CN112391481B

CN112391481B - 鉴别尖塘鳢鱼种的SNPs及基于SNPs的AS-PCR引物组及其检测方法与应用

Info

Publication number: CN112391481B
Application number: CN202011292975.8A
Authority: CN
Inventors: 樊佳佳; 马冬梅; 朱华平; 林明辉; 池金泉
Original assignee: Guangzhou Ruifeng Fishery Development Co ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Guangzhou Ruifeng Fishery Development Co ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN112391481A

Abstract

本发明公开了鉴别尖塘鳢鱼种的SNPs及基于SNPs的AS‑PCR引物组及其检测方法与应用。所述SNP标记位于如SEQ ID NO.1所示序列中。本发明基于得到的SNPs位点转化成AS‑PCR标记，利用AS‑PCR鉴别三种尖塘醴，本发明中的检测方法操作简便、耗时短、成本低；而且设计得到的AS‑PCR引物组灵敏度高，P2引物在模板中可稀释到10^‑4倍，P3引物在模板中可稀释到10^‑3倍，具有极高的应用价值。

Description

鉴别尖塘鳢鱼种的SNPs及基于SNPs的AS-PCR引物组及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于动物分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及鉴别尖塘鳢鱼种的SNPs及基于SNPs的AS-PCR引物组及其检测方法与应用。

背景技术

云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmoratus)和线纹尖塘鳢(Oxyeleotrislineolatus)在分类学上均隶属于鲈形目(Perciformes)，鰕虎鱼亚目(Gobioidei)，塘鳢科(Eleotridae)，尖塘鳢属(Oxyeleotris)，均为中国从国外引进的名特优鱼类。

云斑尖塘鳢，英文名为marble goby，俗称泰国笋壳鱼，原产于泰国、越南等东南亚国家，其体表黄褐色，斑纹明显，外形美观，市场售价高，但养殖过程大吃小现象严重，影响养成成活率。线纹尖塘鳢，英文名为Sleepy cod，俗称澳洲笋壳鱼，原产于澳大利亚，生长速度较云斑尖塘鳢快，但因其体表颜色黑，外形不及云斑尖塘鳢美观，市场售价相对云斑尖塘鳢较低，但其具有性格温顺，生长速度较快、耐粗饲等优点，目前养殖的也较多。有研究表明，以云斑尖塘鳢为母本，线纹尖塘鳢为父本，杂交得到的杂交尖塘醴后代，比亲本自交后代生长速度快，表现出显著的超亲杂种优势，而且由于杂交尖塘醴生长速度快，且兼具线纹尖塘鳢耐粗饲优点，该杂交种深受养殖户的喜爱，因而大量出现在市面上。由于目前市场上云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢和杂交尖塘醴(线纹尖塘鳢♀×云斑尖塘鳢♂)均有养殖，且因为三种尖塘醴形态相似，体色会随环境改变而发生一定的改变，特别是苗期不易区分，所以仅仅从外形很难辨认出是哪种尖塘醴。

现有的鉴别云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的方法为基于线粒体COI基因设计的特异性引物，该特异性引物可在线纹尖塘鳢中扩增获得170bp的单一产物，而在云斑尖塘醴中无产物，通过PCR扩增产物的有无，可以区分两个物种。但因为线粒体属于母体遗传，杂交尖塘醴线粒体与母本云斑尖塘鳢线粒体相同，所以很难应用线粒体基因来鉴别杂交尖塘醴。

SNP作为新一代遗传标记因其遗传稳定，分布广泛且有利于发展自动化分析，目前被广泛应用于疾病检测、种质鉴定和动植物遗传育种方面。但目前尚无SNP相关技术在鉴别尖塘鳢鱼种中的应用。

因此，亟待开发出一种更为有效的检测方法，能有效鉴别云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢和杂交尖塘醴。

发明内容

本发明的目的在于提供SNP标记在尖塘鳢鱼种鉴别中的应用；

本发明的另一目的在于提供一种AS-PCR引物组；

本发明的另一目的在于提供一种试剂；

本发明的另一目的在于提供一种试剂盒；

本发明的另一目的在于提供一种鉴别尖塘鳢鱼种的AS-PCR检测方法；

本发明的另一目的在于提供上述AS-PCR引物组或上述的试剂或上述的试剂盒在尖塘鳢鱼种鉴别中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

SNP标记在尖塘鳢鱼种鉴别中的应用，该SNP标记位于如SEQ ID NO.1所示序列中；

其中，上述SEQ ID NO.1所示序列自5’端起，第77位测序峰图为单峰且碱基为G判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为G/C判定为杂交尖塘醴；和/或

第238位测序峰图为单峰且碱基为T判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为T/C判定为杂交尖塘醴；和/或

第320位测序峰图为单峰且碱基为C判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为A判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为C/A判定为杂交尖塘醴；和/或

第333位测序峰图为单峰且碱基为C判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为A判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为C/A判定为杂交尖塘醴；和/或

第345位测序峰图为单峰且碱基为C判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为T判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为C/T判定为杂交尖塘醴；和/或

第371位测序峰图为单峰且碱基为G判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为A判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为G/A判定为杂交尖塘醴；和/或

第403位测序峰图为单峰且碱基为A判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为A/C判定为杂交尖塘醴；和/或

第429位测序峰图为单峰且碱基为T判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为T/C判定为杂交尖塘醴；和/或

第449位测序峰图为单峰且碱基为T判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为A判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为T/A判定为杂交尖塘醴；和/或

第478位测序峰图为单峰且碱基为C判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为T判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为C/T判定为杂交尖塘醴；和/或

第516位测序峰图为单峰且碱基为G判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为G/C判定为杂交尖塘醴；和/或

第547位测序峰图为单峰且碱基为C判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为G判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为C/G判定为杂交尖塘醴；和/或

第563位测序峰图为单峰且碱基为C判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为G判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为C/G判定为杂交尖塘醴；和/或

第569位测序峰图为单峰且碱基为A判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为G判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为A/G判定为杂交尖塘醴；和/或

第629位测序峰图为单峰且碱基为A判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为A/C判定为杂交尖塘醴；和/或

第670位测序峰图为单峰且碱基为A判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为G判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为A/G判定为杂交尖塘醴；和/或

第674位测序峰图为单峰且碱基为C判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为A判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为C/A判定为杂交尖塘醴；和/或

第701位测序峰图为单峰且碱基为A判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为G判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为A/G判定为杂交尖塘醴；和/或

第787位测序峰图为单峰且碱基为G判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为A判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为G/A判定为杂交尖塘醴；和/或

第793位测序峰图为单峰且碱基为A判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为G判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为A/G判定为杂交尖塘醴；和/或

第822位测序峰图为单峰且碱基为T判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为T/C判定为杂交尖塘醴。SNP标记在尖塘鳢鱼种鉴别中的应用，该SNP标记位于如SEQ ID NO.1所示序列中；

寻找种间特异分子标记，是一种较简捷的鉴定种质混杂情况的有效方法，而且在活体状态下就可以鉴定种质来源，所以，本发明中筛选到种间特异性分子标记对于尖塘醴养殖和育种方向有很好的应用前景。

上述SEQ ID NO.1所示序列具体序列为：

5’-CCAGCATTACAGTGACCTCACGGATTCAAGTTTGACTTCTACCGAGCTAAACATATTTTCAAGACTTGATCCGCCACCCCCAGCAGTGGTGGACTTGACGGAGGAAGACTTGAAGGATGGCGCTGACAAGGAGGACAGTTTACCACCAGATCAGTGTCAGAAAGATGAAACAGTTACAGATCCACACCAGCAGTCTTTAAAAGCTGATTTTAAGTCACATGAAAAATCTTCAAGAAACTCAAGAAAAGTTGTTGAAACTACACAGGTTCATAATGGTCTCAAACCTGAACGGAGACTTTTAAGATCACAAAAACGACTCATAACCAAGTTATACTGCCATCGGATGTCATCAGTAGTGTTAAAGAGACTCACTTTTCTTGAAAAACATCTCAAAGAACTAAGCACATCTAAGTATACAGTCTGTTTGCCTGAGACTGGTAAGACAATGACACTGCGTCTTAAACAGAAGGACAGCAGTAGTATAACAGACTGCACAGGTGACTTGTTAAATACAACCACACTTGAAGGTCTTAAGGCCCCTATGGAGACTTCCCAGGGACAAGAAGAAGAAGAAGAAGCCATCACATTACTTGGAGAAGCTCCTCTGCCTCCATGTAGCCAAGCTGACCGTTCTGACTTAGAGCATCAAATCTCTCTCCCAGCTTCCACGCAAAACAGTGATAACTTGAATTTATCCCTGGCCATTCCCTCTCCAGCATATGCTTCTTCATCATCAGATAAAGCACAAAGTTTTCTACCAAAAGAGCTTCGTTCCTTAAGCCCTTCACTTCCGGTAGGAACGTCAACTGTCCAACCAGAGACAAATGAGTCAAGAAACAGCTCACCGGCCCAAGCTTCTACTTTTCAGTGTGAGGACATCAACTCCCTGCCAT-3’(SEQID NO.1)。

上述SNP在SEQ ID NO.1上具体体现为：

5’-CCAGCATTACAGTGACCTCACGGATTCAAGTTTGACTTCTACCGAGCTAAACATATTTTCAAGACTTGATCCGCCA(G/C)CCCCAGCAGTGGTGGACTTGACGGAGGAAGACTTGAAGGATGGCGCTGACAAGGAGGACAGTTTACCACCAGATCAGTGTCAGAAAGATGAAACAGTTACAGATCCACACCAGCAGTCTTTAAAAGCTGATTTTAAGTCACATGAAAAATCTTCAAGAAA(T/C)TCAAGAAAAGTTGTTGAAACTACACAGGTTCATAATGGTCTCAAACCTGAACGGAGACTTTTAAGATCACAAAAACGACTC(C/A)TAACCAAGTTAT(C/A)CTGCCATCGGA(C/T)GTCATCAGTAGTGTTAAAGAGACTC(G/A)CTTTTCTTGAAAAACATCTCAAAGAACTAAG(A/C)ACATCTAAGTATACAGTCTGTTTGC(C/T)TGAGACTGGTAAGACAATG(A/T)CACTGCGTCTTAAACAGAAGGACAGCAG(T/C)AGTATAACAGACTGCACAGGTGACTTGTTAAATACAA(G/C)CACACTTGAAGGTCTTAAGGCCCCTATGGA(C/G)ACTTCCCAGGGACAA(G/C)AAGAA(A/G)AAGAAGAAGCCATCACATTACTTGGAGAAGCTCCTCTGCCTCCATGTAGCCAAGCTGAC(A/C)GTTCTGACTTAGAGCATCAAATCTCTCTCCCAGCTTCCAC(A/G)CAA(C/A)ACAGTGATAACTTGAATTTATCCCTG(A/G)CCATTCCCTCTCCAGCATATGCTTCTTCATCATCAGATAAAGCACAAAGTTTTCTACCAAAAGAGCTTCGTTCCTTAAGCCCTTC(A/G)CTTCC(A/G)GTAGGAACGTCAACTGTCCAACCAGAGA(C/T)AAATGAGTCAAGAAACAGCTCACCGGCCCAAGCTTCTACTTTTCAGTGTGAGGACATCAACTCCCTGCCAT-3’。

上述21个SNP位点筛选自90个尖塘醴样本的SIMC1基因序列的扩增产物。

上述90个尖塘醴样本(云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、云斑尖塘鳢(♀)×线纹尖塘鳢(♂)杂交个体)均取自广东省广州市番禺区良种培育基地，每种尖塘醴随机取样30尾，每尾鱼剪取尾鳍用无水乙醇固定，-20℃保存备用。

上述90个尖塘醴样本的SIMC1基因序列的扩增产物是使用P1引物对对90个尖塘醴样本的SIMC1基因序列进行扩增得到的。

发明人在对云斑尖塘鳢♀×线纹尖塘鳢♂杂交鱼性腺进行转录组测序过程中，对预测到的SNPs数据进行分析，发现泛素化相互作用基序包含蛋白1(SUMO-interactingmotif-containing protein 1，SIMC1)基因SNP突变点比较多，特将该基因作为筛选特异性标记的候选基因。

SIMC1基因是一种蛋白质编码基因，属于泛素化蛋白一种，泛素化蛋白基因被视为一种重要的体内翻译后蛋白质修饰系统。发明人根据研究，推测该基因属于肌肉相关功能发育基因重要的调节蛋白，而且，发明人还发现，在杂交尖塘醴中，该基因中多个位点存在杂合型，因此推测该基因在云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢中存在多处SNPs。

上述P1引物对的具体序列为：

P1-F：5’-CCAGCATTACAGTGACCTCAC-3’(SEQ ID NO.2)；

P1-R：5’-ATGGCAGGGAGTTGATGTC-3’(SEQ ID NO.3)。

上述SIMC1基因序列的扩增体系为：

Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0plus dye)	25μL
		P1-F(10μM/L)	2μL
P1-R(10μM/L)	2μL
		尖塘醴基因组DNA	50ng
ddH<sub>2</sub>O	补充至50μL

扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸5min。

本发明的第二个方面，提供：

一种AS-PCR引物组，该AS-PCR引物的序列为：

P2-F：5’-GCCTGAGACTGGTAAGACAATG-3’(SEQ ID NO.4)；

P2-R：5’-GATGCTCTAAGTCAGAACG-3’(SEQ ID NO.5)；

P3-F：5’-AGCAGTGGTGGACTTGACGG-3’(SEQ ID NO.6)；

P3-R：5’-GATGCTCTAAGTCAGACCT-3’(SEQ ID NO.7)。

上述引物组是基于上述SEQ ID NO.1所示序列第629位碱基为A/C设计得到。

若上述位点为AA型则为云斑尖塘鳢，CC型为线纹尖塘鳢，AC为杂交种(云斑尖塘鳢♀×线纹尖塘鳢♂)。

进一步地，上述尖塘鳢鱼种包括云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、以及云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢杂交得到的杂交尖塘醴(云斑尖塘鳢♀×线纹尖塘鳢♂)。

本发明的第三个方面，提供：

一种试剂，该试剂包括上述的AS-PCR引物组。

等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)是基于PCR过程中引物3'端碱基对扩增反应的开关作用来对SNP进行检测的方法。当引物3'端存在错配时，PCR反应将无法延伸。

AS-PCR技术与其它传统方法相比，具有操作简便、耗时短、成本低等优点，主要可应用于医学疾病的检测、动植物关键基因SNP分型等。

本发明的第四个方面，提供：

一种试剂盒，该试剂盒包括上述的AS-PCR引物组或上述的试剂。

进一步地，上述试剂盒还包括PCR试剂，包括Premix Taq或其他本领域常规的PCR试剂。

本发明的第五个方面，提供：

一种鉴别尖塘鳢鱼种的AS-PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取尖塘鳢DNA作为待测样品；

(2)用上述的AS-PCR引物组中P2-F/R对上述待测样品进行扩增，得到扩增产物A；

(3)用上述的AS-PCR引物组中P3-F/R对上述待测样品进行扩增，得到扩增产物B；

(4)检测上述扩增产物A和上述扩增产物B的条带长度，判断尖塘鳢鱼种。

进一步地，上述步骤(4)中判断尖塘鳢鱼种的标准为：

(1)若上述扩增产物A含有222bp条带，上述扩增产物B不含有566bp条带，则上述尖塘鳢为线纹尖塘鳢；

(2)若上述扩增产物A不含有222bp条带，上述扩增产物B含有566bp条带，则上述尖塘鳢为云斑尖塘鳢；

(3)若上述扩增产物A含有222bp，上述扩增产物B含有566bp条带，则上述尖塘鳢为云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢杂交得到的杂交尖塘醴。

进一步地，上述步骤(2)或(3)中的扩增体系为：

Premix Taq	10μL
		10μM/L P2-F或P3-F	0.8μL
10μM/L P2-R或P3-R	0.8μL
		待测样品DNA	20ng
ddH<sub>2</sub>O	补充至20μL

进一步地，上述扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环，72℃延伸5min。

本发明的第六个方面，提供：

上述AS-PCR引物组或上述的试剂或上述的试剂盒在尖塘鳢鱼种鉴别中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明使用SIMC1基因作为尖塘鳢种间SNPs标记筛选的候选基因，通过直接测序法，筛选SNPs位点，所得到的21个SNPs位点均能很好的区分这三种尖塘醴；

2.本发明将筛选得到的SNPs位点转化成AS-PCR标记，利用AS-PCR鉴别三种尖塘醴，方法操作简便、耗时短、成本低，具有极高的应用价值。

3.本发明中涉及的AS-PCR引物组灵敏度高，P2引物在模板中可稀释到10^-4倍，P3引物在模板中可稀释到10^-3倍。

附图说明

图1为P1引物扩增的片段长度电泳图(90个样品中的随机24个)；

图2为P2和P3引物在三种尖塘醴样品中扩增的片段长度电泳图，其中，1,2,3为线纹尖塘鳢样品，4,5,6为云斑尖塘鳢样品，7,8,9为杂交尖塘醴样品；

图3为不同稀释度的线纹尖塘鳢和云斑尖塘鳢样品分别对P2和P3引物扩增的电泳图，其中，样品1～8为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释倍数的线纹尖塘鳢样品，扩增引物为P2，为样品9～16为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释倍数的云斑尖塘鳢样品，扩增引物为P3。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

下述实施例中所用的试验设备包括紫外分光光度计(Eppendorf公司AG22331型)。

实验材料

下述实施例中所用的云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、云斑尖塘鳢(♀)×线纹尖塘鳢(♂)杂交个体均取自广东省广州市番禺区良种培育基地，每种尖塘醴随机取样30尾，每尾鱼剪取尾鳍用无水乙醇固定，-20℃保存备用。

尖塘醴基因组DNA提取

本实施例中提取尖塘醴样品DNA的方法具体包括以下步骤：

(1)取待检测尖塘醴样品鳍条组织3mg，剪碎，加入0.5mL的裂解液(10mmol/LTris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时；

(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)混合物，搅拌混合均匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟，过滤，留取沉淀；

(4)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，除去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris-HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。

对提取的DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，以确保其纯度和完整性。

SNPs标记筛选

本发明以转录组测序的SIMC1基因序列为参照设计引物，得到P1引物对。

上述P1引物对的具体序列为：

P1-F：5’-CCAGCATTACAGTGACCTCAC-3’(SEQ ID NO.2)；

P1-R：5’-ATGGCAGGGAGTTGATGTC-3’(SEQ ID NO.3)。

利用上述P1引物对对90个尖塘醴样品进行PCR扩增。

SIMC1基因序列的扩增体系为：

表1 SIMC1基因序列的扩增体系

反应体系采用PCR扩增仪进行扩增，扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸5min。

反应结束后，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

P1引物扩增的片段大小如图1所示(90个样品中的随机24个)。测序结果表明，以90个尖塘醴为模板的PCR扩增产物测序片段长度为892bp，使用clustalx1.81进行比对，结合chromas软件查看测序图，筛选SIMC1基因SNPs位点。本实施例中共筛选到21个SNPs位点(如表2所示)，这21个SNPs位点分别命名为SNP1-SNP21，而且这21个SNPs位点均能很好的区分这三种尖塘醴，具体的扩增结果见下表。

表2 SNP1-SNP21在三种尖塘醴群体中扩增基因型统计结果

SNP所在序列的具体序列为：

加粗部分为P1引物位置。

AS-PCR引物设计

对上述实施例中的21个SNPs位点进行分析，最终确定以SNP15(上述SEQ ID NO.1所示序列第629位碱基)为主，通过设计AS-PCR引物鉴定三种尖塘鳢鱼种。

用于鉴别尖塘鳢鱼种的AS-PCR引物组，该AS-PCR引物的序列为：

P2-F：5’-GCCTGAGACTGGTAAGACAATG-3’(SEQ ID NO.4)；

P2-R：5’-GATGCTCTAAGTCAGAACG-3’(SEQ ID NO.5)；

P3-F：5’-AGCAGTGGTGGACTTGACGG-3’(SEQ ID NO.6)；

P3-R：5’-GATGCTCTAAGTCAGACCT-3’(SEQ ID NO.7)。

若上述位点为AA型则为云斑尖塘鳢，CC型为线纹尖塘鳢，AC为杂交种(云斑尖塘鳢♀×线纹尖塘鳢♂)

本实施例中的AS-PCR引物组在SEQ ID NO.1中具体体现为：

加粗且有下划线部分为P2-F引物位置；下划线部分为P3-F引物位置；加粗部分为P2-R引物位置。

其中为了增加引物特异性在P3反向引物(P3-R)第3位引入错配引物将A错配成C。

鉴别尖塘鳢鱼种的AS-PCR检测方法

设置样品1-9(1,2,3为线纹尖塘鳢样品，4,5,6为云斑尖塘鳢样品，7,8,9为杂交尖塘醴样品)，对尖塘鳢鱼种的AS-PCR检测方法进行测试。

具体包括以下步骤：

(1)用上述的AS-PCR引物组中P2-F/R对上述待测样品进行扩增，得到扩增产物A；

(2)用上述的AS-PCR引物组中P3-F/R对上述待测样品进行扩增，得到扩增产物B；

(3)检测上述扩增产物A和上述扩增产物B的条带长度，判断尖塘鳢鱼种。

其中，步骤(1)或(2)中的扩增体系为：

表3鉴别尖塘鳢鱼种的扩增体系

PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，120V电泳25分钟。凝胶在紫外灯下显色，根据条带大小，确定单倍型的基因型。

具体判断标准为：

(3)若上述扩增产物A含有222bp，上述扩增产物B含有566bp条带，则上述尖塘鳢为以云斑尖塘鳢为母本，线纹尖塘鳢为父本，杂交得到的杂交尖塘醴。

结果如图2所示。以P2引物对进行扩增时，样品1,2,3扩增产物含有222bp条带，以P3引物对进行扩增时，样品1,2,3扩增产物不含有566bp条带。以P2引物对进行扩增时，样品4,5,6扩增产物不含有222bp条带，以P3引物对进行扩增时，样品1,2,3扩增产物含有566bp条带。以P2引物对进行扩增时，样品7,8,9扩增产物不含有222bp条带，以P3引物对进行扩增时，样品1,2,3扩增产物含有566bp条带。扩增产物含有222bp条带，以P3引物对进行扩增时，样品1,2,3扩增产物含有566bp条带。说明本方法可鉴别出线纹尖塘鳢样品、云斑尖塘鳢样品和杂交尖塘醴。

AS-PCR引物灵敏性检测

以线纹尖塘鳢DNA、云斑尖塘鳢DNA为样品(初始浓度均为40mg/L)，检测上述实施例中AS-PCR引物的灵敏性。

将上述线纹尖塘鳢样品分别以不同稀释倍数进行稀释(稀释倍数分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，编号为样品1～8)。将上述云斑尖塘鳢样品分别以不同稀释倍数进行稀释(稀释倍数分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，编号为样品9～16)。

那个上述鉴别尖塘鳢鱼种的AS-PCR检测方法进行检测。

结果如图3所示。P2引物在模板中可稀释到10^-4倍，P3引物在模板中可稀释到10^-3倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

广州锐沣渔业发展有限公司

<120> 鉴别尖塘鳢鱼种的SNPs及基于SNPs的AS-PCR引物组及其检测方法与应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 893

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccagcattac agtgacctca cggattcaag tttgacttct accgagctaa acatattttc 60

aagacttgat ccgccacccc cagcagtggt ggacttgacg gaggaagact tgaaggatgg 120

cgctgacaag gaggacagtt taccaccaga tcagtgtcag aaagatgaaa cagttacaga 180

tccacaccag cagtctttaa aagctgattt taagtcacat gaaaaatctt caagaaactc 240

aagaaaagtt gttgaaacta cacaggttca taatggtctc aaacctgaac ggagactttt 300

aagatcacaa aaacgactca taaccaagtt atactgccat cggatgtcat cagtagtgtt 360

aaagagactc acttttcttg aaaaacatct caaagaacta agcacatcta agtatacagt 420

ctgtttgcct gagactggta agacaatgac actgcgtctt aaacagaagg acagcagtag 480

tataacagac tgcacaggtg acttgttaaa tacaaccaca cttgaaggtc ttaaggcccc 540

tatggagact tcccagggac aagaagaaga agaagaagcc atcacattac ttggagaagc 600

tcctctgcct ccatgtagcc aagctgaccg ttctgactta gagcatcaaa tctctctccc 660

agcttccacg caaaacagtg ataacttgaa tttatccctg gccattccct ctccagcata 720

tgcttcttca tcatcagata aagcacaaag ttttctacca aaagagcttc gttccttaag 780

cccttcactt ccggtaggaa cgtcaactgt ccaaccagag acaaatgagt caagaaacag 840

ctcaccggcc caagcttcta cttttcagtg tgaggacatc aactccctgc cat 893

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccagcattac agtgacctca c 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcaggga gttgatgtc 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctgagact ggtaagacaa tg 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatgctctaa gtcagaacg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcagtggtg gacttgacgg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatgctctaa gtcagacct 19

Claims

1.SNP标记在尖塘鳢鱼种鉴别中的应用，其特征在于，所述SNP标记位于如SEQ ID NO.1所示序列中；

其中，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端起，第77位测序峰图为单峰且碱基为G判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为G/C判定为杂交尖塘醴；和/或

第822位测序峰图为单峰且碱基为T判定为云斑尖塘鳢、为单峰且碱基为C判定为线纹尖塘鳢，为双峰且碱基为T/C判定为杂交尖塘醴。

2.一种AS-PCR引物组，其特征在于，所述AS-PCR引物的序列为：

P2-F：5’-GCCTGAGACTGGTAAGACAATG-3’(SEQ ID NO.4)和P2-R：5’-GATGCTCTAAGTCAGAACG-3’(SEQ ID NO.5)的组合；和

P3-F：5’-AGCAGTGGTGGACTTGACGG-3’(SEQ ID NO.6)和P3-R：5’-GATGCTCTAAGTCAGACCT-3’(SEQ ID NO.7)的组合。

3.根据权利要求2所述的AS-PCR引物组，其特征在于，所述AS-PCR引物组用于鉴别尖塘鳢鱼种，所述尖塘鳢包括云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、以及云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢杂交得到的杂交尖塘醴。

4.一种试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求2或3所述的AS-PCR引物组。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的AS-PCR引物组或权利要求4所述的试剂。

6.一种鉴别尖塘鳢鱼种的AS-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取尖塘鳢DNA作为待测样品；

(2)用权利要求2或3所述的AS-PCR引物组中P2-F/R对所述待测样品进行扩增，得到扩增产物A；

(3)用权利要求2或3所述的AS-PCR引物组中P3-F/R对所述待测样品进行扩增，得到扩增产物B；

(4)检测所述扩增产物A和所述扩增产物B的条带长度，判断尖塘鳢鱼种；

其中，步骤(4)中判断尖塘鳢鱼种的标准为：

若所述扩增产物A含有222bp条带，所述扩增产物B不含有566bp条带，则所述尖塘鳢为线纹尖塘鳢；

若所述扩增产物A不含有222bp条带，所述扩增产物B含有566bp条带，则所述尖塘鳢为云斑尖塘鳢；

若所述扩增产物A含有222bp，所述扩增产物B含有566bp条带，则所述尖塘鳢为云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢杂交得到的杂交尖塘醴。

7.根据权利要求6所述的AS-PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)或(3)中所述扩增体系为：

8.根据权利要求7所述的AS-PCR检测方法，其特征在于，所述扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环，72℃延伸5min。

9.权利要求2或3所述的AS-PCR引物组或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述的试剂盒在尖塘鳢鱼种鉴别中的应用。