CN114395635A - 罗氏沼虾生长性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括序列表中序列1～3所示的核苷酸序列。将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种，其通过提取待测罗氏沼虾基因组DNA进行PCR扩增以及PCR扩增产物纯化，然后对得到的产物进行测序，确定所述的SNP分子标记的基因型，从而选择在生长性状方面具有优势的基因型个体进行罗氏沼虾品种育种。本发明利用所述SNP分子标记作为罗氏沼虾生长的功能标记，用于选育具有优秀生长性状的罗氏沼虾品种，可以有效节约生产成本，进一步提高罗氏沼虾的经济价值和养殖推广价值。

Description

罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于罗氏沼虾育种技术领域，具体涉及罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）是长臂虾科、沼虾属动物。个体大，最大雄性个体的体长可达400mm，养殖1年通常可达到150～200mm。罗氏沼虾从幼虾到成虾阶段生活在淡水中，成熟的亲虾在淡水中交配、抱卵，在咸水中排苗，幼体在咸水中发育。罗氏沼虾属杂食性动物，不同的生长发育阶段，主要以水生昆虫幼体、小型甲壳类、水生蠕虫、其他动物尸体以及有机碎屑幼嫩植物碎片等为食物。罗氏沼虾因其具有个体大、肉质好、养殖周期短等优点，是目前我国重要的养殖虾类。为了能够进一步提高罗氏沼虾的经济价值和养殖推广价值，针对罗氏沼虾的优良品种选育已经成为研究人员关注的重点。

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP具有数量多、分布广泛、代表性强、遗传稳定性好、便于高通量、高度自动化的检测分析等优点，其已广泛应用于动植物遗传谱图的构件、QTL定位和功能基因的分析，有效地促进了分子标记辅助育种，但是少有将SNP应用于罗氏沼虾品种选育的报道。

发明内容

针对上述不足，本发明公开了一种罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记及其应用，利用所述SNP分子标记作为罗氏沼虾生长的功能标记，用于选育具有优秀生长性状的罗氏沼虾品种。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记，其包括分子标记A、分子标记B和分子标记C；

所述分子标记A具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列（即基因insulin-likeandrogenic gland hormone的核苷酸序列），序列1所示的核苷酸序列中c.863碱基处的碱基为T或C；

所述分子标记B具有如序列表中序列2所示的核苷酸序列（即基因transforminggrowth factor-beta-induced protein的核苷酸序列），序列2所示的核苷酸序列中c.194碱基处的碱基为A或C；

所述分子标记C具有如序列表中序列3所示的核苷酸序列（即基因Myosin heavychain的核苷酸序列），序列3所示的核苷酸序列中c.1101碱基处的碱基为T或C。

上述罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记的应用，将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种，其通过提取待测罗氏沼虾基因组DNA进行PCR扩增以及PCR扩增产物纯化，然后对得到的产物进行测序，确定所述的SNP分子标记的基因型；当分子标记A的基因型为CC基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种；当分子标记B的基因型为CC基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种；当分子标记C的基因型为TT基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种。

在上述PCR扩增以及PCR扩增产物纯化过程中，用于检测上述罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记的引物组，其包括引物组合A、引物组合B和引物组合C；

所述引物组合A用于检测所述分子标记A，其包括以下引物：

上游引物A：CTTTGACTGCGGCGACAT（序列表中序列4）；

下游引物A：GGAGAACGGGTAATGATGAA（序列表中序列5）；

所述引物组合B用于检测所述分子标记B，其包括以下引物：

上游引物B：CACCGCTATAAGTGCCAACA（序列表中序列6）；

下游引物B：TTGGCGATGATGTCGTGTTTC（序列表中序列7）；

所述引物组合C用于检测所述分子标记C，其包括以下引物：

上游引物C：AAGCCCTACGACCCGAAGAAGT（序列表中序列8）；

下游引物C：AGGGTGCGGTTAGACTCAT（序列表中序列9）。

将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种的方法，其包括以下步骤：

（1）DNA提取：取待测的罗氏沼虾个体，采集其肌肉组织进行基因组DNA的提取；

（2）PCR扩增：将步骤（1）中提取得到的基因组DNA作为模板进行PCR扩增得到PCR扩增产物；所述PCR扩增的反应体系总体积为30μl，其中包括1μl或2μl的模板，15μl的PC80-2×F8 FastLong PCR MasterMix，1.5μl的引物溶液，余量为双蒸水；所述引物溶液是引物溶液A、引物溶液B和引物溶液C中任意一种溶液，所述引物溶液A中含有浓度为5µmol/L的上游引物A和浓度为5µmol/L的下游引物A，所述引物溶液B中含有浓度为5µmol/L的上游引物B和浓度为5µmol/L的下游引物B，所述引物溶液C中含有浓度为5µmol/L的上游引物C和浓度为5µmol/L的下游引物C；

所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：

S100、在95℃下预变性5min；

S101、在94℃下变性30s，58℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行35个循环；

S102、在72℃下延伸10min；

（3）PCR扩增产物的纯化：取步骤（2）中得到的PCR扩增产物离心后，加入1μl的消化液混合均匀后，上PCR仪进行纯化反应得到待测序产物；所述消化液是将虾碱性磷酸酶和核酸外切酶等体积混合得到的；所述纯化反应的程序包括以下步骤：

S200、在37℃下60min；

S201、在80℃下15min；

S202、在15℃下保存；

（4）PCR扩增产物的测序：取步骤（3）得到的待测序产物1μl，加入测序引物溶液1μl和3μl的MIX溶液得到混合溶液，将混合溶液离心后进行以下测序程序：

S300、在96℃下预变性2min；

S301、在96℃下变性10s，在55℃下退火5s，在60℃下延伸90s，进行25个循环；

S302、在15℃下保存，并且取混合溶液上测序仪进行测序；

所述测序引物溶液是采用与待测序产物对应使用的引物溶液，并且将该引物溶液进行稀释，使得总引物的浓度为3.2pmol/μl；所述MIX溶液是将BigDye和SequencingBuffer按照1:2的体积比混合得到的（所述的BigDye和Sequencing Buffer均来自于BigDye®Terminatorv3.1 cycle Sequencing Kit的测序试剂盒）；

（5）根据测序结果，确定所述的分子标记A的基因型，选择在生长性状方面具有优势的基因型个体进行罗氏沼虾品种育种。

本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：

本发明通过实验以罗氏沼虾孟加拉群体为亲虾，构建了多个全同胞家系并进行培育，然后各家系的罗氏沼虾进行生长形状测量，选定生长快速家系和生长慢速家系，从中采集罗氏沼虾样本进行关联分析，得到与罗氏沼虾生长性状相关的三个分子标记，其中分子标记A的CC基因型个体在体重、体长、头胸甲长、最后腹节长等生长性状方面具有优势；分子标记B的CC基因型个体在体重、腹节长和头胸甲长等生长性状方面具有优势；分子标记C的TT基因型个体在体重、体长、头胸甲长、腹节长和最后腹节长等生长性状方面具有优势。利用本发明方法对罗氏沼虾的后备亲本群体进行筛选，及早排除生长缓慢的罗氏沼虾个体，有助于对罗氏沼虾进行早期选育，可以有效节省生产成本，培育得到在生长性状方面具有优势的罗氏沼虾新品种，进一步提高罗氏沼虾的经济价值和养殖推广价值。

附图说明

图1是本发明所述3个SNP分子标记与罗氏沼虾生长性状关联分析的结果。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

一种罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记，其为分子标记A；

所述分子标记A具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列（即基因insulin-likeandrogenic gland hormone的核苷酸序列），序列1所示的核苷酸序列中c.863碱基处的碱基为T或C；

用于检测所述分子标记A，其包括以下引物：

上游引物A：CTTTGACTGCGGCGACAT；

下游引物A：GGAGAACGGGTAATGATGAA；

将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种的方法，其包括以下步骤：

（1）DNA提取：取待测的罗氏沼虾个体，采集其肌肉组织，利用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取；

（2）PCR扩增：将步骤（1）中提取得到的基因组DNA作为模板进行PCR扩增得到PCR扩增产物；所述PCR扩增的反应体系总体积为30μl，其中包括2μl的模板，15μl的艾德莱F8LongFastTaqMix（购自于北京艾德莱生物科技有限公司），1.5μl的引物溶液A，余量为双蒸水；所述引物溶液A中含有浓度为5µmol/L的上游引物A和浓度为5µmol/L的下游引物A；

所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：S100、在95℃下预变性5min；S101、在94℃下变性30s，58℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行35个循环；S102、在72℃下延伸10min；

（3）PCR扩增产物的纯化：取步骤（2）中得到的PCR扩增产物离心后，加入1μl的消化液混合均匀后，上PCR仪进行纯化反应得到待测序产物；所述消化液是将虾碱性磷酸酶和核酸外切酶等体积混合得到的；所述纯化反应的程序包括以下步骤：S200、在37℃下60min；S201、在80℃下15min；S202、在15℃下保存；

（4）PCR扩增产物的测序：取步骤（3）得到的待测序产物1μl，加入测序引物溶液1μl和3μl的MIX溶液得到混合溶液，将混合溶液离心后进行以下测序程序：S300、在96℃下预变性2min；S301、在96℃下变性10s，在55℃下退火5s，在60℃下延伸90s，进行25个循环；S302、在15℃下保存，并且取混合溶液上测序仪进行测序；所述测序引物溶液是将引物溶液A进行稀释得到的，使得其中的总引物的浓度为3.2pmol/μl；所述MIX溶液是将BigDye和Sequencing Buffer按照1:2的体积比混合得到的；

（5）根据测序结果，确定所述的分子标记A的基因型，当分子标记A的基因型为CC基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种。

实施例2：

一种罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记，其为分子标记B；

所述分子标记B具有如序列表中序列2所示的核苷酸序列（即基因transforminggrowth factor-beta-induced protein的核苷酸序列），序列2所示的核苷酸序列中c.194碱基处的碱基为A或C；

用于检测所述分子标记B，其包括以下引物：

上游引物B：CACCGCTATAAGTGCCAACA；

下游引物B：TTGGCGATGATGTCGTGTTTC；

将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种的方法，其包括以下步骤：

（1）DNA提取：取待测的罗氏沼虾个体，采集其肌肉组织，利用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取；

（2）PCR扩增：将步骤（1）中提取得到的基因组DNA作为模板进行PCR扩增得到PCR扩增产物；所述PCR扩增的反应体系总体积为30μl，其中包括1μl的模板，15μl的艾德莱F8LongFastTaqMix（购自于北京艾德莱生物科技有限公司），1.5μl的引物溶液B，余量为双蒸水；所述引物溶液B中含有浓度为5µmol/L的上游引物B和浓度为5µmol/L的下游引物B；

所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：S100、在95℃下预变性5min；S101、在94℃下变性30s，58℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行35个循环；S102、在72℃下延伸10min；

（3）PCR扩增产物的纯化：取步骤（2）中得到的PCR扩增产物离心后，加入1μl的消化液混合均匀后，上PCR仪进行纯化反应得到待测序产物；所述消化液是将虾碱性磷酸酶和核酸外切酶等体积混合得到的；所述纯化反应的程序包括以下步骤：S200、在37℃下60min；S201、在80℃下15min；S202、在15℃下保存；

（4）PCR扩增产物的测序：取步骤（3）得到的待测序产物1μl，加入测序引物溶液1μl和3μl的MIX溶液得到混合溶液，将混合溶液离心后进行以下测序程序：S300、在96℃下预变性2min；S301、在96℃下变性10s，在55℃下退火5s，在60℃下延伸90s，进行25个循环；S302、在15℃下保存，并且取混合溶液上测序仪进行测序；所述测序引物溶液是将引物溶液B进行稀释得到的，使得其中的总引物的浓度为3.2pmol/μl；所述MIX溶液是将BigDye和Sequencing Buffer按照1:2的体积比混合得到的；

（5）根据测序结果，确定所述的分子标记B的基因型，当分子标记B的基因型为CC基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种。

实施例3：

一种罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记，其为分子标记C；

所述分子标记C具有如序列表中序列3所示的核苷酸序列（即基因Myosin heavychain核苷酸序列），序列3所示的核苷酸序列中c.1101碱基处的碱基为T或C；

用于检测所述分子标记C，其包括以下引物：

上游引物C：AAGCCCTACGACCCGAAGAAGT；

下游引物C：AGGGTGCGGTTAGACTCAT。

将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种的方法，其包括以下步骤：

（1）DNA提取：取待测的罗氏沼虾个体，采集其肌肉组织，利用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取；

（2）PCR扩增：将步骤（1）中提取得到的基因组DNA作为模板进行PCR扩增得到PCR扩增产物；所述PCR扩增的反应体系总体积为30μl，其中包括2μl的模板，15μl的艾德莱F8LongFastTaqMix（购自于北京艾德莱生物科技有限公司），1.5μl的引物溶液C，余量为双蒸水；所述引物溶液C中含有浓度为5µmol/L的上游引物C和浓度为5µmol/L的下游引物C；

所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：S100、在95℃下预变性5min；S101、在94℃下变性30s，58℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行35个循环；S102、在72℃下延伸10min；

（3）PCR扩增产物的纯化：取步骤（2）中得到的PCR扩增产物离心后，加入1μl的消化液混合均匀后，上PCR仪进行纯化反应得到待测序产物；所述消化液是将虾碱性磷酸酶和核酸外切酶等体积混合得到的；所述纯化反应的程序包括以下步骤：S200、在37℃下60min；S201、在80℃下15min；S202、在15℃下保存；

（4）PCR扩增产物的测序：取步骤（3）得到的待测序产物1μl，加入测序引物溶液1μl和3μl的MIX溶液得到混合溶液，将混合溶液离心后进行以下测序程序：S300、在96℃下预变性2min；S301、在96℃下变性10s，在55℃下退火5s，在60℃下延伸90s，进行25个循环；S302、在15℃下保存，并且取混合溶液上测序仪进行测序；所述测序引物溶液是将引物溶液C进行稀释得到的，使得其中的总引物的浓度为3.2pmol/μl；所述MIX溶液是将BigDye和Sequencing Buffer按照1:2的体积比混合得到的；

（5）根据测序结果，确定所述的分子标记C的基因型，当分子标记C的基因型为TT基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种。

实验例：

本发明通过实验以罗氏沼虾斯里兰卡群体为亲虾，成功构建了20个全同胞家系。经过5月龄的培育，对这20个家系的雌性罗氏沼虾（n≥50）进行生长性状测定，主要测量指标包括：体质量（BW）、体长（BL）、头胸甲长（CL）、腹节长（AL）、最后腹节长（FAL），精确到0.01mm，。具体结果统计见表1和图1，每个家系测量55尾，20个家系总共测量了1100尾成虾，其中体重的变异系数为33%，体长的变异系数为8%；因此把体重作为主要选育指标，但是不仅仅依靠体重的表型值排序及LSD多重比较，还需要体长的表型值排序及LSD多重检验结果，最终根据生长性状的表型值，选取排序前五位和后五位的家系，分别认定5个生长快速家系（fast-growing group， FG）和5家系为生长慢速家系(slow-growing group， SG)，接着在5个生长快速家系中选择3个家系（编号10、16、20），在5个生长慢速家系种选择2个家系（编号1、5），然后在选择的这些家系中选择270尾虾进行关联分析。选择的5个家系中罗氏沼虾间的体重比较数据参见表2，5个家系中罗氏沼虾间的体重比较数据参见表3。

表1 20个家系罗氏沼虾生长性状的表型值

表2 用于关联分析的5个不同家系间罗氏沼虾的体重比较

表3 用于关联分析的5个不同家系间罗氏沼虾的体长比较

将上述样本分别按照实施例1～3中的方法进行PCR扩增、PCR扩增产物的纯化和PCR扩增产物的测序等步骤，确定所述的SNP分子标记的基因型，并且结合罗氏沼虾个体的生长性状数据进行分析，具体数据结果见图1。

根据表1中数据显示，分子标记A与罗氏沼虾的体重、体长、最后腹节长达极显著关联水平（P<0.01），与头胸甲长达显著关联水平（P<0.05）；分子标记B的个性状均呈极显著关联水平（P<0.01）；分子标记C与罗氏沼虾的体重、体长、头胸甲长、腹节长极显著关联（P<0.01），与最后腹节长达显著关联水平（P<0.05）。

从关联分析结果可以看出，分子标记A的CC基因型个体的体重、体长、头胸甲长、最后腹节长均极显著高于TT基因型个体（P<0.01）；分子标记B的CC基因型个体的体重、腹节长和头胸甲长均极显著或显著高于AA基因型个体（P<0.01或P<0.05）；分子标记C的TT基因型个体的体重、体长、头胸甲长、腹节长和最后腹节长均极显著高于突变型个体（P<0.01）。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 广西壮族自治区水产科学研究院

<120> 罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记及其应用

<141> 2022-03-11

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1845

<212> DNA/RNA

<213> insulin-like androgenic gland hormone

<400> 1

cagtgtgtgt tgttctgctc actcgtagca tcgcttctcc ctcaaccttc ttcgagctat 60

gagatcgaat gcctctccgt tgactttgac tgcggcgaca taacgaacac ccttgcctcc 120

gtctgcctga gacacaacaa ctacatcaac ccaggaccca cctacgtttc caaaggtatg 180

tgacagagga cgatcgtcgt tctctccccc ggaatgagtg tcagaaggaa tctttttgcg 240

ttcgcacttt ctctcaaaaa cagctggata tcaactatat cagagaataa agggtggtat 300

tctttgctct gtcaggaact ggaacagata tatagttagt gttaaccctc tgactacatt 360

aaatcatttt ctaaatcaat ttttgcgaag ttaggcttat tcggaatttt aaagtttttt 420

tggttttgta tttttttttt gtcgaccaca aattactact tcggaaaata caacacatag 480

attttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttctctc tctctctctc tctctctctc 540

tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tcatactatc acgttagcgt 600

gtttccttct tcatatttac gttatcaacg aaaaatttcc cgaaaatata ctttagtctt 660

ttaatacaac agagaaaccc tctcctgata ctgagcaaag actgacctcc tctacccata 720

agctctccgt taaattcttt cttattttca cagagcgacg atctgctgac atctataccg 780

ttccttctac gaagtctcca tcgctcgccc acccgagagc tacccacttg accatggctg 840

acgaagaaac tcagaaggta tctaaggtaa atatatttat ggtcttcgtc gcctccagca 900

ccgcgtggcg cacagggcgt ctgtggaatt tcgctgctct tgtctcacgt gctttgtctt 960

ccacaaatct ccactcatcc caaacctccc ttttcgcagt tgtcacccaa ttaggtttgg 1020

atcttccaat ccttctgatg cccacaggag cccggctctc acactttcgc ctactatcct 1080

ccaaaggatt ggacgaagta tatttccatg agatatctct ctctctcttt catcattacc 1140

cgttctccac atggaatctc cgcaacctcc cttatggggt cacttctaaa atctttctca 1200

ctatctgact cctgatattc ttcttaaagc tttattttca aatctataaa atctcttgca 1260

tatagtttca ctgtcatttc gtgagtcatg accgtatagc catgcagatc ttaccagact 1320

tatatagtat aatcttactt tttgcataaa attgcagtct gattaattgg ttgtcaatct 1380

tattcagcca atccactgtt tgatttgccg ttttgagcac tgaaaaatgg caagcagata 1440

tttttttata tcgcctacaa cttttcaaat gtattgcaac tcaaccgcgg tgatattgcg 1500

taaaagaatc attttaaggc taaaataatt atggaaataa ttttattata cgaatcggac 1560

atttagaacc agttaaatgt cttatagtgg ataatgttag gcatcgcagt gctgactgaa 1620

tatagtattc atttcttcta acgcagtcgt tgttaacccg acccccccaa cccaggtgga 1680

ggaggagatt cagcacatga cgctgagccg ggaagaagcg aacaatatgc tgcattcgaa 1740

gcgtcgcttc cggagggaca gcgtgaggag aagtccaagg gaggaatgct gcaacaacgc 1800

ctctttcaga cgctgcaact tcgaggaagt cgccgaatat tgcat 1845

<210> 2

<211> 375

<212> DNA/RNA

<213> transforming growth factor-beta-induced protein

<400> 2

atgaagtcca tctccaagtt aattccctcg ctcatttcag acgtgttgat gtaccacatt 60

ctccccggag catatttcag cgaaggcctg agagacggca tgtggctacc gacgctggcc 120

gagcaggagc ttcaagttaa agttagccat aatcatgcgt ttggcaccgc tataagtgcc 180

aacatcacag gccaccacag ggccgtggct gaaagtttca tggtctgcgg ctgggagttt 240

catggtcgac ttgcaggcgt cgggatagct gctaaggttc tgaaacacga catcatcgcc 300

aaaaatggcg ttattcacgt catcgacact gtcttgaggc ccgagaaaga ggaacctata 360

tgtggacact tttaa 375

<210> 3

<211> 11358

<212> DNA/RNA

<213> Myosin heavy chain

<400> 3

atgcctggcc acgttaaaaa gagcactggt cccgaccccg acccctccga atggctgtat 60

atctcaatgg agatgaagct ggccgatcag gccaagccct acgacccgaa gaagtcttgc 120

tgggtccctg atcccaagga gggcttcctt ctcggtatga ttcaggacac caagggcgac 180

atgatcgttg tccacgctgg cggcgagacc aaggaatgga agaaggatct cgttggtcag 240

gtcaacccca acaaattcga gaagtgcgag gacatgtcca acttgaccta cttgaacgac 300

gcctccgtcc tgtacaacct gaagtctcgt taccaggcca agctcatcta cacttactcc 360

ggtctcttct gtatcgccgt caacccctac aagcgcttcc ccatctacac caaccgtact 420

gtcaagatct accagggcaa gaggcgtaat gaagtgcctc cccacatctt tgccatctct 480

gacggtgcct acatggacat gcttcagctt ggcgaggatc agtctatgct gattaccggt 540

gagtccggtg ccggtaagac cgagaacaca aagaaggtac tctcctactt cgccaacgtc 600

ggcgccagca ccaaggccaa ggaccaggcc aacaagccca acttggagga ccagatcgtc 660

cagaccaacc ctgtattgga ggccttcggt aacgccaaga ccgtcaggaa cgacaactcc 720

tcccgtttcg gtaagttcat ccgtattcac ttcgcaccca acggcaagct gtctggcgct 780

gatattgagt cctacctgct ggagaaggcc cgtgtcatct ctcagcagtc tctggagagg 840

tcctaccaca tcttctacga gatgatgacc ggccagatcc ccgagatcaa gcccatgtgc 900

aagctcagcg aggacatcta cgaataccac tacgtctccc agggtaaggt cactgtcccc 960

tccattgatg acggcgaaga catgcagttc tgtcacgacg ccttcttcgt gctgaacttc 1020

aaccaggaag aggtcgacaa tgtgtacaag atcacatctt ccgtcatgca catgggtgag 1080

atgaagttca agatgaaggg tcgcgatgag caggccgagc ccgacggtac tgacaggggt 1140

gagatcgtcg ctgagctcct tggtgtcgag gctgatgcct tctacaggaa cttgtgcaag 1200

cccaagatca aggtcggtaa cgagttcgtc gccaagggta tggacgtcaa caaggtcact 1260

tactccatcg gtgccctggc caagggtctc ttcgatcgtg tgttcaaatt cctggtcgac 1320

aagtgtaaca tgactctcag cactgggcag aagcgcgccc acttcatcgg tgtactcgat 1380

attgccggct ttgagatctt cgactacaac ggcttcgagc agatttgcat caacttctgt 1440

aatgagaaac tgcagcagtt cttcaaccat cacatgttcg tactggaaca ggaggaatac 1500

aagaaggaag gtattgactg ggtcttcgtc gatttcggta tggatctcca ggcctgcatt 1560

gagttgttcg aaaagaaact tggtctcctc gccatccttg aggaagagtc tatgttcccc 1620

aaggctactg ataagacctt ccaggagaag ttgaacgcca accttctcgg caagtctccc 1680

atgttcatca agcccaaacc accaaagccc ggtcaggttg agggccactt cgccatcgtc 1740

cactacgccg gtaccgtcac ttacaacttg tctggctggc tcgagaagaa caaggatccc 1800

ctgaacgaca ctgttgttga ccaactgaag aagggcacca actcacttgt tgtgctcatc 1860

ttcgctgacc atcccggcca gtctggtgaa gctggcggcg gtggcaaggg tggcaagggc 1920

aagtctggtg gtttcaagac tgtctcttca ggttacaggg accagttggg taacctcatg 1980

aggactctga acgctactca cccccacttc atccgatgca ttgtaccaaa cgaaaccaag 2040

actccaggtc tcgttgaggc tggcttgatc atgcatcagc tgacttgtaa cggtgtgctt 2100

gaaggtatcc gtatttgccg aaagggcttc cccaacagga tgctgtaccc tgacttcaag 2160

cttcgttaca agatcatcaa tgccaatgcc gtcgccacca tcaaggataa caaggaaatg 2220

gcctacgctg tccttgacgc tggtggtctc gatagggact cttaccgctg tggcaacacc 2280

aaggtattct tcaaggccgg tatcctgggt aacctcgagg aggtgcgaga cggccgcttg 2340

ggcaagatcg tgacttggat gcaaggttgg gttcgtggta agaacggcag agctgaattc 2400

aagaggcttc aggaacagcg cgttgccttg actgtcgtcc agcgcaaggt caggaactac 2460

attgccatgc agagctggtc ttggttcaac ctctggcaga aggtcaggcc cctcatcaac 2520

cagcccagga ttgaggacga gatccgcaag ctggaggaga gggccaatgc tgcttgctct 2580

gagctcgaga aggaaaccaa tctcatcgag accctgactg cttccaatgc atcccttctg 2640

gctgaaaagg aagcccttgc caagaccatc gaggagacca agggcaacat gtcagagttc 2700

atggataacc tggccaggat tgctgccgag aaggccgaac tcgagatcct gttgaccgat 2760

acttctgcca agctgatagc tgaggaagaa gcccgcacat ccactttcgc tgataagagg 2820

aagactgagc aggaggtgaa cagcatcaag agggatcttg aagaccttga gctcaatgta 2880

cagaaggcca accaggacaa ggccaccaag gatcaccaga tccacgtcct caatgaggag 2940

attgctcacc aggaggagat catcaacaag gtgaacaagg aaaagaagca ccttcaggaa 3000

ctcaaccaga agtccgccga ggactcccag ggtgttgatg acaggtgcag ccacctgagc 3060

aagatcaagg ctaagcttga acagaccctt gatgaactcc aggaatctct cgagcgcgag 3120

aagaagttgc gcgctgaagt tgacaagtcc aagaggaagg tcgagggcga ccttaagctc 3180

acccaggagg ctgtcgctga tcttgagcgc aaccacaagg aactcgagac tgccatccag 3240

cgcaaggaca aggaaatctc caacttcgcc aacaaggtcg aagacgagca gggactcgtt 3300

tccaagatcc agaagcagat caaggagctg caggcccaca ttgaggagcg cgagcaggag 3360

gtcgagcacg agcgccaggc ccgcgccaag gctgagaagg ccaagggcac cctcgctcgc 3420

gaactcaacg acctcggaga ccgccttgac gaagctggcg gcgccacagc cgcccaggtt 3480

gagctcaaca agaagcgcga ggctgagctt gctaagcttc gccgcgatct tgaggagtcc 3540

aacatccagc acgaatctgc cttcgcttcc ctccgcaaga agcacaacga cgccgttgct 3600

gagatgtctg accagatcga ccatctcacc aagatgaagg ccaagattga gaaggagaag 3660

gaagtgatga ggcgtgaggc tgaagacgcc aaggctgctc ttgatggtct tgcccgcgat 3720

aaggctgctg ctgagaaggc taacaagtcc atccagctgg gcatcaacga agtccacgtc 3780

aagctggacg aggtcaaccg taccctcaac gacttcgacg ccaccaagaa gaagttggct 3840

gttgagaatg ctgatctcct ccgccagctt gaggaagccg acgctcagat cgctcagctt 3900

agcaagctga aggctactct ttccgtccag gtcgatgaga ccaggaagct tgccgacgac 3960

gagtccaggg agcgcgctac catccttggc aagtaccgca acctcgagca cgatctcgac 4020

ggcctccgcg aacaggtcga agaagagagc gaaggcaagg ctgacctcct gcgccagctc 4080

tccaaggctg aggctgaggc ttccatgtgg cgcaccaagt acgaggctga gggcgttgcc 4140

cgcgctgagg aactcgaggc tgcccgcttg aagatcgccg cccgcctcga cgaggccgaa 4200

caacagattg aacagctcaa tgtcaagaac ctgaacctcg agaaggcaaa gggacgtgtc 4260

agcgctgagc tcgaggacat gcagctcgcc gtcgagcgcg cccaggccct cgccgacgct 4320

gccgagaaga agcagaagaa cttcgacagg atcatcggtg aatggaagct caaggttgac 4380

gacctcgctg ccgaactcga cgcctcccag aaggaatgcc gcaactactc caccgagcac 4440

ttccgcatca aggccaccta cgaggagaac ctcgaacacc tggactccgt ccgccgtgag 4500

aacaaggctc tcgctgacga aatcaaggac ctcatggacc agatcagcga gggtggccga 4560

tccatccacg aagtacagaa gtctgtcaag cgcctcgaga tcgagaagga agagctccag 4620

gccgcccttg aggaggctga gaccgccctc gaacaggagg agaacaaggt ccttcgctgc 4680

cagctcgaac tcagccaggt cagacaggaa attgacaagc gtatccagga gaaggaagag 4740

gaattcgaaa acacccgcaa gggacaccag cgtgccatcg actccatgca gtctgccctc 4800

gaggctgagg ccaagggcaa ggctgaggct cttcgcatga agaagaagct cgagtccgat 4860

atcggcgagc tcgagatcgc cctcgaccac tccaacaagg ctaatggaga cctccagaaa 4920

cacatcaaga agctccagct ggagattaag gacgctcagt cccgccttga ggaagaacag 4980

cgccttgcct ccgaataccg cgaacagtac ggcatctctg aacgccgcgc caacgccctt 5040

cacggagagc tcgaggaatc cagaactctc ctcgaacagt ccgaccgcgg ccgccgccag 5100

gccgaggctg aactctccga ggccgcagaa tccctcagcg gcctttccgc tcagtacaac 5160

tccctctcca tggccaagag aaagctcgaa ggcgaaatgc agaccctgca cgctgacctc 5220

gacgacatgc tgaatgaagc caagaactcc gaggagaagg ccaagaaggc catggtcgac 5280

gccgcccgcc tcgctgacga gctccgcgcc gagcaggagc acgcccagac ccaggagaag 5340

atgcgcaagg gcttggagat ctccgtcaag gagctcagag tccgccttga ggagagcgag 5400

ggtgttgctg tcaagaccgg taagaaggcc cttggcaagc tcgaaggccg cgtccgcgag 5460

ctggaaggac agctcgacga cgaagcccgc cgtcactccg acgcccagaa gaacctcagg 5520

aagtgcgaga ggaagatcaa ggagctcacc ttccagtccg acgaggacaa gaagaaccac 5580

gagaggatgc aggacctcgt cgacaagctc cagcagaaga tcaagaccta caagcgccag 5640

atcgaggagg ctgaggaaat cgccgccctc aacttggcca aggagatgaa actcaaggac 5700

atggccaagc cttacgacgc aaagaagtcc tgctgggtcc ctcatcctac cgaaggcttc 5760

gttctgggtg agatccaggg caccaagggc gacctcgtca ctgtcctcgc tgagggcgag 5820

accaaggact ggaagaagga tcttgtcggt caggtcaacc ccaacaaata cgagaagtgc 5880

gaggacatgt ccaacttgac ctacttgaac gatgcctctg tcctgtacaa cttgaagaat 5940

cgttatcagg ctcagctcat ctacacctac tccggtctct tctgtatcgc cgtcaacccc 6000

tacaagcgct tccccatcta caccaaccgt actgtcaaga tctacatggg caagaggcgt 6060

aatgaagtgc ctccccacat cttcgccatc tctgacggtg cctacatgga catgttgcag 6120

gccggtggta accagtctat gctgatcaca ggtgagtctg gcgccggtaa gactgagaac 6180

acaaagaagg tactgtcata cttcgccaac gtcggtgcca ctgagaagaa ggccggcgaa 6240

gctgagaagc cgaacttgga ggatcagatc gtccagacca accccatttt ggaacccttc 6300

ggtaacgcca agactgtcag gaatgacaac tcctcccgat tcggtaagtt catccgtatc 6360

cacttcgagc ccaacggcaa gctgtctggt gctgatattg agtcctacct gctggagaag 6420

gcccgtgtca tctcccagca gcctctggag aggtcctacc acatcttcta cgagatgatg 6480

accggccaga tcgccgagat caagcctatg tgcctcctca gcgacgacat ctacgactac 6540

cactatgtat ctcagggcaa ggtcactgta ccatccattg acgacggcga ggacatgcag 6600

ttctgtcacg acgctttctt cattctcaac ttcaccaagg aggaaatcga caacatttac 6660

aagatcaccg ccgctgtcat gcacatgggt gaaatgaagt tcaagcagaa gggtcgtgaa 6720

gagcaggctg aagccgacgg cactgaggtt ggcgagaagg ttgccattct tctcggtatt 6780

gacgtcgatc acttctacaa cggtttgtgc aagcccaaga tcaaggtcgg taacgagttc 6840

gtcgccaagg gtatggacgt gaacaaggtc aactactccg tcggtgccct ggctaaggcc 6900

ctcttcgatc gcgtcttcag gttcttggtc gacaagtgta acaagaccct tgaaaccggc 6960

cagaagcgtg cctccttcat cggtgtactc gatatcgccg gttttgagat tttcgacgac 7020

aacggcttcg agcagatttg catcaacttc tgtaatgaga aactgcagca gttcttcaac 7080

catcacatgt tcgtactgga acaggaggaa tacaagaagg aaggtattga ctgggtcttc 7140

gtcgatttcg gtatggatct ccaggcctgc attgagttgt tcgaaaagaa acttggtctc 7200

ctcgccatcc ttgaggaaga gtctatgttc cccaaggcta ctgacaagac cttccaggag 7260

aagttgaacg ccaaccatct tggtaaatct cctgtgttca tcaagcccaa gccaccaaag 7320

cccggccagg ttgagggtca cttcgccatc gtccactacg ctggtaccgt cacttacaac 7380

ttgactggct ggctcgagaa gaacaaggat cccctgaacg acactgttgt cgacatcctg 7440

aagaagggca gcaacactct cattattgag atcttcgctg accatcccgg ccagtctggt 7500

gacgctggcg gcggtggcaa gggtggcaag ggcaagtctg gtggtttcaa gaccgtatca 7560

tctggttaca gggatcagct gaacaacttg atgaggacct tgaacgccac ccacccccac 7620

ttcatccgat gcattgtacc taatgagacc aagactcctg gcaaggtcga ggctggcttg 7680

attatgcatc agctgacttg taacggtgta cttgaaggta tccgtatttg ccgaaagggc 7740

ttccccaaca ggatgatgta caacgacttc aagcaccgtt acaagatcgt ggcttctgtt 7800

gagatgtccc agtccaagaa tgacaagctg gctgccgagg cttgcttcca gaaggccggt 7860

cttgacaagg agacctaccg tactggcaac actaaggtgt tcttccgcgc cggtatcttg 7920

ggtcagcttg aggaggtccg tgacaaccgc attggtctcc tcatgacttg gctgcagtcc 7980

tggtgccgtg gctggctcag ccgtaggtcc tacaagaagc tgcaggatca gcgtgtctcc 8040

ctgatcgtcg ttcagcgcaa catcaggaag taccagaaca tgaagagctg gccttggtac 8100

ggattctgga atgccctgaa gccaaggctc aacgtcagcc gtgtccagga tcagcttgac 8160

ggcctcgaga agaaggctga agaggctgag gctgctctcg agaaggctct tgtcaagcgc 8220

aaggaactcg aagatgccca cgccatcgtt caggaggaga ggaatgccct cttcgaaact 8280

gtcgagtcca gcaagggtgg tgtcagcgag atgtttgaga agcaggctaa ggtccaggct 8340

ctgaaggctg aagtcgagtc ccaactggct gaagtccaga tgcgcctcgc caacgagcag 8400

gaagctcgca accaacttac ccagggtaag aagaaggctg agcaggagat tggcggcctc 8460

aagaaggatc tcgaggatct tgaccttgcc atccagaagg ccgaggagga caaggctacc 8520

aaggatcaac agatccagac cctcaacgag gagatcgctc accaggagga gctcatcagc 8580

aaggttaaca aggaaaagaa gcaccttcag gagtgcaacc agaagaccgc tgaggacgtc 8640

cagggtgttg aggataagtg caaccacctc aacaagctga agtccaagct tgagggacag 8700

ctcgacgagc tcgaggactc ccttgagcgc gagaagaaac tccgcgccga agttgagaaa 8760

tccaagagga aggttgaggg cgacctgaag ctcactcagg aagcagtcgc tgacctcgag 8820

cgcaacctga aggaactgga gaacaccctt cagcgcaagg acaaggaagt ttcctccctc 8880

ggcagcaagt acgacgacga gcagatcctc atccacaagg gcaacaagca gatcaaggag 8940

ctgcaggccc gcattgagga gctcgacgtt gaggttgagc acgagcgcca ggcccgcgcc 9000

aaggctgaga aggccaaggc tgccttggct cgcgatctct ccgacctcgg tgaccgcctg 9060

gacgaggctg gtggcgccac tgccgctcag atcgaaatca acaagaagcg cgaaggtgaa 9120

ctcgctaagc ttcgtcgtga tcttgaggaa tccaacattc agcacgagtc tgccctctcc 9180

atgctccgca agaagcacaa cgatgctgtt gctgagctgt ccgagaacat tgatcatctt 9240

aacaagatga aggccagggc tgagaaggac aaggacgcca tgaagcgtga tgctgatgat 9300

gccaaggcta ccatggacgc tcttgcccgc gacaaggccg ctgctgagaa gaccaccaag 9360

cagctccagc accagctcgg cgagacccac gctaagcttg atgagtctaa ccgcaccctc 9420

agcgacttcg acgccaccaa gaagaagctg gctgttgaga atgctgacct catccgccag 9480

ctcgaggagg ccgagtccaa ccttgcccag ctttccaagt tgaagctttc cctcaccaac 9540

cagctcgaag acagcaggaa gctcgctgat gatgagagca ggggccgtgc caccatcctt 9600

ggcaagtacc gcaatctgga gcatgacatt gctgccctcc gcgagtctct cgatgaggaa 9660

gccgaggcca aggccgacgt tcagcgcatg ctttccaagg ccaacgccga ggcccagatg 9720

tggcgcgcca agtacgagtc tgagggactt gcccgcgctg aggaaatcga ggctgcccgc 9780

atgaagctcg ccgcccgcct tgacgaagcc gaggctcaga ttgagcagct caacatcaag 9840

aacatgaacc ttgagaagac caaggctcgt gtcagtgccg agctcgagga cgtccaggtt 9900

gccgtcgagc gcgccaacac tcttgctgct gccgctgaga agaagcagaa gaacttcgac 9960

aggatcattg gtgaatggaa gatgaaggtt gacgatcttg ctgctgaact cgacgcttcc 10020

cagaaggaat gccgcaacta ctccaccgaa cacttccgcc ttaaggctgc ctacgaggag 10080

aacattgagc agctcgactc cgtccgccgt gagaacaaga acctcgctga tgagatcaag 10140

gatctcatgg accagatcgg tgagggtggc cgctcatacc atgaagttca gaagaacgcc 10200

aagcgccttg agatcgagaa ggaagagctc caggctgctc ttgaggaggc tgaggccgct 10260

cttgaacagg aagagaacaa gctcctccgt ggccagctcg agcttagcca ggtcaggcag 10320

gaaatcgaca ggcgtattca ggagaaggaa gaggagttcg aaaacacccg caagtgccac 10380

cagcgtgctc ttgactccat gcaggcttcc ctcgaagctg aggccaaggg caaggctgag 10440

gctctccgcg tcaagaagaa gctcgagtct gacatcaacg agctcgagat cgcccttgat 10500

cattccaata aggccaactc cgacctccag aagcacatca agaagatcaa caatgacatc 10560

aaggacatgg gctcccgcat cgaagaggcc cagcgccttg cctccgaata ccgcgagcag 10620

tacggcatct ccgagcgccg cgccaacgcc ctccacggcg aactggaaga gtctcgcact 10680

ctcctcgaac agtccgaccg cggccgtcgc caggctgaga ccgagctcgc tgaggcccac 10740

gattccatca acaacctcac cacccagaat gccaacctca cggtcaccaa gagaaagctg 10800

gaatgcgaga tgcagaccct ccaggctgat cttgacgaga tgctgaacga agccaagaac 10860

tccgaggaga aggccaagaa ggccatggtc gacgccgccc gcctcgctga cgagctccgc 10920

gccgagcagg aacacgccca gacccaggag aagatgcgca agggcttgga agtcaccgtc 10980

aaggagctcc aggtccgcct cgaggagaac gagagcaacg cccagaagac tggcaagaag 11040

gccatctcca aactcgaagc ccgcatctcc gagctcgagg cccagcttga cgacgagtcc 11100

cgccgccatt ctgatgccca gaagaacctc aggaagtgcg agaggcgcat caaggagttg 11160

accttccagt tcgatgagga caagaagaac cacgagaaga tgcaggacct cgtcgaaaag 11220

ctccagcaga agatcaagac ctacaagcgc cagatcgagg aggctgagga aatcgccgcc 11280

ctcaacttgg ccaaattccg caaggcacag caggagctgg aggaaaccga gggtagaatt 11340

atcatcaagg ctctctaa 11358

<210> 4

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctttgactgc ggcgacat 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagaacggg taatgatgaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccgctata agtgccaaca 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttggcgatga tgtcgtgttt c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagccctacg acccgaagaa gt 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agggtgcggt tagactcat 19

Claims (4)

1.一种罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记，其特征在于：包括分子标记A、分子标记B和分子标记C；

所述分子标记A具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列1所示的核苷酸序列中c.863碱基处的碱基为T或C；

所述分子标记B具有如序列表中序列2所示的核苷酸序列，序列2所示的核苷酸序列中c.194碱基处的碱基为A或C；

所述分子标记C具有如序列表中序列3所示的核苷酸序列，序列3所示的核苷酸序列中c.1101碱基处的碱基为T或C。

2.一种如权利要求1所述的罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种，其通过提取待测罗氏沼虾基因组DNA进行PCR扩增以及PCR扩增产物纯化，然后对得到的产物进行测序，确定所述的SNP分子标记的基因型；当分子标记A的基因型为CC基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种；当分子标记B的基因型为CC基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种；当分子标记C的基因型为TT基因型时，选择该个体作为后备亲本进行罗氏沼虾品种育种。

3.根据权利要求2所述的罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：在所述PCR扩增以及PCR扩增产物纯化过程中，用于检测上述罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记的引物组，其包括引物组合A、引物组合B和引物组合C；

所述引物组合A用于检测所述分子标记A，其包括以下引物：

上游引物A：CTTTGACTGCGGCGACAT；

下游引物A：GGAGAACGGGTAATGATGAA；

所述引物组合B用于检测所述分子标记B，其包括以下引物：

上游引物B：CACCGCTATAAGTGCCAACA；

下游引物B：TTGGCGATGATGTCGTGTTTC；

所述引物组合C用于检测所述分子标记C，其包括以下引物：

上游引物C：AAGCCCTACGACCCGAAGAAGT；

下游引物C：AGGGTGCGGTTAGACTCAT。

4.根据权利要求3所述的罗氏沼虾生长性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：将所述的SNP分子标记用于罗氏沼虾的选择育种的方法，其包括以下步骤：

（1）DNA提取：取待测的罗氏沼虾个体，采集其肌肉组织进行基因组DNA的提取；

（2）PCR扩增：将步骤（1）中提取得到的基因组DNA作为模板进行PCR扩增得到PCR扩增产物；所述PCR扩增的反应体系总体积为30μl，其中包括1μl或2μl的模板，15μl的PC80-2×F8FastLong PCR MasterMix，1.5μl的引物溶液，余量为双蒸水；所述引物溶液是引物溶液A、引物溶液B和引物溶液C中任意一种溶液，所述引物溶液A中含有浓度为5µmol/L的上游引物A和浓度为5µmol/L的下游引物A，所述引物溶液B中含有浓度为5µmol/L的上游引物B和浓度为5µmol/L的下游引物B，所述引物溶液C中含有浓度为5µmol/L的上游引物C和浓度为5µmol/L的下游引物C；

所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：

S100、在95℃下预变性5min；

S101、在94℃下变性30s，58℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行35个循环；

S102、在72℃下延伸10min；

（3）PCR扩增产物的纯化：取步骤（2）中得到的PCR扩增产物离心后，加入1μl的消化液混合均匀后，上PCR仪进行纯化反应得到待测序产物；所述消化液是将虾碱性磷酸酶和核酸外切酶等体积混合得到的；所述纯化反应的程序包括以下步骤：

S200、在37℃下60min；

S201、在80℃下15min；

S202、在15℃下保存；

（4）PCR扩增产物的测序：取步骤（3）得到的待测序产物1μl，加入测序引物溶液1μl和3μl的MIX溶液得到混合溶液，将混合溶液离心后进行以下测序程序：

S300、在96℃下预变性2min；

S301、在96℃下变性10s，在55℃下退火5s，在60℃下延伸90s，进行25个循环；

S302、在15℃下保存，并且取混合溶液上测序仪进行测序；

所述测序引物溶液是采用与待测序产物对应使用的引物溶液，并且将该引物溶液进行稀释，使得总引物的浓度为3.2pmol/μl；所述MIX溶液是将BigDye和Sequencing Buffer按照1:2的体积比混合得到的；

（5）根据测序结果，确定所述的SNP分子标记的基因型，选择在生长性状方面具有优势的基因型个体进行罗氏沼虾品种育种。

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