CN108588238B

CN108588238B - 一种快速鉴定锈斑蟳性别特异分子标记和遗传性别的方法

Info

Publication number: CN108588238B
Application number: CN201810572161.6A
Authority: CN
Inventors: 马洪雨; 方少彬; 管梦云; 苗贵东; 石西
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2038-06-05
Also published as: CN108588238A

Abstract

本发明涉及一种快速鉴定锈斑蟳性别特异分子标记和遗传性别的方法，用于锈斑蟳性别鉴定的SNP位点，所述碱基序列为：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，长度为368bp；所述SNP位点为：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中第35、89、120、218、240位。鉴定方法包括：对已知性别的锈斑蟳雌雄个体DNA提取；简化基因组文库构建及高通量测序；序列分析以及性别特异SNP位点的筛选；候选SNP位点扩大样本验证；基于性别特异SNP位点的性别特异性引物的设计；利用雄性特异性引物在特定的退火温度下对锈斑蟳的基因组DNA进行PCR扩增，并根据琼脂糖凝胶电泳检测结果进行遗传性别判定。可为锈斑蟳遗传性别的鉴定提供可靠方法，特别是发育早期阶段锈斑蟳，具有操作简便、耗时短、成本低廉、重复性好，准确率高等优点。

Description

一种快速鉴定锈斑蟳性别特异分子标记和遗传性别的方法

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的海洋蟹类性别鉴定技术，特别涉及一种快速鉴定锈斑蟳性别特异分子标记和遗传性别的方法。

背景技术

SNP(Single Nucleotide Polymorphism)，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP作为第三代遗传分子标记,目前已经在很多物种的遗传多样性分析、基因作图、分子标记辅助育种和功能基因组学的研究中得到了广泛的应用。

锈斑蟳(Charybdis feriatus)俗称红花蟹，隶属于甲壳动物纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，蟳属(Charybdis)，主要分布于太平洋以及印度洋的热带、亚热带和温带沿岸，是西太平洋-印度洋最适合养殖的四大经济蟹类之一。锈斑蟳在我国广东、广西、福建、台湾等地均有分布。

锈斑蟳个体大、肉质鲜美、颜色红艳喜庆,深受市场欢迎。随着经济的发展和生活水平的提高，人们对锈斑蟳的需求也不断增加。由于其生长速度快、体型大、风味好、市场需求高，是最有价值的渔业资源之一，已成为水产养殖和驯化的潜在重要目标。野生雌性锈斑蟳的体重通常为200-350克，但雄性锈斑蟳的体重可达1公斤。因此，本研究的开展有助于进行锈斑蟳人工繁育研究及锈斑蟳单性育种和养殖技术的发展，有助于提高其养殖产量，创造更高的经济价值，推动锈斑蟳资源科学保护、开发与利用，促进锈斑蟳养殖业的发展。

目前国内外有关锈斑蟳的报道涉及渔业生物调查、分布生物学特征、生态学食物组成、肉质营养评价、病害与毒理学、胚胎发育、亲蟹培育、人工育苗技术、微卫星分子标记等各个方面。但是由于目前通过简化基因组测序筛选多态性遗传标记的技术手段应用还不够广泛，没有结合分子方法用于鉴定锈斑蟳性别，现在生产实践或学术研究中都只能通过形态学方法鉴定锈斑蟳的性别，鉴定准确性低，而且难以鉴定处于生长发育早期的锈斑蟳的性别，目前还未见与锈斑蟳性别连锁标记以及遗传性别鉴定方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴定锈斑蟳性别特异分子标记和遗传性别的方法，以快速鉴定锈斑蟳的性别特异分子标记，并快速鉴定遗传性别，特别是处于生长发育早期的锈斑蟳的性别。

一种用于锈斑蟳性别鉴定的SNP位点，所述碱基序列为：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2，长度为368bp；所述SNP位点为：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2中第35、89、120、218、240位。

一种快速鉴定锈斑蟳性别特异分子标记和遗传性别的方法，主要包括以下步骤：

(1)对已知性别的锈斑蟳雌雄个体DNA提取；

(2)简化基因组文库构建及高通量测序；

(3)序列分析以及性别特异SNP位点的筛选；

(4)候选SNP位点扩大样本验证；

(5)基于性别特异SNP位点的性别特异性引物的设计；

(6)利用雄性特异性引物在特定的退火温度下对锈斑蟳的基因组DNA进行PCR扩增，并根据琼脂糖凝胶电泳检测结果进行遗传性别判定。

进一步的，步骤(5)所述性别特异性引物的设计主要包括：根据步骤(4)中验证得到的雄性特异SNP位点结合碱基错配的方法设计雄性特异性引物。

进一步的，所述雄性特异性引物有两对，所述两对雄性特异性引物的核苷酸序列分别为：

所述两对雄性特异性引物的核苷酸序列分别为：

引物1

正向引物SEX-F1：5'CTTGGTTTGTCAGGAAACTGGCTCG 3'

反向引物SEX-R1：5'GAGAGAGCATGCTCTCAGCTATTACGG 3'

引物2

正向引物SEX-F2：5'GTCAGATTTGGATGGAAATAGTCTATTA 3'

反向引物SEX-R1：5'GAGAGAGCATGCTCTCAGCTATTACGG 3'。

设计的两对雄性特异性引物共用一条反向引物。

所述的两对引物核苷酸序列均包含3个错配碱基，SEX-F1中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第22位、第23位和第25位，其中第22、23位是人为设计的碱基错配，第25位是雄性特异的SNP位点；SEX-F2中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第25位、第26位和第28位，其中第25、26位是人为设计的碱基错配，第28位是雄性特异的SNP位点；SEX-R1中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第24位、第25位和第27位，其中第24、25位是人为设计的碱基错配，第27位是雄性特异的SNP位点。错配碱基均位于引物序列的3'端，是基于引物与DNA模板的结合是从3'端开始的原理，3'端的SNP位点碱基错配可以提高雌性错配率。

进一步的，所述引物1特定退火温度为：63℃，所述引物2特定退火温度为50℃。

进一步的，步骤(4)所述候选SNP位点扩大样本验证主要包括：根据得到的包含性别特异SNP位点的序列为模板，设计一对PCR引物，提取剩余样品基因组DNA作为模板进行扩增，得到PCR产物长度为290bp，对得到的PCR产物进行测序，检验候选SNP位点；

所述PCR引物的核苷酸序列为：

C-F：5'CGATCAATTCTTGGTTTGTCAGG 3'

C-R：5'TCGCTACTTATTGCATCCGAG 3'。

所述PCR引物作为性别鉴定引物的对照引物。这对引物在两个地方运用到，一是扩增目的序列进行测序，检验SNP位点的准确性；二是作为性别鉴定引物的对照引物。为排除DNA模板对性别鉴定的影响，所述PCR引物作为性别鉴定引物的对照引物，可以在所有样品中扩增出长度为290bp的条带。

进一步的，步骤(3)所述序列分析以及性别特异SNP位点的筛选主要包括：通过cd-hit-est对测得的XX8的所有序列进行聚类和过滤，得到了很多适宜组装的tag和reads，对每类中的reads用Spades进行局部组装，剔除其中小于150bp的序列。然后通过bwa将所有的reads比对到XX8个体的组装结果上，使用samtools进行群体变异检测。最后通过比较分析测定的雄性个体与雌性个体之间的SNP变异趋势检测到5个性别特异的SNP位点。

进一步的，步骤(1)中所述锈斑蟳个体DNA提取步骤为：采集锈斑蟳的肌肉组织，在裂解液中剪碎至匀浆状态；然后分别加入RNAase A和蛋白酶K对肌肉组织中的RNA和蛋白进行消化，在55℃水浴锅中消化2h；然后采用酚和氯仿分别抽提多次，用冰乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤DNA沉淀后在37℃烘箱中干燥，加入适量双蒸水溶解DNA，低温保存备用。

进一步的，步骤(2)中所述简化基因组文库构建及高通量测序步骤为：首先用EcoRI-HF内切酶剪切基因组DNA，接着用AmPure Beads磁珠吸附法纯化酶切产物并连接接头P1，室温孵育2h，然后用AmPure Beads磁珠吸附法纯化连接产物，用Bioruoter超声法打碎连接产物，打碎后的连接产物长度约为350bp，连接接头P2，室温孵育2h，接着用切胶回收的方法纯化连接产物，之后通过PCR方法富集回收产物，再回收长度300-500bp之间的PCR产物，最后对回收的PCR产物进行高通量测序。回收片段过长或过短会影响测序效率。

进一步的，步骤(6)中所述PCR体系为25μL，包括：ddH₂O 20.2μL，10×PCR buffer2μL，dNTPs(2.5mM each)1μL，正反引物各0.4μL(10μM)，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板0.5μL。所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，特定温度退火30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。其中引物1特定退火温度为63℃，引物2特定退火温度为50℃。

与现有技术相比，本发明通过简化基因组测序和基因组评估研究锈斑蟳性别特异的SNP位点并进行验证，为锈斑蟳性别决定及性别分化的研究提供重要的支持，然后根据性别特异的SNP位点设计雄性特异性引物进行扩增，使得以后只需通过PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，检测雄性特异性条带的有无即可判定其性别。可以为锈斑蟳遗传性别的鉴定，特别是处于发育早期阶段的锈斑蟳性别鉴定提供准确高效的鉴定方法，对锈斑蟳的基础研究和养殖生产具有重要作用。具有操作简便、耗时短、成本低廉、重复性好，鉴定准确率高，是一种准确方便的鉴定方法。

附图说明

图1是针对引物1进行梯度退火温度筛选的结果，256bp处的条带为利用引物1扩增得到的目的条带；

图2是针对引物2进行梯度退火温度筛选的结果，205bp处的条带为利用引物2扩增得到的目的条带；

图3是利用引物1对24只已知性别的锈斑蟳用本发明技术手段鉴定遗传性别的结果，256bp处的条带为利用引物1扩增得到的雄性特异性条带，290bp处的条带为对照条带；

图4是利用引物2对24只已知性别的锈斑蟳用本发明技术手段鉴定遗传性别的结果，205bp处的条带为利用引物2扩增得到的雄性特异性条带，290bp处的条带为对照条带；其中所用Marker为

DNA Marker。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例

1.样品采集及其基因组DNA的提取

采集到锈斑蟳样品44只，其中雄性个体22只，雌性个体22只。取锈斑蟳肌肉组织50mg左右，放入盛有300μL裂解液的1.5ml离心管，剪碎至匀浆状态，加入10μL RNaseA，混匀，室温孵育2分钟。再向离心管中加入300μL裂解液和5μL蛋白酶K，充分混匀，放入55℃水浴锅中消化2h。接着加入300μL Tris-平衡酚和300μL氯仿进行抽提，10分钟后13000r离心10分钟。吸取离心后的上清液500μL左右至新的离心管中，向其中加入600μL氯仿再抽提一次。吸取离心后的上清液350μL左右至新的离心管中，加入1ml预冷的无水乙醇，12000r离心3分钟。然后用预冷的75％的乙醇再清洗两遍。在37℃烘箱中晾干DNA，加入适量双蒸水溶解后低温保存备用。

2.简化基因组文库构建及高通量测序

用上述44只样品中的10只雄性和10只雌性锈斑蟳构建了简化基因组文库。首先用EcoRI-HF内切酶剪切基因组DNA，接着用AmPure Beads磁珠吸附法纯化酶切产物并连接接头P1，室温孵育2h，然后用AmPure Beads磁珠吸附法纯化连接产物，用Bioruoter超声法打碎连接产物，打碎后的连接产物长度约为350bp，连接接头P2，室温孵育2h，接着用切胶回收的方法纯化连接产物，之后通过PCR方法富集回收产物。所用PCR方法采用30μL反应体系，包括：2×Mix 15μL、P1和P2引物各0.2μL、回收产物10μL。再回收长度300-500bp之间的PCR产物，最后对回收的PCR产物进行高通量测序。

3.序列分析以及性别特异SNP位点的筛选

运用cd-hit-est对样本XX8的酶切read进行聚类。选择XX8是因为该样本测序量最多，且质量最好。为便于后续组装，类中序列数要求至少为10条，同时为避免过多重复序列，类中序列数的上限为400条。这样过滤之后，得到适合组装的tag(类)为348879个。根据聚类结果，对每类中的read1和read2进行局部组装。组装的软件采用spades，按照推荐的kmer变化范围21，33和55，进行自动组装，挑选最优结果。最终的组装序列中剔除长度不足150bp的序列(因为read读长是150)，得到平均长度为331bp，N50为344bp的241886个contig。然后用bwa将全部20个样本的read比对到XX8的组装结果上，采用samtools对比对结果排序和去重复，再用samtools的mpileup对所有样本进行群体变异检测。最后通过比较分析测定的雄性个体与雌性个体之间的SNP变异趋势检测到5个性别特异的候选SNP位点。检测到的5个SNP位点都位于一条长度为368bp的序列上。

4.性别特异SNP位点的验证

根据得到的包含候选性别特异SNP位点的368bp的序列为模板，设计了一对引物，正向引物C-F：CGATCAATTCTTGGTTTGTCAGG、反向引物C-R：TCGCTACTTATTGCATCCGAG。提取剩余24只锈斑蟳样品基因组DNA作为模板利用上述引物进行扩增，得到PCR产物长度为290bp，对得到的PCR产物进行测序。对测序得到的峰图进行认真比较检验，确认了5个SNP位点在雄性个体中全部为杂合，而在所有雌性个体中全部为纯合，因此，这5个SNP位点被证实为与锈斑蟳性别完全连锁的分子标记。

5.基于性别特异SNP位点的性别特异性引物的设计与筛选

1)根据已知的碱基序列及雄性特异SNP位点，利用引物设计软件Primer Premier5.0设计了6对雄性特异性引物，引物的核苷酸序列为：

引物1

正向引物SEX-F1：5'CTTGGTTTGTCAGGAAACTGGCTCG 3'

反向引物SEX-R1：5'GAGAGAGCATGCTCTCAGCTATTACGG 3'

引物2

正向引物SEX-F2：5'GTCAGATTTGGATGGAAATAGTCTATTA 3'

反向引物SEX-R1：5'GAGAGAGCATGCTCTCAGCTATTACGG 3'

引物3

正向引物SEX-F3:5'GGTTTGTCAGGAAACTGGACCG 3'

反向引物SEX-R2:5'GAGAGCATGCTCTCAGCTATTCTGG 3'

引物4

正向引物SEX-F4:5'GGATTTGGATGGAAATAGTCTGGTA 3'

反向引物SEX-R2:5'GAGAGCATGCTCTCAGCTATTCTGG 3'

引物5

正向引物SEX-F5:5'AAGAGTGCCGATATATCCGATAGTAA 3'

反向引物SEX-R3:5'GTGTCTTTTGTGTCCAGGCGG 3'

引物6

正向引物SEX-F6:5'GTCAGATTTGGATGGAAATAGTCTATTA 3'

反向引物SEX-R4:5'GTCTTTTGTGTCCAGGCGG 3'

其中粗体字母表示错配的碱基，设计引物1和引物2共用一条反向引物，引物3和引物4共用一条反向引物。

这些引物是根据以上步骤中验证得到的雄性特异SNP位点结合碱基错配的方法设计的。引物1和引物2的三条引物核苷酸序列均包含3个错配碱基，SEX-F1中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第22位、第23位和第25位，其中第22、23位是人为设计的碱基错配，第25位是雄性特异的SNP位点；SEX-F2中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第25位、第26位和第28位，其中第25、26位是人为设计的碱基错配，第28位是雄性特异的SNP位点；SEX-R1中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第24位、第25位和第27位，其中第24、25位是人为设计的碱基错配，第27位是雄性特异的SNP位点。引物3和引物4的三条引物核苷酸序列均包含一个错配碱基，每条引物核苷酸序列的错配碱基均位于3'端，且都是雄性特异的SNP位点。引物5和引物6的四条引物核苷酸序列均包含三个错配碱基，SEX-F5中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第23位、第24位和第26位，其中第23、24位是人为设计的碱基错配，第26位是雄性特异的SNP位点；SEX-F6中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第18位、第19位和第21位，其中第18、19位是人为设计的碱基错配，第21位是雄性特异的SNP位点；SEX-R3中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第25位、第26位和第28位，其中第25、26位是人为设计的碱基错配，第28位是雄性特异的SNP位点；SEX-R4中的3个错配碱基分别为所示核苷酸序列中的第16位、第17位和第19位，其中第16、17位是人为设计的碱基错配，第19位是雄性特异的SNP位点。错配碱基均设计在引物序列的3'端，是基于引物与DNA模板的结合是从3'端开始的原理，3'端的SNP位点碱基错配可以使引物难以与雌性DNA模板结合，从而提高雌性错配率，出现只有雄性中能扩增出特异性条带的结果。

为了避免由于DNA模板问题而导致的对未扩增出特异性条带的个体的误判，本发明以验证性别特异SNP位点所用引物作为对照引物。其核苷酸序列为：

C-F：5'CGATCAATTCTTGGTTTGTCAGG 3'

C-R：5'TCGCTACTTATTGCATCCGAG 3'

2)PCR扩增

从上述锈斑蟳样品选取两个个体(一雌一雄)以其DNA为模板，利用设计的雄性特异性引物进行PCR扩增。PCR体系为25μL，包括：ddH2O 20.2μL，10×PCR buffer 2μL，dNTPs(2.5mM each)1μL，正反引物各0.4μL(10μM)，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板0.5μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，特定温度退火30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。其中引物1-6特定退火温度分别为60℃、47℃、58℃、54℃、54℃、51℃。

3)琼脂糖凝胶电泳检测

制备1％的琼脂糖凝胶，上样时取

DNA Marker 3μL，取每个待测样品3μL PCR产物经电泳检测，电泳条件：电压180V，时间15-20min；电泳结束后将琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪，设置适当的参数后曝光并拍照。

根据雌雄个体条带的差异判断所设计引物的有效性；根据条带是否单一判断所设计引物的好坏。电泳结果显示，引物1和引物2在雄性中有一条较亮的条带，而雌性中出现一条较暗的条带；引物3和引物4在雌雄个体中均出现一条较亮的条带；引物5和引物6在雌雄个体中均出现较暗的目的条带和较亮的非目的条带。本结果证明，设计的引物1-6在现有的退火温度下均不能实现对锈斑蟳遗传性别的鉴定，但由于可以看到引物1和引物2扩增后有单一目的条带且雌雄中有差异，所以引物1和引物2具有成为锈斑蟳遗传性别鉴定引物的潜力。

4)雄性特异性引物退火温度筛选

根据引物1和引物2现有退火温度及步骤5)中条带的情况，针对引物1和引物2分别设计了一系列梯度退火温度，并进行PCR扩增，电泳结果如图1、2。根据电泳结果，引物1选取最佳退火温度为63℃，引物2选取最佳退火温度为50℃。

6.PCR扩增

以上述24只锈斑蟳样品DNA为模板，利用设计的雄性特异性引物进行PCR扩增。经过大量实验筛选出优化的PCR体系为25μL，包括：ddH2O 20.2μL，10×PCR buffer 2μL，dNTPs(2.5mM each)1μL，正反引物各0.4μL(10μM)，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板0.5μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，特定温度退火30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。其中引物1特定退火温度为63℃，引物2特定退火温度为50℃。

7.琼脂糖凝胶电泳检测及锈斑蟳性别判定

制备1％的琼脂糖凝胶，上样时取

根据电泳条带判定锈斑蟳性别，如果相应泳道无条带则判定该个体为雌性；利用引物1扩增时，如果相应泳道有一条256bp的条带(结果如图3所示)，或利用引物2扩增时相应泳道有一条205bp的条带(结果如图4所示)，则判定该个体为雄性。根据电泳结果判断1-12个体为雌性，13-24号个体为雄性，该判定结果与表型判定结果完全一致。

以上所公开的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕头大学

<120> 一种快速鉴定锈斑蟳性别特异分子标记和遗传性别的方法

<130> 2018.05.28

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 368

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

tcgatcaatt cttggtttgt caggaaactg gaccggatgc ccaccacatt atgtcaacgc 60

cgtcagattt ggatggaaat agtctggtac ctataagagt gccgatatat ccgatatcaa 120

atatatagag atccgatata tagagggttt actgtaatta caacgtcgca cataagttac 180

tctctttaac aaattcatat cttgatactg ggaagggcca actggacaca aaagacactc 240

cagaatagct gagagcatgc tctctcggat gcaataagta agacactgcg aggacatatt 300

tcaaataaca acttcagggg aaattttaga aggaagattt tggtttttaa acataagctc 360

aggagcgg 368

<210> 2

<211> 368

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

tcgatcaatt cttggtttgt caggaaactg gaccagatgc ccaccacatt atgtcaacgc 60

cgtcagattt ggatggaaat agtctggtgc ctataagagt gccgatatat ccgatatcag 120

atatatagag atccgatata tagagggttt actgtaatta caacgtcgca cataagttac 180

tctctttaac aaattcatat cttgatactg ggaagggtca actggacaca aaagacactt 240

cagaatagct gagagcatgc tctctcggat gcaataagta agacactgcg aggacatatt 300

tcaaataaca acttcagggg aaattttaga aggaagattt tggtttttaa acataagctc 360

aggagcgg 368

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cttggtttgt caggaaactg gctcg 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtcagatttg gatggaaata gtctatta 28

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gagagagcat gctctcagct attacgg 27

Claims

1.一种鉴定锈斑蟳遗传性别的方法，其特征在于，利用雄性特异性引物在特定的退火温度下对锈斑蟳的基因组DNA进行PCR扩增，并根据琼脂糖凝胶电泳检测结果进行遗传性别判定；所述雄性特异性引物有两对，两对所述雄性特异性引物的核苷酸序列分别为：

引物1

正向引物SEX-F1： 5' CTTGGTTTGTCAGGAAACTGGCTCG 3'

反向引物SEX-R1： 5' GAGAGAGCATGCTCTCAGCTATTACGG 3'；

引物2

正向引物SEX-F2： 5' GTCAGATTTGGATGGAAATAGTCTATTA 3'

反向引物SEX-R1： 5' GAGAGAGCATGCTCTCAGCTATTACGG 3'；

根据电泳条带判定锈斑蟳性别，如果相应泳道无条带则判定该个体为雌性；利用引物1扩增时，如果相应泳道有一条256bp的条带，或利用引物2扩增时相应泳道有一条205bp的条带，则判定该个体为雄性；

所述引物1特定退火温度为：63 ℃，所述引物2特定退火温度为50 ℃。

2.根据权利要求1所述鉴定锈斑蟳遗传性别的方法，其特征在于，所述方法还包括设计一对PCR引物，以所述PCR引物作为性别鉴定引物的对照引物。

3.根据权利要求2所述鉴定锈斑蟳遗传性别的方法，其特征在于，所述PCR引物的核苷酸序列为：

C-F：5' CGATCAATTCTTGGTTTGTCAGG 3'

C-R：5' TCGCTACTTATTGCATCCGAG 3'。