CN109337986B - 小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物及个体识别的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，包括10对小体鲟微卫星标记引物，10对所述标记引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1‑20；本发明还公开了一种小体鲟个体识别的方法，包括以下步骤：步骤1：分别取不同的小体鲟组织样品，然后提取小体鲟组织样品DNA；步骤2：利用步骤1所述的微卫星标记引物对小体鲟组织样品DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；步骤3：将所述PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离，再根据电泳分离结果统计PCR扩增产物的基因型；步骤4：根据所述PCR扩增产物的基因型对小体鲟进行个体识别；使用本发明的方法能有效的对小体鲟进行遗传多样性检测和个体识别。
Description
技术领域
本发明属于生物个体鉴定技术领域，具体涉及一种小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，本发明还涉及采用该微卫星标记引物进行个体鉴定的方法。
背景技术
小体鲟，为鲟科鲟属的鱼类，主要分布于欧洲的淡水。体呈长锥形，体色变化较大，背部常呈深灰褐色，腹部黄白色。食性杂，小鱼虾，水生植物。小体鲟有洄游性种类和定栖性种类,在河流中以底栖生物为食，主食水生昆虫幼体、甲壳类和小型软体动物。在鱼类产卵期，小体鲟以其它鲟鱼卵及其他鱼卵为食，有时鱼卵占其摄食量的50％以上。小体鲟在冬天水温低时几乎不摄食，并隐伏在坑穴中。其生长最适温度为21-23℃。小体鲟是鲟鱼中个体较小的种类，其身体延长，歪尾型，全身被以5行骨板。吻端尖，吻长占头长的70％以下，吻须4根。口小，下位，呈花瓣状，口能伸出呈管状。该种通常不作远距离的洄游；食性杂，与其他种类相比，容易接受人工配合饲料，易驯养。鱼苗期生长速度较快，性成熟较早，一般需4～5年，是大中型水体进行增养殖以及鱼子酱生产的理想鲟鱼品种，适宜在我国东北、西北、西南地区偏冷水水库和湖泊增养殖。其观赏价值很高，在东南亚和我国港澳台等地区被视为上等观赏鱼。
小体鲟外表相识，很难从外表上对小体鲟进行辨认，一般生产上对小体鲟进行辨认的方式是在小体鲟身上进行打标处理，但是这种方式有一种弊端，当小体鲟身上的标被水冲刷掉了就很难在辨别小体鲟个体。
微卫星标记是目前研究濒危动物保护遗传学中最理想的一类方式，微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。
本发明利用10个小体鲟微卫星位点,设计相应的引物，用这10个微卫星引物实现了对小体鲟分子水平上的个体识别，为小体鲟的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，能有效的对小体鲟进行遗传多样性检测和个体识别。
本发明的第二个目的是提供一种用于小体鲟个体鉴定的方法。
本发明的特征在于，一种小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，包括10对小体鲟微卫星标记引物，10对所述标记引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-20。
一种小体鲟个体识别的方法，使用如上所述的一种小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，具体包括以下步骤：
步骤1：分别取不同的小体鲟组织样品，然后提取小体鲟组织样品DNA；
步骤2：利用步骤1所述的微卫星标记引物对小体鲟组织样品DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤3：将PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离，再根据电泳分离结果统计PCR扩增产物的基因型；
步骤4：根据PCR扩增产物的基因型对小体鲟进行个体识别。
本发明的特征还在于，
PCR反应体系是15μL：10×PCR Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl2 1.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.2μL，DNA模板2μL，超纯水8.3μL。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s 30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
步骤3中聚丙烯酰胺胶为浓度是10％的聚丙烯酰胺胶。
本发明的有益效果是：本发明提供的微卫星位点可以实现对小体鲟的遗传多样性检测、个体识别，还可以计算个体之间的遗传距离和亲缘关系的远近，在使用本发明时，只需提前把养殖的所有的鱼取样，用本发明提供的方法确定每条鱼之间的亲缘关系，在做人工繁殖时，把不确定关系的候选亲本取样，使用本发明即可确定候选亲本之间的关系，避免了传统打标的方式给鱼带来的损伤，或者打的标记掉了之后给亲缘关系的确定带来的困扰。
附图说明
图1是16尾小体鲟个体在10个微卫星位点的基因型
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，其特征在于，包括10对小体鲟微卫星标记引物，10对所述标记引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-10，SEQ ID NO:1-10的信息如下表1所示：
表1 10个微卫星标记的微卫星引物指标参数
一种小体鲟个体识别的方法，其特征在于，使用如上所述的小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，具体包括以下步骤：
步骤1：分别取不同的小体鲟组织样品，然后提取小体鲟组织样品DNA；
步骤2：利用步骤1所述的微卫星标记引物对小体鲟组织样品DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR反应体系是15μL：10×PCR Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl2 1.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.2μL，DNA模板2μL，超纯水8.3μL，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s 30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
步骤3：将所述PCR扩增产物在浓度是10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离，再根据电泳分离结果统计PCR扩增产物的基因型；
步骤4：根据所述PCR扩增产物的基因型对小体鲟进行个体识别。
一、小体鲟DNA的提取
1、从鲟鱼养殖公司取16尾小体鲟，采集小体鲟的鳍条，提取小体鲟的基因组DNA，提取方式采取传统的酚-氯仿抽提途径。
1.1、每个个体取0.1g尾鳍放于1.5ml的离心管内，剪碎，加入450μLSTE抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0、1mmol/L EDTA，pH8.0)、35μL SDS(10％)、15μL蛋白酶K(0.2％)；
1.2、将离心管放入放在55℃的水浴锅内水浴1个小时至澄清透明；
1.3、在离心管内加入700μL Tris饱和酚，放在震荡机上混匀30分钟，4℃下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中(注意用尖端剪平的1mL管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀)；
1.4、在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1)，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新Eppendorf管中；
1.5、上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离10min，吸取上清液；
1.6、加入-20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，收集沉淀；
1.7、用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μL TE(10mmol/LTris-HCl，pH8.0；0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)，室温充分溶解，成功提取DNA。
二、构建基因文库
取16个小体鲟样本DNA，采用EcoRI-HF内切酶对其酶切,然后采用AmPure Beads磁珠吸附方法纯化酶切产物，然后连接到接头P1，静置两小时后，用AmPure Beads磁珠吸附方法再次纯化酶切产物，之后加入接头P2，静置两小时。然后割胶回收进行高通量测序。
三、序列分析，设计微卫星引物
对组装好的reads和contigs查找含有微卫星核心重复的序列，查找原则为：重复序列为四碱基，重复次数超过8次。用生物学软件Primer Premier 5.0对查找出的序列进行设计引物，设计引物的原则为：退火温度为50-62℃之间，引物长度为18-25bp之间，GC含量在40-60％之间，PCR产物预期长度为200-700之间。最终合成引物400对。
四、小体鲟微卫星筛选
通过转录组测序设计400对微卫星标记引物，用实施例1中的DNA为模板，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR反应体系是15μL：10×PCR Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP0.5μL，MgCl2 1.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.2μL，DNA模板2μL，超纯水8.3μL。PCR产物用10％的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染，最终获得了10对多态性高并能稳定扩增的微卫星标记。
五、小体鲟个体鉴定
利用本发明筛选的10对微卫星引物对16个小体鲟个体进行PCR反应，PCR反应体系是15μL：10×PCR Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP0.5μL，MgCl2 1.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.2μL，DNA模板2μL，超纯水8.3μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用10％的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。
用软件BIO-PROFIL判断聚丙烯酰胺胶显示的各个个体的等位基因片段的大小，用Atetra软件分析各个个体之间的遗传距离，用NTsys软件画出各个个体之间的聚类分析图，根据聚类分析结果可以判断各个个体之间的亲缘关系，鉴别出全部的小体鲟个体，从而实现了小体鲟分子遗传学水平上的个体识别，如图1所示是16尾小体鲟个体在10个微卫星位点的基因型。
序列表
<110> 西安理工大学
<120> 小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物及个体识别的方法
<130> 20
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ggcattatag acccctgtcg g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acagctgggg aggaacagta 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tccagtgaca tttcagggca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gcatgggtgc cactgaaata 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tcaacactat gaccggtact gt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ttaaacgaaa ggcccagggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gcgttcactg agtcaatgca 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ctggacagag aacagatagc gt 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
acctgccttc ttccagcttt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
aatcacggac agccaagagg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
cgctgcatgt acacgtgtaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gctgcgactt cgaggtttct 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
agctactttt tgcttttggg tt 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
agggtgtgag aaagaaagat gga 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ggcattcaaa actctttcgt gga 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
gggggccatc cttatctcac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
acagtggaca atgtggctca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ccaggaccac ggctagtttt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
gacgtttgga gcgtggaaac 20
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
tggcatttac agcataaact aaacct 26
Claims (3)
1.一种小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，其特征在于，包括10对小体鲟微卫星标记引物，10对所述标记引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-20。
2.一种小体鲟个体识别的方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的一种小体鲟个体鉴定的微卫星标记引物，具体包括以下步骤：
步骤1：分别取不同的小体鲟组织样品，然后提取小体鲟组织样品DNA；
步骤2：利用如权利要求1所述微卫星标记引物对小体鲟组织样品DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
所述步骤2中PCR反应体系是15μL：10×PCR Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl2 1.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.2μL，DNA模板2μL，超纯水8.3μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s 30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
步骤3：将所述PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离，再根据电泳分离结果统计PCR扩增产物的基因型；
步骤4：根据所述PCR扩增产物的基因型对小体鲟进行个体识别。
3.根据权利要求2所述的一种小体鲟个体识别的方法，其特征在于，所述步骤3中聚丙烯酰胺胶为浓度是10％的聚丙烯酰胺胶。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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