC1R基因单倍型进行高分辨率熔解曲线分析。
为实现一次性闭管PCR实现对c.296T>C位点和c.310delG位点组成的单倍型的同时检测，采用高分辨率熔解曲线（HRM）技术进行基因型鉴定。在c.296T>C位点和c.310delG位点上下游设计HRM引物，HRM-F：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，HRM-R：核苷酸序列如SEQID No.4所示。利用饱和荧光染料在具备HRM分析功能的荧光定量PCR仪进行PCR并对产物进行高分辨熔解曲线分析。经优化条件，HRM分析PCR反应体系为10μl：5μl Precision MeltSupermix（含有DNA聚合酶，buffer，dNTPs，饱和染料EvaGreen等），上下游引物各0.5μl，DNA模板4μl。PCR反应程序：95℃变性3min，95℃变性10s，60℃退火30s（该步骤检测荧光值），40个循环。PCR反应结束后，进行高分辨率熔解曲线（HRM）分析，95℃ 30s，随后从65℃开始每次10s（该步骤检测荧光值），按0.2℃温度递增开始进行熔解曲线分析，温度递增到95℃完成熔解曲线分析。本技术用的HRM分析PCR仪为AriaMx实时PCR仪。
HRM基因分型原理是利用饱和染料（如EvaGreen）进行PCR扩增和熔解曲线分析时，在双链DNA升温解链时，饱和染料从双链上脱落，荧光信号同步减弱，不同基因型的PCR片段由于碱基序列不同，在具备高分辨率功能仪器上能准确区分PCR片段熔解温度（Tm）、熔解曲线的不同，最终实现基因型分型鉴定。本技术中，ED（CG），E+（TG），e（T-）三种单倍型中，ED（CG）与E+（TG）间存在T与C碱基差异，E+（TG）与e（T-）间存在G碱基插入/缺失差异，这种碱基变化将导致明显的Tm变化；ED（CG）与e（T-）间则c.296T>C位点和c.310delG位点都完全不同，所导致的Tm差异将更明显。不同单倍型组合形成基因型时，不同基因型间Tm值和熔解曲线也将不同。EDED（CG/CG）是c.296C碱基和c.310G碱基的纯合子，因此具有最高的Tm值（如图1）。相应的，不同基因型具有不同的Tm值和熔解曲线，其中EDe（CG/T-）是c.296C碱基和c.310G碱基都为杂合子，其熔解曲线表现出类似2个熔解峰。同时，可以利用仪器自带软件，以ee（T-/T-）基因型为参照对熔解曲线进行均一化处理，则不同基因型的熔解曲线如图2，EDED（CG/CG）也是明显区分于其他基因型。
本发明利用HRM对上述43个经测序验证的个体进行基因分型分析，准确率达100%。基于以上分析，我们创新性的利用HRM技术实现对牛MC1R基因c.296T>C和c.310delG位点单倍型控制毛色的基因型进行准确区分，通过一次性闭管PCR区分不同基因型，操作更准确、更简单；本技术应用于牛黑毛选育中将极大的缩短毛色提纯时间，在牛毛色的分子遗传标记辅助育种中具有良好的应用前景。
序列表
<110> 西南大学
<120> 牛MC1R基因型快速鉴定方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acatttgtcc agccagggag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttcagggat ggtctagccg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcactcccc catgtactac t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgtcgatg acattgtcca g 21
Claims (8)
1.一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：先通过牛MC1R基因的PCR扩增产物进行Sanger测序确定牛不同毛色的基因型；然后对牛MC1R基因编码区c.296T>C位点和c.310delG位点同时进行PCR扩增并结合高分辨率熔解曲线方法完成牛毛色基因型鉴定；
所述牛不同毛色的基因型采用c.296T>C位点和c.310delG位点组成的单倍型来定义，具体为：黑毛纯合个体基因型EDED（CG/CG），黑毛杂合个体基因型EDE+（CG/TG）和EDe（CG/T-）；黄毛个体基因型E+e（TG/T-）和ee（T-/T-）；纯种本地黄牛基因型ee（T-/T-）。
2.如权利要求1所述的一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：牛MC1R基因的PCR扩增采用的引物为MC1R-F：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， MC1R-R：核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
3.如权利要求2所述的一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：所属牛MC1R基因的PCR扩增采用的反应体系优选为20μl：10μl 2xTaq PCR Master Mix，6.4μl ddH2O，所述上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl；反应程序：95℃变性3min，95℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min。
4.如权利要求1所述的一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：所述对牛MC1R基因编码区c.296T>C位点和c.310delG位点同时进行PCR扩增过程采用的引物为HRM-F：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，HRM-R：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.如权利要求4所述的一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：所述高分辨率熔解曲线方法具体是采用所述引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行高分辨熔解曲线分析。
6.如权利要求5所述的一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的反应体系为10μl：5μl Precision Melt Supermix，上下游引物各0.5μl，DNA模板4μl；其反应程序：95℃变性3min，95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
7.如权利要求5所述的一种牛MC1R基因型的鉴定方法，其特征在于：所述对PCR产物进行高分辨熔解曲线分析的反应程序为95℃ 30s，随后从65℃开始每次10s，按0.2℃温度递增开始进行熔解曲线分析，温度递增到95℃完成熔解曲线分析。
8.采用如权利要求4所述牛MC1R基因型鉴定方法的试剂盒，其特征在于，该试剂盒原料包括：所述HRM引物，牛不同毛色基因型的标准品；所述牛不同毛色基因型的标准品为：黑毛纯合个体基因型EDED（CG/CG），黑毛杂合个体基因型EDE+（CG/TG）和EDe（CG/T-）；黄毛个体基因型E+e（TG/T-）和ee（T-/T-）；纯种本地黄牛基因型ee（T-/T-）。
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| 湘西黄牛毛色控制基因MC1R多态性研究;燕海峰;李志才;易康乐;张佰忠;舒鸣;朱立军;;家畜生态学报(第04期);14-20 * |
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