CN116004785B

CN116004785B - 鉴别鲮性别的分子标记、引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN116004785B
Application number: CN202211273634.5A
Authority: CN
Inventors: 刘海洋; 赵建; 夏威威; 陈昆慈; 欧密; 罗青; 费树站
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2022-10-18
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2042-10-18
Also published as: CN116004785A

Abstract

本申请涉及鲮性别检测技术领域，本申请公开了一种鉴别鲮性别的分子标记、引物组、试剂盒及方法。该分子标记为鲮雌雄差异的DNA序列，所述DNA序列选自SEQ ID NO.1～5所示至少一项以及对这些DNA序列进行扩增的引物组。该鉴定鲮性别的方法包括：取待检鲮的基因组DNA样品；以基因组DNA为模板，采用引物组中的至少一对引物进行PCR反应；进行凝胶电泳以检测PCR反应产物以鉴别待检鲮性别。本申请实施例提供的鉴别引物、试剂盒及方法不受个体发育时期、环境的影响，性别鉴定简便快捷，对样品的要求低，鉴定结果准确性高，从而克服其他方法操作较繁琐、耗时较长等缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。

Description

鉴别鲮性别的分子标记、引物组、试剂盒及方法

技术领域

本申请涉及鲮性别检测技术领域，具体涉及鉴别鲮性别的分子标记、引物组、试剂盒及方法。

背景技术

鲮(Cirrhinus molitorella)隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，野鲮亚科(Labeoninae)，鲮属(Cirrhinus)，俗称土鲮、鲮公、雪鲮、花鲮，分布于我国华南地区和东南亚，是南方重要的经济养殖鱼类之一。鲮饲源广、抗病力强、产量高及适应水体广，是华南一带池塘主养品种，在华南地区鲮与草鱼、鲢、鲮合称“四大家鱼”。鲮肉质鲜嫩、味道鲜美、价格实惠，是市场的热销水产品。鲮也具有极高的食品加工价值，如驰名中外的豆豉鲮鱼罐头，鲮鱼饼，鲮鱼丸，鲮鱼皮等产品，在市场上深受消费者的喜爱。此外，鲮鱼是我国南方重要的休闲游钓鱼类，鲮中钩时会向前冲，具有超强爆发力，产生的刺激手感吸引了广大钓友。在人工繁育及选择育种过程中，为了获得优质的苗种必须做好亲鱼的雌雄筛选，为了建立家系，必须能准确鉴定鲮的性别。在养殖过程中，鲮第一次性成熟需要3-4年，在性成熟前无法通过外观形态鉴定其性别，性成熟个体也只有在繁殖季节通过其所产配子类型才可准确鉴定其性别，极大限制了鲮人工繁育和良种培育进程。开发鲮性别特异分子标记，建立快速鉴定鲮遗传性别的分子方法是控制雌雄亲本性别比例、鉴定性染色体、研究性别决定和性染色体进化机制的重要手段，对鲮的养殖和育种具有重要的意义。

目前，鲮仍然没有明确的性别决定机制报道，尚未确定是否存在异形性别染色体，无法从细胞学角度鉴定其遗传性别。在鲮胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上几乎没有区别，因此性成熟前的阶段无法通过外表形态鉴定其性别。这些问题的存在给育种、养殖及相关的遗传学基础研究带来很大的困扰，尤其是性别决定分子机制研究。鲮性别特异分子标记筛选和遗传性别鉴定研究，不仅对鲮遗传学相关的研究，而且对开展单性育种与养殖从而提高鱼产量、增加水产养殖收益都有着非常重要的意义。然而，目前国内外尚未见鲮性别分子标记的报道。因此，开发一种可以准确鉴别其遗传性别的分子标记，发掘鲮性别特异分子标记，利用分子生物学方法准确分辨、且可以在养殖场现场应用的鲮遗传性别快速鉴定的分子技术成为鲮养殖产业中亟待攻克的重要课题。

发明内容

本发明通过鲮雌、雄鱼2b-RAD简化基因组测序结合鲮雄性全基因组测序和通过生物信息学分析，筛选了鲮雄性特异的DNA序列，并设计性别特异分子标记应用到鲮遗传性别鉴定。

为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：

第一方面，本申请实施例公开了一种鲮雌雄差异的分子标记，所述分子标记为鲮雌雄差异的DNA序列，所述DNA序列选自SEQ ID NO.1～5所示至少一项。

第二方面，本申请实施例公开了用于扩增第一方面所述的分子标记的引物组，所述引物组包括：

用于扩增如SEQ ID NO.1所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.6～7所示；

用于扩增如SEQ ID NO.2所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示；

用于扩增如SEQ ID NO.3所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ IDNO.10～11所示；

用于扩增如SEQ ID NO.4所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ IDNO.12～13所示；

用于扩增如SEQ ID NO.5所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ IDNO.14～15所示。

第三方面，本申请实施例公开了用于鉴别鲮性别的试剂盒，包括第二方面所述的引物组。

第四方面，本申请实施例公开了一种鉴定鲮性别的方法，其包括如下步骤：

取待检鲮的基因组DNA样品；

以所述基因组DNA为模板，采用第二方面所述的引物组中的至少一对引物进行PCR反应；

检测所得PCR反应产物以进行凝胶电泳，若PCR反应产物中不存在第一方面所述的分子标记的DNA序列任一所述的目标条带，则对应待检鲮为雄性；否则对应待检鲮为雌性。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：

本申请实施例提供的鉴别引物、试剂盒及方法能够以基因组DNA为模板，通过简单的PCR和电泳结果就能够对鲮进行性别鉴定，在雄性个体中扩增出特异DNA条带，而在雌性个体不能扩增出目的条带，缩短了准确鉴定鲮遗传性别的时间。检测方法适用于养殖场简易环境内鲮遗传性别的鉴定，节约了检测时间和成本。本发明检测鲮遗传性别的方法，对鲮亲鱼繁育、家系建立及控制养殖群体的雌雄性别比例，推动鲮养殖业可持续健康发展具有重要意义和应用价值。

本申请实施例提供的鉴别引物、试剂盒及方法不受个体发育时期、环境的影响，性别鉴定简便快捷，对样品的要求低，鉴定结果准确性高，从而克服其他方法操作较繁琐、耗时较长等缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。本申请实施例提供的鉴别引物、试剂盒及方法成本低、操作简单、快速、准确，并适合于推广应用。

附图说明

图1为本申请实施例提供的采用五个引物对分别对9个雄性鲮DNA样本和9个雌性鲮DNA样本的检测凝胶电泳图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为建立迅速鉴别鲮的方法，应缩短鲮亲鱼繁育、家系建立及控制养殖群体的雌雄性别比例的时间，减少成本，本申请发明人利用2b-RAD测序结合鲮基因组测序，通过生物信息学分析筛选到鲮雌雄差异的DNA片段(SEQ ID NO.1～5)，建立了鲮遗传性别鉴定方法，采用该方法可以快速、准确的鉴别鲮遗传性别。

在一些鲮雌雄差异的DNA片段的筛选实施例中，对一尾雄性鲮进行基因组DNA提取，对一尾雄性鲮进行基因组DNA提取，构建插入片段大小为300～350bp的测序文库，采用Illumina平台进行全基因组测序，然后使用SOAPdenovo v2.04软件进行基因组从头组装，获得鲮雄性全基因组序列。构建测序文库并进行全基因组测序，然后进行基因组从头组装，获得鲮雄性全基因组序列；提取雌雄鲮基因组DNA，按照2b-RAD方法进行测序文库构建与测序，测序深度至少达到10×；对测序数据进行过滤之后，将2b-RAD序列比对到鲮雄性基因组中，筛选雄性2b-RAD序列特异比对区域，并提取该区域上下游DNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO:1～5所示。

为验证在鲮雌雄差异的DNA片段(SEQ ID NO:1～5所示)作为其性别鉴别的分子标记的可能性，本实施例还公开引物组，包括用于扩增如SEQ ID NO.1所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.6～7所示；用于扩增如SEQ ID NO.2所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示；用于扩增如SEQ ID NO.3所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示；用于扩增如SEQ IDNO.4所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示；用于扩增如SEQ ID NO.5所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示。

进而，本申请实施例还公开了其性别鉴别的试剂盒，其包括上述引物组。优选地，该试剂盒还包括DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTP、PCR Buffer以及无菌水中的一种或多种。其中，DNA聚合酶选自DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ、DNA聚合酶Ⅳ和DNA聚合酶V，例如Taq聚合酶或rTap酶。在一些实施例中，该试剂盒还包括包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为含有雄性鲮基因组DNA的液体制剂，所述阴性对照品为含有雌性鲮基因组DNA的液体制剂，以便于对待检测样本进行性别区分和甄别。

基于此，该性别鉴别试剂盒能够对鲮性别进行鉴定，其检测原理是利用上述引物组和/或试剂盒对鲮的基因组DNA样本进行PCR扩增，并更加扩增产物进行鉴定。具体的，本申请实施例还公开了一种鉴定鲮性别的方法，其包括：

(1)取待检鲮的基因组DNA样品；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求2所述的引物组中的至少一对引物进行PCR反应；

(3)检测所得PCR反应产物以进行凝胶电泳，若PCR反应产物中不存在如SEQ IDNO.1～5任一所述的目标条带，则对应待检鲮为雄性；否则对应待检鲮为雌性。

在一些实施例中，步骤(1)中的待检鲮的基因组DNA样品，为从待检鲮的血液中分离及提取的基因组DNA液体样品。其基因组DNA提取方法可以CTAB(hexadecyl trimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取。

在一些实施例中，步骤(2)中所述PCR反应的反应体系以25μL计包括10×PCRBuffer、50ng/μL的基因组DNA 1μL、0.2～0.4μM的上游引物、0.2～0.4μM的下游引物、0.2～0.4mM的dNTP 0.8μL、0.025-0.05U/μL的DNA聚合酶0.75μL和余量的双蒸水。在一些实施例中，该PCR反应的反应体系以25μL计包括10×PCR Buffer、50ng/μL的基因组DNA 1μL、0.4μM的上游引物、0.4μM的下游引物、0.4mM的dNTP 0.8μL、0.05U/μL的rTap酶0.75μL和余量的双蒸水。

在一些实施例中，步骤(2)中所述PCR反应的反应程序包括如下子步骤：①94-95℃、3～5min，②94-95℃、28～35s，③53-63℃、28～35s，④72℃、28～40s，⑤72℃、5～15min，其中，子步骤②～④为30～40个循环。在一些实施例中，反应程序中③步骤的温度为50～54℃。在一些实施例中，所述PCR反应体系中，若为扩增出所述如SEQ ID NO.1所示的目的条带，其PCR反应程序中③步骤的温度为54℃；若为扩增出所述如SEQ ID NO.2、3或5中至少一项所示的目的条带，其PCR反应程序中③步骤的温度为52℃；若为扩增出所述如SEQ IDNO.4中所示的目的条带，其PCR反应程序中③步骤的温度为50℃。

在一些实施例中，步骤(3)中，对所述凝胶电泳的结果进行判断的步骤还包括：若所述目的条带携带有如SEQ ID NO.1～5中至少一项，则对应待检鲮为雄性。例如，若目的条带仅携带有如SEQ ID NO.1～5任一大小的条带，则可判定对应待检鲮为雄性。又例如，若目的条带仅携带有如SEQ ID NO.1～5中两个及以上大小的条带，则可判定对应待检鲮为雄性。如图1所示，在一个实施例中，分别采用引物对CmlS-5引物(SEQ ID NO.6～7)、CmlS-6(SEQ ID NO.8～9)、CmlS-9(SEQ ID NO.10～11)、CmlS-11(SEQ ID NO.12～13)和CmlS-12(SEQ ID NO.14～15)得到的PCR扩增扩增产物的凝胶电泳图，可知对应的目的条带大小分别为256bp、427bp、333bp、264bp和327bp，分别将目的条带回收，送生物公司测序，分别与SEQ ID NO.1～5所示序列相一致。而且，对应的携带有目的条带的样本均为雄性鲮，雌性鲮中均不见目的条带，由此说明，本申请实施例提供的引物组、试剂盒及性别鉴别方法均能够准确对鲮性别进行鉴别。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种鲮雌雄差异的分子标记，所述分子标记为鲮雌雄差异的DNA序列，所述DNA序列选自SEQ ID NO.1~5所示至少一项。

2.用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物组，所述引物组包括：

用于扩增如SEQ ID NO.1所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.6~7所示；

用于扩增如SEQ ID NO.2所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.8~9所示；

用于扩增如SEQ ID NO.3所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示；

用于扩增如SEQ ID NO.4所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示；

用于扩增如SEQ ID NO.5所示序列的上下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.14~15所示。

3.用于鉴别鲮性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTP、PCRBuffer以及无菌水中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为含有雄性鲮基因组DNA的液体制剂，所述阴性对照品为含有雌性鲮基因组DNA的液体制剂。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为rTap酶。

7.一种鉴定鲮性别的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

取待检鲮的基因组DNA样品；

以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求2所述的引物组中的至少一对引物进行PCR反应；

检测所得PCR反应产物以进行凝胶电泳，若PCR反应产物中不存在如权利要求1所述的分子标记的DNA序列任一所述的目标条带，则对应待检鲮为雌性；否则对应待检鲮为雄性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系以25µL计包括10×PCR Buffer、50ng/μL的基因组DNA 1μL、0.2~0.4μM的上游引物、0.2-0.4μM的下游引物、0.2~0.4mM的dNTP 0.8 μL和0.025-0.05U/μL的DNA聚合酶0.75μL；和/或，

所述PCR反应的反应程序包括如下子步骤：①94-95℃、3~5min，②94-95℃、28～35s，③53-63℃、28~35s，④72℃、28~40s，⑤72℃、5-15min，其中，子步骤②～④为30~40个循环。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，

若为扩增出所述如SEQ ID NO.1所示的目的条带，其PCR反应程序中③步骤的温度为54℃；

若为扩增出所述如SEQ ID NO.2、3或5中至少一项所示的目的条带，其PCR反应程序中③步骤的温度为52℃；

若为扩增出所述如SEQ ID NO.4中所示的目的条带，其PCR反应程序中③步骤的温度为50℃。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对所述凝胶电泳的结果进行判断的步骤还包括：若所述目的条带携带有如SEQ ID NO.1~5中至少一项，则对应待检鲮为雄性。