CN114959050A - 一种基于四碱基微卫星荧光多重pcr的红螯螯虾亲子鉴定方法 - Google Patents

一种基于四碱基微卫星荧光多重pcr的红螯螯虾亲子鉴定方法 Download PDF

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CN114959050A CN202111527499.8A CN202111527499A CN114959050A CN 114959050 A CN114959050 A CN 114959050A CN 202111527499 A CN202111527499 A CN 202111527499A CN 114959050 A CN114959050 A CN 114959050A
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Abstract

本发明提供一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，属于生物工程技术领域，本发明包括以下步骤：（1）提取待测样本基因组DNA；（2）红螯螯虾微卫星引物的筛选（3）多重PCR扩增体系的构建将步骤（2）的20对引物按照120‑200bp、220‑260bp、280‑340bp、360‑420bp、440bp‑500bp的区间进行分组，选出扩增组合，获得多组多重PCR扩增体系；（4）亲子鉴定待测样本基因组DNA扩增，得到多重PCR产物，分型，读取亲本及子代基因型，判断亲子关系。本发明能够实现多种引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。在PCR扩增的过程中同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的，并且对红螯螯虾达到100％的亲子鉴定成功率。

Description

一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定 方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法。
背景技术
红螯螯虾又名澳洲淡水龙虾，原产于澳大利亚，我国于20 世纪90年代引进。红螯螯虾有如下特点：一是体大肥美，个体一般重达 100～200 g，在澳洲最大的个体达 500 g；二是营养丰富，肉质滑嫩、鲜美、香甜、爽口；三是观赏价值高，虾体褐绿，外侧顶端有一膜质鲜红带，美丽好看；四是适宜长途运输，离开水体较长时间不会死亡；五是食性杂，既吃动物性饲料，也吃植物性饲料以及人工配合饲料；六是生长快、产量高、经济效益好，当年放养当年收获。然而，由于红螯螯虾是引进种，在繁育传代过程中进行种质监测对于预防种质退化具有重要的意义。通过遗传改良提高红螯螯虾的种质，培育生长快速、抗性能力强的优良品种对于红螯螯虾养殖业的稳定发展显得尤为迫切。
在传统的遗传选育基础上，利用分子标记研究选育种群的遗传多样性、辅助亲本选择能够有效地提高选育效率，尤其是对于如抗病性状等难以进行表型测定的性状。微卫星（又称简单重复序列， Simple Sequence Repeats，SSR)）多态性高、稳定性好，且为共显性标记，是一种理想的分子标记。目前，微卫星标记技术已被广泛用于遗传图谱构建、家系鉴定、品种纯度检测以及目标性状基因定位等研究领域。分子标记是种质资源鉴定、家系选育和放流效果评估等研究和应用中一个重要技术手段。在家系选育中，了解整个家系遗传多样性，子代与亲代的对应关系以及子代与子代的关系，可以指导亲本选留，从而避免近亲繁殖，对于预防种质衰退具有重要作用。
微卫星DNA是真核生物基因组中短的串联重复序列。由于微卫星位点数量多，在基因组中均匀分布，共显性遗传且易于检测，微卫星DNA得到了广泛的应用。红螯螯虾的微卫星已用来解决遗传多样性、遗传结构等问题。目前关于红螯螯虾微卫星标记的数目较少，GenBank中仅仅包含55条红螯螯虾微卫星序列，且这些微卫星都是二碱基微卫星。同二碱基微卫星相比，四碱基微卫星具有易于分型和不易产生影子带的优点。可用遗传标记的缺乏是影响红螯螯虾选育的重要原因之一。
另一方面，上述遗传学实验均需要采用多个微卫星位点，研究者需要花费大量的时间和实验成本。更重要的是，要消耗较多的DNA样本。故发明一种对样本量要求少、成本低、高效的微卫星实验体系对于红螯螯虾的育种研究来说具有重要的意义。
微卫星多重 PCR指在一个PCR体系中加入多对微卫星特异性引物，对同一个模板的不同区域进行同时扩增的PCR技术。微卫星多重PCR可以同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的。微卫星多重PCR的核心内容在于如何设计和优化引物组合，使得引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。
已公开的申请号为CN201510084807.2的中国专利中公开了一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组及方法，属于青虾的育种技术领域。其步骤包括：采用人工繁育的方法繁育青虾家系；采集待鉴定的青虾样品，提取基因组DNA；获得的基因组DNA为模板，选取筛选出的12对微卫星引物进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳检测；将电泳结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行亲子鉴定。本发明可以快速准确地对青虾进行亲子鉴定，区别不同家系，可以减少在青虾群体选育中存在的近亲繁殖现象更有利于实现家系选育，从而加快选育的进程，提高选育效果。
因为在PCR扩增的过程中多种引物之间容易相互作用、或产生非特异扩增，使扩增产物重叠，所以在进行扩增的时候PCR扩增体系中引物往往是单个引物。现有技术中大部分的PCR扩增技术的是单个目的片段逐一进行扩增，扩增的过程中浪费实验样品、实验成本，操作时间长。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，通过筛选四碱基微卫星引物进行试验组合出多组多重 PCR扩增体系，选择不同长度的引物组合，能够实现多种引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。在PCR扩增的过程中同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的，并且对红螯螯虾达到100％的亲子鉴定成功率。
本发明为一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，包括以下步骤；
（1） 红螯螯虾样本DNA提取
取红螯螯虾个体的附肢，用酚-氯仿法提取待测样本基因组DNA，将待测样本基因组DNA的浓度稀释至25ng/μL；
（2） 红螯螯虾微卫星引物的筛选
根据本实验室获得的红螯螯虾基因组数据运用MISA软件筛选
四碱基微卫星序列，利用Primer Premier 6.0软件设计微卫星位点引物，筛选出20对引物：Cqaa-48、Cqaa-191、Cqaa-218、Cqaa-197、Cqaa-24、Cqaa-181、Cqaa-121、Cqaa-227、Cqaa-22、Cqaa-163、Cqaa-106、Cqaa-185、Cqaa-115、Cqaa-182、Cqaa-240、Cqaa-228、Cqaa-132、Cqaa-211、Cqaa-43、Cqaa-167；
（3） 多重PCR扩增体系的构建
将步骤（2）所述20对引物按照120-200bp、220-260bp、280-340bp、360-420bp、440bp-500bp的区间进行初步分组，然后在不同组中选择3-5对引物，选出扩增清晰的组合，构建多重PCR扩增体系，将每个位点上游引物的5'端进行荧光修饰，获得由20个微卫星位点组成的多组多重 PCR扩增体系；
所述多重 PCR扩增体系为五组，所述多重PCR扩增体系为：2× Multiplex PCRMix 10μL，上下游引物的工作浓度为10 mmol/L，50 ng基因组DNA，补加灭菌超纯水至体系为20 μL，所述多重PCR扩增体系包括第一组、第二组、第三组、第四组、第五组；
（4） 亲子鉴定
基于步骤（3）构建的多组多重PCR扩增体系步骤（1）所述的待测样本基因组DNA扩增，待测样本基因组DNA扩增的条件为：94℃总变性5分钟，94℃变性30秒，59℃下退火90秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后60℃延伸30分钟，得到多重PCR产物，然后在测序仪上对多重PCR产物进行分型，分型使用的是型号为ABI 3730 XL的测序仪进行毛细管电泳检测分型，并利用GeneMapper 4.0对结果进行分析，从而获得亲本和子代各位点的基因型数据，读取个体等位基因大小bp，排成数字基因型矩阵，读取亲本及子代基因型，根据孟德尔定律判断亲子关系。
本发明的一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法利用微卫星标记与多重荧光PCR技术的结合，筛选出了20对高度多态性微卫星位点，组成5组多重PCR体系，通过测序仪分型后对红螯螯虾进行个体识别和亲子关系鉴定，适宜红螯螯虾家系的管理、种群遗传多样性、良种选育和遗传结构的评估方面进行推广应用；本发明的多重PCR反应相对简单的单位点检测，可显著提高实验效率、节省实验费用；且本发明的多重PCR反应体系在在95％置信水平下，可对红螯螯虾达到100％的亲子鉴定成功率。
附图说明
图1为本发明实施例1中红螯螯虾PCR基因分型峰图；
图2为本发明实施例1中亲子鉴定实际累积鉴定正确率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，包括以下步骤；
（1） 红螯螯虾样本DNA提取
选取性腺成熟好的1龄红螯螯虾进行人工催产，建立12个全同胞单对交配家系；收集各个家系的全部亲本个体（共24个）和部分子代个体（每个家系11-12个子代，合计143个），取红螯螯虾个体的附肢，用酚-氯仿法提取待测样本基因组DNA，将待测样本基因组DNA的浓度稀释至25ng/μL；
（2） 红螯螯虾微卫星引物的筛选
根据本实验室提前监检测分析获得的红螯螯虾基因组数据运用
MISA软件筛选四碱基微卫星序列利用Primer Premier 6.0软件设计四碱基微卫星位点引物，并确保目的片段长度存在较大差异（100-500 bp），引物序列送生物公司合成，利用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出20对扩增效果较好的引物，所述引物包括正向引物、反向引物，筛选出20对引物：Cqaa-48、Cqaa-191、Cqaa-218、Cqaa-197、Cqaa-24、Cqaa-181、Cqaa-121、Cqaa-227、Cqaa-22、Cqaa-163、Cqaa-106、Cqaa-185、Cqaa-115、Cqaa-182、Cqaa-240、Cqaa-228、Cqaa-132、Cqaa-211、Cqaa-43、Cqaa-167；
（3） 多重PCR扩增体系的构建
将步骤（2）所述20对引物按照120-200bp、220-260bp、280-340bp、360-420bp、440bp-500bp的区间进行初步分组，然后在不同组中选择3-5对引物，选出扩增清晰的组合，构建多重PCR扩增体系，将每个位点上游引物的5'端进行荧光修饰，获得由20个微卫星位点组成的多组多重 PCR扩增体系；
所述多重 PCR扩增体系为五组，所述多重PCR扩增体系为：2× Multiplex PCRMix 10μL，上下游引物的工作浓度为10 mmol/L，50 ng基因组DNA，补加灭菌超纯水至体系为20 μL，所述多重PCR扩增体系包括第一组、第二组、第三组、第四组、第五组；
（4） 亲子鉴定
基于步骤（3）构建的多组多重PCR扩增体系步骤（1）所述的待测样本基因组DNA扩增，待测样本基因组DNA扩增的条件为：94℃总变性5分钟，94℃变性30秒，59℃下退火90秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后60℃延伸30分钟，得到多重PCR产物，ABI 3130测序仪上进行毛细管电泳分析，检测合格后，然后在测序仪上对多重PCR产物进行分型，分型使用的是型号为ABI 3730 XL的测序仪进行毛细管电泳检测分型，并利用GeneMapper 4.0对结果进行分析，从而获得亲本和子代各位点的基因型数据，读取个体等位基因大小bp，排成数字基因型矩阵，读取亲本及子代基因型，根据孟德尔定律判断亲子关系。图1为本实施例中某一红螯螯虾用ABI 3730 XL进行毛细管电泳检测分型的结果图。峰图比较干净，清晰，没有杂质DNA。
将多重 PCR扩增体系仅包含第二组为组合1；包含第一组和第二组为组合2，包含第一组、第二组、第三组为组合3，包含第一组、第二组、第三组、第五组为组合4，包含第一组、第二组、第三组、第四组、第五组为组合5时，进行亲子鉴定正确性测试正确率如图2，使用单个组合进行亲缘关系鉴定时，第二组的实际鉴定正确率最高，因此将其放在前面，在全部的24个亲本和143个子代中，在95％置信水平下，运用该发明所述的5组多重PCR(20个位点）反应体系，即可达到100％的亲子鉴定成功率。
实施例2
一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，包括以下步骤；
（1）在湖州某养殖场采集32个红螯螯虾养殖个体，使用酚-氯仿法提取每个待测样本基因组DNA，将获得的待测样本基因组DNA测定浓度后稀释至25ng/μL；
其余步骤参照实施例1中，步骤（2）、（3）、（4），使用Genemapper v4.0软件对32个个体微卫星标记的基因型数据进行分析，结果如下：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE002
其中；样本量为32只；Na为等位基因数目；Ho为观测杂合度；He为期望杂合度；PIC为多态信息含量；NE-1P，双亲未知时的排除率；NE-2P，双亲之一已知的排除率；HW为哈迪-温伯格平衡。*表示显著，NS表示不显著，ND表示不确定。
表明，利用本发明的微卫星多重荧光 PCR方法能高效快捷实现红螯螯虾家系的亲子鉴定分析，准确率约为 100%，满足红螯螯虾种质鉴定和家系管理的要求。
本发明的亲子鉴定方法将微卫星标记与多重荧光PCR技术的结合，筛选出了20对高度多态性微卫星位点，建立5组多重PCR扩增体系，通过测序仪分型后对红螯螯虾进行个体识别和亲子关系鉴定，适宜红螯螯虾家系的管理、种群遗传多样性、良种选育和遗传结构的评估方面进行推广应用；本发明的多重PCR反应相对简单的单位点检测，同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率，引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠；且本发明的多重PCR反应体系在在95％置信水平下，可对红螯螯虾达到100％的亲子鉴定成功率。
序列表
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法
<130> 2021
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 547
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 1
atccaccagg aggcctggtc tcagaccggg ccgcgggggc gttgaccccc ggaactctct 60
ccaggtaaac aacattgtat tgtactgtat tgcattgtac tgtattgttc tgtattgtat 120
tgtattatat tgtactatat tgtgatgtat cgtactgtat tgtatcgtag tgtattgtat 180
aataaattaa taagttaata aataaataaa taaataaata aataaataaa tataattata 240
tggggtaggt tgtagagtaa gttagaagag agatgtttgt ttatgttgat ggttgctatg 300
gtgttgctag ggaagcgtca cactcactat tatggtcctc tgccaccatg acaaatattc 360
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<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
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<211> 547
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 5
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ccactacaga tttatacact ctcaatgtca tcctattttg tttcagcctc tctacatgtc 540
cgaacca 547
<210> 6
<211> 635
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 6
tccaggcgac gttgtcacgt gtcacccaag aaagttaaca aagtgaaaca aatgtgtgac 60
cagtgaaacg aatatagcga atagggtaca ttatatatcg agaagaaacg gaggtggatc 120
tacgccagga catcacaatc agtgaagagg cggggccagg agctatgaat cgacccctgc 180
aatcacaaat aggtgagtac acatacactc tcactcactc actcactcac tcactcactc 240
actcactcac tcactcactc actctcctcc ttgtatcatt actgcctttt ctcggaaaat 300
ttgacgaatg atgaaattga attatggctt aggtagtaga attgaagaag gatgaagtga 360
aggcaaggtc agggagagtg tgatgtagag ggagcagagt ggcgtagagg gagcagagtg 420
gtgtagaggc agcagagtgg tgtagaggca gcagagtgat ttagaggaag cagagtgatt 480
tagagggagc agagtgattt agatggagca gtgtgattta gagggagcag agtgatttag 540
agggagcaga gtgattcaga gggagcagag tgattcagag ggagcagagt gattcagagg 600
gagcagagtg atgtagaggg agcagagtga tgtag 635
<210> 7
<211> 846
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 7
ataagtttac aataatttaa taataaataa acacaatgaa atatattttt ttcgttaggt 60
tgaaaatgat ttttgagaaa ttattgcata cacaaatttt cgcttgcctt attcggcaag 120
aagagcattg ctatttaagc caaaaatctc aagtttgacc tattcggcac gacatgtata 180
tatgtagcaa aatttagcta aaaataaatt acgttaaatt gtaaggttag gtgagatgtc 240
taaattagag tagtccccat tttttttaca ccattgtcaa tgaaaaaatt acatccatct 300
gtaatttcaa tttttgcggg gaagttaatt ttttaaggta gttcggcctg ttctgcaagt 360
tcgacataat acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat acatacatac 420
atacacaccc acataggaat caagaaatat tgcagtgatg ggtaggaaac aattcagtat 480
tgtgagcgag aatggaactt gatcctggtg attccaggat caccaggatc tgaactattt 540
actttgtgct gtgagctgaa gtgtcagcca tagtaattcc tatacactgg gtaagctaag 600
gtgtcagccg gtgtagctcc aatacactgg gtaaactgtt gtgtcagcta gtgtagtttg 660
aaatcagtgg ctgagctgat gtgtcagcta gggtagttcc cacactctag aaaagttgat 720
gtgtcagcca ggggagtcgt tacacacttg atgaattgat gtgtcagcca gggtaataac 780
tagaacagag tatactacag actctggcca tacaatagag cggaaaaata atgtaaggga 840
cctggg 846
<210> 8
<211> 392
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 8
tcagacctgt cttgattatc ctaattgcat gagcctcctt taatgactga tgttcatcat 60
catcatcatt atttgataat gtgctccgat acatgcaact ttcttccatt tgaaaataaa 120
aatatttatg attctccgcc ctctcactct ctctatctcg agattatata tatatatatc 180
tcgagataga cagacagaca gacagacaga cagacagaca gacagacagg aacaaagaaa 240
gacaagcaca gagagagaga gagagagaga gagtgagagg gaggggattc ataaatattt 300
tttttcactc gctccagttt ctgaaaaaaa tatgctaatg acaggagact gggaaagttc 360
atgtgaaggg aaggaagttt gaatcttcat ta 392
<210> 9
<211> 604
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 9
tttttttcat taggttcaga gtgatttttg cgaaattatt gcatacacaa attttcgctt 60
actcttattg ggaaagaaga gcgttgctat ttaagccaat attgcaagtt ttaccagtga 120
tgtaatgata tatcatacag acagataatt caagttaaaa attacttata tatgtacata 180
catacataca tacatacata catacataca tacatacata catacataca tacatacata 240
cacataaaat atgaatggga cgaaatactc aagtaaacga tcccaaacgc atttgaaaaa 300
ttggttaagt ctcctgaagc agtgttcatc tctttcgtaa tttgatggtt gagtggaagg 360
gtgctaacca ggcagtagtt cgacccccgg gggaggtgtg ggtggtgaaa ctaatgacac 420
agtccacttg taagatgcgg aagaaaaatt gtagaagtta atggaagatt ttggaagaga 480
gtgtgagata atgaaactga acgtgaacac agaaaagagc aaggggagag aatgtgtatt 540
tagttggttt tttttttttt gtggttttat tttcattttt catttgtgtg tacctactga 600
tttg 604
<210> 10
<211> 847
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 10
acctaacatc aaatcataac accagcatca ataatgatct tttagctcca ctcacaacat 60
ttctgtttat ataatttatg ttcccactgg taccttgaac tctctctcac cccctctctc 120
actctctctc atcccctctc attgtttctc acagtaacca ctgccagaac atcggtaatt 180
gacatgttta cacatcttga tttgcagaag tttccgtctt tgtgattctc actaacaatt 240
cccattttgg caaatctcta aatatttatc caggggtgga aatttaaggt tcatttgtct 300
ttcattataa attataacaa caatggaaat aagtcactct gtctgacttt tttgggttat 360
cccaggttct ctacacatat gctgctatgt atgataattc tatgtaacta tatttgtgta 420
tacctgaata aacttactta cttacttact tacttactta cttacttact tatcatataa 480
caggtgatga acggggttat atcatgttat attacgattt gacatactga gtagctaaag 540
atatatcgat atgacgacag gaaaacggaa gacaggtgct gtagagcacg ctcgtgttgg 600
caagaaataa ttcgctctgt gtagagcttt attaggactt gataaagctc tatagagctt 660
cactaggatt tgataaagct ctacagagct ttactatgac ttgataaagc gctacagact 720
cacagagctt cactaggact tgataagact ctatagagct tcactaggac ttggtaaagc 780
tctatagagc ttcactggaa ctcgataaag ctccacgagc ttcactagaa cttgataaag 840
ctctacg 847
<210> 11
<211> 604
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 11
tttctactct ggctgggaat cgaacccagg ccctcaccgt gtgaagcgag agcgttaacc 60
accaggccac ctaacataat acaccattct agtgattaca cagcaacaca gtaatgacca 120
cataacctgt ctttgtaata ctcatttgta ctaaattgtt atctgtttac aataattttt 180
gtaccactga atatatcatt gcttagttaa tcttaagtta atgttaatcc tgcccataat 240
gccctgcata caagtggctt tggcatgttg cactttaaaa attgtattcc ttgtacttct 300
ctgtatcatg ttcaaataaa taaataaata aataaataaa taaataaata aataaataaa 360
ggaagtgtca gtagcccctc aacagtcata ccaacacatt aaggcaaggc ggtctgatta 420
ttactgtggt gtcatgtacg gtgtcggatg tatatatctc gtattaacat tacataccac 480
ggattttcgt gctcgttagt acataaacga atgtctttca aacacttctt atatcgtatt 540
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agcc 604
<210> 12
<211> 560
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 12
tggttcaatt acccgccatt agcaaggata ttgcagcaga gatgatttct ttgtaagggg 60
acaactttaa tcagtatgca aattgctgtg tacaatacag aacttagagg gagaccaggg 120
atataaaaaa aacaatatct ctacttatga aaaatatgga aaatggaaaa ctgtggcctt 180
gcgcgttgat caatgatgag agagagagag agagagagag agagataaag agagacagac 240
agacagacag acagacagac agacagacag acagacagac agacagacag actaacagag 300
acagacagac cgattgcatt aacatttgca tctaagaaaa cagaaattat ggtctctagg 360
cgcaatgatg gtaatgtcag tgcagtagta agtatgaatg ggagaatgtt agtacttggg 420
gaagaagttg atatccttgg ggtgaaattt gactccaaac tgtccatgaa gaaccacgtt 480
gtaaattttg caaacaaggc agccaggaag cttacagcac ttcgacgtat cttgcatctg 540
cttgacagta ggggttgcaa 560
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<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 13
ggtgtccaca ccatatctca ttctatgatt ctattccact attacttccg tatatattct 60
gcactgtgag aatatcatca taatatttat gccacgtcta tttaaaatct tagcatttct 120
ttcatgtatg accatcctat ttatggtcct aagaatgggt ggtgttggta gcataccaaa 180
gtatatcata cgccttaata cccattctaa tactgtgagc tctctctatc tctctctcta 240
tatctatcta tctatctatc tatctatcta tttatctatc tatctatcta tctatctatc 300
tatctatcta tctatctatc tatttatcta tccatcttca ccatttttcc agtagctgac 360
taagctttat gagatcaaat aatttacttt ttgaatctct gtttggcctc aaagtcgcag 420
ccgctacaac atcgtggtga tgcgtcacta gatatgtgt 459
<210> 14
<211> 547
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 14
agtactggtc tcagtactga cccttgtgga acactgtgac ctcataccca cacctcttct 60
ctggtagttt ctcgttaaat attccatgat atactgtagt gccatccctg ttattcctgc 120
cacctcctct agcttttgat tcagtctctt ttgaggcgct gtattcatca tgcatgatag 180
actgatggaa tttctggtgt cagtctctct agtatcaagt caggttcatt tgaagatctt 240
ttcgcattat caaagtgctt gtgcacactc ggagttgtaa tttacttaag taagtaagta 300
agtaagtaag taagtaagta agtaagtaag taagtaagta attttattca ggtatatcag 360
ttttatcatg ctattgaagg tcaatgtgaa agagtatcca caagtgaagc actttgactt 420
tactgtctac gatactacca tacctgtctc tggcttttaa aacggtttag tttaatatct 480
tctaatgcac cccataccca tcctgtgggc ggtagtcacc ccatacccat cctgtgggcg 540
gtagtca 547
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<211> 752
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 15
gttaagggaa attggcctga cgatcctgaa ggacaggaca gttaggggag acatgataaa 60
gacatacaaa atactgccaa gaattgacaa ggtggacaga gacaggatgt tccagagatg 120
gaacacggaa acaaggggtc tcaattggaa gatgatgagc cagatgagtc aaatggatgt 180
taggaagtat atctttagcc acagagttgt caggaagtgg aatagtctga caagtgacat 240
aatggaggca ggaaccctac atagttttaa gacgaggtat gatgaaggtc atagaacaag 300
gagagagagg cccaagtagc gatcagtgaa cagccggggc caggggctat gaatcgaccc 360
ctgcagccac aaataggtga gtacatacat acatgaagtt gaataatcta gagtgatatg 420
gtggaggcaa gatccataca aagctttaag aagaggtaca ataaagttca tggagcaggg 480
agagagtgaa cctagtagcg accagcgaag agacggggcc aggagctgtg attcgactcc 540
tgaaaattac aaacaggtga gtacatacat acatacatac acacatacat acatatacat 600
acatacatac atacatacat acatacatac atacatatac atacataccg ttttgcgtgc 660
cgatctgcct tcctctctac cttcatacct ggtcaccttc ccatgtgcct gccagaaaac 720
ttgcctgcat tcatgaatac ctacctgctt gc 752
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<211> 680
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 16
taaacaggaa taaacagcac accgtcacac aagaactcaa gaacaacaaa acgaccctaa 60
ctggagacct tcagcagatc ctcccgaaaa ggctagactc ccaatttact gaaactgagt 120
tcagcaattc cagtctttaa acgttgatag tgtgtagatg ccaaaacaat gtaggtcgag 180
agatgaactc gggaccagag atatagagag tgtctccacg acacataacc tctgaaaaag 240
ttaaatatca ctaagtctaa ataatgcttt gttaagcaag taacacaaag ttacgagtgt 300
tttgtcccag atcaccattg gagacattct cttccaaaac agactctaaa caacatgagc 360
tgaggagaac agcattctcc cagacaaagc agagatgaag gtgtttccac cacgagagag 420
agagagacag acagacagac agacagacag acagacagac agacacagac acagacagag 480
aaagacagat agagacagaa agaagcaagg cctgcagata caacgtggag ttcttgtacc 540
agctggagcc tggaatgaat tacaaaccaa gcaagcaggt agttagcagc gttggcagcc 600
ttcagaactc tccaccaacg agcacaatga gagatgtagt tgctacctcc tacttactta 660
cattagataa taacgtaagt 680
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<211> 616
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 17
atttcctctc tcacagtttt gttgtttttc tcttcataaa acctgttatt ctctgtttat 60
cttatttatt ttccccttcc tttaattcct ccctcccatc ttctctctca cttttacaca 120
gggtttgaca aggttaggtt aatgatccct agctttattg acaagctatc tatctatcta 180
tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatatgtcta tcaatttatc tctctccctc 240
tctccctttc tccatcacac tttcctcctt cccctctcct tctctacttc cctctttccg 300
ccctcctttc cttcccttca tttattcata tgcttttttt tttaacaggg tttgacaagg 360
ttaggttaag gatctctagc tatttacagg taaaggattt ctaactttat tgagaagcta 420
agagctgtta cctacatcag ctcatttgaa agcatttgaa agtaccattt gtggcaccag 480
ggcgtcttag caaaacttca agctctggga attgcaggct ctacgctatg acgcctcagt 540
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cctattgggg caagtg 616
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<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 18
gagttgtact cagagagttg tactcacata gttattgttc acagagttgt gctcactgag 60
atgtacccac gtacctgcat ctcagttcct ggccccatct cttaacttgt aactgacgga 120
tgttcatggc tcccaacctc ttgggcttga tcatacttac tcgtcaaact gtgcaggaaa 180
tttgcttcac gctactttat tcaggtcacc cagcttcttt tttctcgttg tatatacctt 240
tcctaaagaa gtatttcatg aagtccctgt actttttctt cggtgtttat ctttctctgc 300
ttctttcttc tcgtccttcc catgtcactt tctccttaac taccttgtta actcattgaa 360
gtattttgca tggtgtggtc atatctcctc ctgaattgat tctcatacat ctcatatgtc 420
tctgtctgtc tgtctgtctg tctgtctgtc tgtctgtctg tctctcgctc tctctctctc 480
tctctcttca taataacgcc ataaattagg cacaatgtat aaaatatacg cctatatttt 540
tatcagatac ctggaaatac atccacagta tttctgccgc ccaggtgaag ctgcttcacc 600
acataaaaat tccatacaca aagggttgga gaattttttt ttgcactgga gtgatcaaaa 660
cagaggatcc gatacccttt tagggtaacg gactgaggca gagtctcagt gttagagtct 720
ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 760
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<211> 401
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 19
gatcctctca gaatagatca atcccaagca ggtgttgggg aaggcgaggc acccacggtg 60
atcactagac ctaagctgta aaaactgacc cctctagtgg cagaatactt taacgtaaaa 120
tgcttcacag aatgtagagg taaatagata aatagataga cagatagata gatagataga 180
tagatagata gatacataca tacatacata catacataca tacatacata catacataca 240
tagagagaga gagagaaaga gagaaataca tgagataatg taactagcac atgagataaa 300
tgtaactacc ataggaggga aatacaaaga gtgaaaaaga gacgcctcag taaactcaga 360
gatctctagc acaagactcg tctccctcac aactgatctc t 401
<210> 20
<211> 1032
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 20
tgtaggcgaa acgtttcata ataaagatac ctaactgttg catatgtgtc ttacctaaca 60
aggttaggta agtttcctaa ggttttcttg gtaaaaaatc attaattttt atattaacat 120
attcagacat acctaattca cctaactgtg attgcaggcg tcatagctcc tggccctgcc 180
ttttcattgg tcgctactat gtccactctt tccctgctct atgagcttta tcccctcaag 240
gaaggttcct tgatgttggt gaggggctct tgatataggg aattggatct gtgctccagt 300
tccccgaatt aagcctgaat gccttccacc ccccccaggc gctgtataat cctccgggtt 360
tagcgcttcc cccttgatta taataataat aatctatgag ctttatcata gctcttctta 420
aatctatgtg tggatcctgc ctccattaca tcactctcca gactattcca tttcttgaca 480
cctctgtgac tgaagaaata cttcctaata tccctttgac tcatctgcgt cttcaacttc 540
cgtgtccgtc tgtgcgtctt caacttccgt gtccgtccgt ccgtccgtcc gtccgtccgt 600
ccgtccgtcc gtccgtccgt ctcctagtaa tgcttgtaac ggcctctgtg tccatttaca 660
taaccttttg tcgataattt taccattatt acaaatgaag tcgtatcgct tgtttgttgc 720
cataagcatc caaggttctg gagtgggggc cactggctgt gcctccaatt caacaaggct 780
ccaagttgat ggaatatttt tttcatatcc ttacattttt cctattcctg gaactaaaat 840
atatcttgct attattaaat ggttgttgct actatggtta gtttcccaag gttagtggag 900
tctgtacctc ccggtccttc tcaggtggca tgaaggccag tttgtactgt gccatttttt 960
gtgaattgat gtacatatag gacatttcgg ggtgcaaaaa tttacaggag atagaacgaa 1020
acactacttg gg 1032

Claims (7)

1.一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤；
红螯螯虾样本DNA提取
取红螯螯虾个体的附肢，用酚-氯仿法提取待测样本基因组DNA；
红螯螯虾微卫星引物的筛选
根据本实验室保存的红螯螯虾基因组序列，利用MISA软件筛选四碱基微卫星序列后，利用Primer Premier 6.0软件设计微卫星位点引物，筛选出20对引物：Cqaa-48、Cqaa-191、Cqaa-218、Cqaa-197、Cqaa-24、Cqaa-181、Cqaa-121、Cqaa-227、Cqaa-22、Cqaa-163、Cqaa-106、Cqaa-185、Cqaa-115、Cqaa-182、Cqaa-240、Cqaa-228、Cqaa-132、Cqaa-211、Cqaa-43、Cqaa-167，多重PCR扩增体系的构建
将步骤（2）的20对引物按照120-200bp、220-260bp、280-340bp、360-420bp、440bp-500bp的区间进行分组，然后在不同组中选择3-5对引物，选出扩增组合，将每个位点上游引物的5'端进行荧光修饰，获得多组多重 PCR扩增体系；
亲子鉴定
基于步骤（3）构建的多组多重PCR扩增体系将步骤（1）所述的待测样本基因组DNA扩增，得到多重PCR产物，然后在测序仪上对多重PCR产物进行分型，读取个体等位基因大小bp，排成数字基因型矩阵，读取亲本及子代基因型，根据孟德尔定律判断亲子关系。
2.根据权利要求1所述的一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，所述多重 PCR扩增体系为五组。
3.根据权利要求2所述的一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，所述多重PCR扩增体系包括第一组、第二组、第三组、第四组、第五组，第一组、第二组、第三组、第四组、第五组的引物组合。
4.根据权利要求3所述的一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，所述样本基因组DNA扩增的条件为：94℃总变性5分钟，94℃变性30秒，59℃下退火90秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后60℃延伸30分钟。
5.根据权利要求4所述的一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，步骤（1）还包括将所述待测样本基因组DNA的浓度稀释至25ng/μL。
6.根据权利要求5所述的一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，步骤（4）中所述分型使用的是型号为ABI 3730 XL的测序仪进行毛细管电泳检测分型，并利用GeneMapper 4.0对结果进行分析，获得亲本和子代各位点的基因型数据。
7.根据权利要求6所述的一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，所述多重PCR扩增体系为：2× Multiplex PCR Mix 10μL，上下游引物的工作浓度为10 mmol/L，50 ng基因组DNA，补加灭菌超纯水至体系为20 μL。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042843A (zh) * 2022-09-26 2023-05-02 华中农业大学 一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法
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CN117802244A (zh) * 2023-12-21 2024-04-02 中国水产科学研究院珠江水产研究所 鉴别红螯螯虾遗传多样性的微卫星标记、引物及其应用

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