CN117467777A - 一种与翘嘴鳜生长性状相关的snp标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产养殖、生物技术领域，具体涉及一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP标记与应用。本发明所述SNP标记位于翘嘴鳜低密度脂蛋白受体A(LDLRA)基因序列的第1605位，其碱基为A或C。本发明通过分析所述SNP标记的基因频率与翘嘴鳜生长性状的相关性，基因型为AA的纯合型个体在体重、全长、体长、体宽和体高这5个表型数据中，都要显著高于AC型个体。本发明可用于翘嘴鳜的分子标记辅助育种，加快选育具有优良生长性状的翘嘴鳜品种，从而快速获得生长快的翘嘴鳜个体，淘汰掉生长速度慢的翘嘴鳜个体。

Description

一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP标记与应用

技术领域

本发明属于水产养殖、生物技术领域，具体涉及一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP标记与应用。

背景技术

翘嘴鳜(siniperca chuatsi)主要分布于中国，朝鲜等东亚国家，属鲈形目(Perciformes)、真鲈科(Percichthyidae)，鳜属(siniperca)。因其肉味鲜美、营养丰富，而深受广大消费者的喜爱，属名贵淡水养殖鱼类。翘嘴鳜是一种肉食性鱼类，因此需要投喂活饵料来满足其生长需求。翘嘴鳜的活饵料主要包括浮游动物、小型鱼类、底栖生物等。其中，浮游动物是翘嘴鳜幼苗的主要食物，如枝角类、桡足类等；小型鱼类则是翘嘴鳜成鱼的主要食物，如鲮鱼、麦穗鱼等，这极大地增加了其养殖成本。对此，如果能提高翘嘴鳜生长速率、缩短其生长所需时间，就可以缩短翘嘴鳜养殖周期，从而实现以更少饵料快速生长并达到上市规格，以降低投入成本提高养殖收益。目前影响翘嘴鳜生长速率因素主要有自身遗传和外部环境等，据研究表明基因遗传对于翘嘴鳜生长性状起到十分重要的作用。因此而通过选育具有生长优势的翘嘴鳜品种是提高翘嘴鳜生长速率，降低投入成本提高养殖收益主要手段

现有技术中一般采用选择优良的亲本可以获得具有优良性状的翘嘴鳜品种，但是采用选择优良的亲本这种选育方式存在如下问题：1、选育翘嘴鳜优良亲本的过程需要经过多代的选择和培育；通常，从野生群体中选择具有优良性状的个体进行繁殖和养殖，并通过多代的筛选和培育，逐渐形成具有优良性状的群体；这个过程需要经过数年甚至数十年的时间，因为需要经过多代的选择和培育，以逐渐积累和传递优良的遗传性状。2、选育过程中还需要进行环境控制和饲养管理，以提供适宜的生长条件和营养供给；环境控制包括水质管理、温度控制、光照控制等方面，这些因素都会对翘嘴鳜的生长和发育产生影响；饲养管理方面需要注意饲料的选择和管理，以确保提供足够的营养供给和保持水质清洁；即选育的成本高。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基。因其位点分布丰富，具有较高的信息含量，且SNP位点信息获取简单快捷，现已成为重要的分子标记。通过将SNP位点与重要性状进行关联分析，获取与性状紧密关联的分子标记用于选育，是现代水产动物分子育种技术的重要手段，在水产经济动物遗传育种中发挥重要作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP标记，通过对所述SNP标记的基因型进行检测，筛选获得具有生长优势的翘嘴鳜，一方面以解决普通翘嘴鳜生长速率慢、生长所需时间较长，养殖投入成本较高；另一方面解决采用选择优良的亲本进行选育时间周期长和选育的成本高问题。从而可以实现养殖经济效益最大化。

本发明提供一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于低密度脂蛋白受体A(LDLRA)基因序列的第1605位，其碱基为A或C；所述LDLRA基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明还提供了一种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种用于检测权利要求1所述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。

本发明还提供了一种筛选生长优势的翘嘴鳜的方法，所述方法包括：检测所述SNP标记，筛选具有AA纯合型的个体。

优选地，所述方法包括如下步骤：(1)剪取待测翘嘴鳜尾鳍鳍条；(2)将所取鳍条置于无水乙醇中保存；(3)提取待测翘嘴鳜的基因组DNA；(4)采用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，对所述待测翘嘴鳜的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；(5)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；(6)基于所述测序结果，确定所述待测翘嘴鳜的SNP标记的基因型是否为AA纯合型个体。

更优选地，所述PCR扩增的反应体系为：以50μL总体积反应体系计，包括25μL 2×Taq PCR Master Mix，2.5μL基因组DNA，正反向引物各1μL，20.5μL水。

更优选地，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。

本发明还提供了一种所述SNP标记或所述引物组或所述试剂盒在翘嘴鳜育种中的应用。

本发明通过对翘嘴鳜生长相关SNP设计多对引物对翘嘴鳜个体进行PCR扩增，获得扩增产物进行测序后，通过BioEdit软件对测序结果进行多重比对分析，筛选获得了位于该基因编码子区域的SNP标记。

本发明利用R包、Cervus软件计算所述SNP标记的基因型频率、基因频率、遗传多态性以及SNP标记与体重、体长等数据的相关性，发现基因型为AA的纯合型个体在体重、全长、体长、体宽和体高这5个表型数据中，都要显著高于AC型个体(p<0.01)。因此，利用本发明的SNP标记进行早期筛选，可快速鉴别出翘嘴鳜生长优良个体，实现养殖经济效益最大化。

附图说明

通过附图中所示的本发明优选实施例更具体说明，本发明上述及其它目的、特征和优势将变得更加清晰。在全部附图中相同的附图标记指示相同的部分，且并未刻意按实际尺寸等比例缩放绘制附图，重点在于示出本的主旨。

图1为GWAS获得的SNP曼哈顿图；

图2为QQ图；

图3为SNP标记与生长性状显著相关图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本发明提供了一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于翘嘴鳜低密度脂蛋白受体A(LDLRA)基因序列的第1605位，其碱基为A或C；所述LDLRA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。在本发明中，随机抽取288尾6月龄翘嘴鳜，测量其体重、全长、体长、体宽和体高等5个表型数据并剪取其鳍条，使用美基生物的组织DNA小量提取试剂盒(HiPure Tissue DNA Mini Kit)提取其DNA，使用ddRAD-seq建库并测序。通过Bowtie(v2.0)软件将序列数据与翘嘴鳜参考基因组进行比对，比对率为93.88％(SD＝0.10)。利用BCFtools过滤低测序质量位点并生成vcf格式文件，共鉴定了49941个SNP。再基于vcf文件使用全基因组关联分析GWAS，获得极显著SNP。进一步筛选得到位于13号染色体上25630156位点的SNP。

本发明还提供了一种用于检测所述SNP标记的引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明涉及的引物组能够特异性地扩增出清晰目的片段。

本发明还提供了一种用于检测所述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。在本发明中，所述试剂盒还包括但不限于2×Taq PCR Master Mix。

本发明还提供了一种筛选具有生长优势的翘嘴鳜的方法，所述方法包括：检测所述SNP标记，筛选具有AA纯合型的个体。在本发明中，所述方法包括如下步骤：(1)提取待测翘嘴鳜的基因组DNA；(2)；采用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，对所述待测翘嘴鳜的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；(4)基于所述测序结果，确定所述待测翘嘴鳜的SNP标记的基因型是否为AA纯合型个体。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系为：以50μL总体积反应体系计，包括25μL 2×Taq PCR Master Mix，2.5μL基因组DNA，正反向引物各1μL，20.5μL水。

更优选地，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸5min，4度保存。

本发明还提供了一种所述SNP标记或所述引物组或所述试剂盒在翘嘴鳜育种中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：SNP标记验证

试验材料：

随机选取1000为翘嘴鳜，以100个具有极端表型的个体(群体中最大的50个个体和最小的50个个体)作为实验样本，验证GWAS鉴定的SNP标记的有效性。

利用Samtools获得SNP标记上游和下游250bp的序列。

通过使用软件Primer 5(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA，USA)设计引物。在20μL反应体积中进行PCR，其中包括10μL 2×PCR Master Mix(Dongsheng，China)和3μL 10ng/uL基因组DNA、5μL PCR级水、1μL正向和反向引物。使用以下热循环程序进行PCR扩增反应：在95℃下3min的一个循环，在95℃下30s、在60℃下30s和在72℃下30s的35个循环，然后在72℃下最终延长10min。PCR产物经1.7％琼脂糖凝胶电泳检测。

然后使用ABI 3730XL测序仪(Applied Biosystems，USA)对PCR产物进行测序。通过使用软件Snapgene(可在http://snapgene.com获得)，测序文件用于检测100个个体的SNP的基因型。请参考图3，结果显示SNP标记与生长性状显著相关。

表1：基因型与生长性状的相关性

通过图1至图3、以及表1结合分析：曼哈顿图是一种以染色体上的位置为横轴，统计显著性为纵轴的可视化图表。它直观地展示出在GWAS分析中与感兴趣的表型相关的基因区域。通过观察曼哈顿图上的峰值，研究人员可以快速识别出显著性SNP(单核苷酸多态性)的分布情况。这些显著性SNP可能代表着与特定疾病或表型相关的遗传变异。首先对基因型与生长相关性状进相关性分析，分析指标包括与翘嘴鳜生长性状相关的全长、体长、体重、体高和体宽等5项生长性状指标，从数据和图表可知，基因型AA的全长、体长、体重、体高和体宽等5项生长性状指标远高于基因型AC和基因型CC，这表明基因型AA的生长性状分别与基因型AC和基因型CC均存在显著差异，基因型AA优于基因型AC和基因型CC，故若筛选AA基因型个体，便筛选出所需要的快速生长的翘嘴鳜亲本。其次，检测本发明所提供的SNP标记所筛选出的AA型翘嘴鳜个体，其生长速度要显著高于AC型个体。综合来看，通过使用本发明的SNP引物和方法筛选的翘嘴鳜AA基因型个体，其生长速度显著高于AC型个体，对翘嘴鳜品种的选育工作提供了快速准确的检测方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP标记，其特征为，所述SNP标记位于低密度脂蛋白受体A(LDLRA)基因序列的第1605位，其碱基为A或C；所述LDLRA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述引物组。

4.一种筛选生长优势的翘嘴鳜的方法，其特征在于，所述方法包括：检测权利要求1所述SNP标记，筛选具有AA纯合型的个体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)剪取待测翘嘴鳜尾鳍鳍条；(2)将所取鳍条置于无水乙醇中保存；(3)提取待测翘嘴鳜的基因组DNA；(4)采用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，对所述待测翘嘴鳜的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；(5)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；(6)基于所述测序结果，确定所述待测翘嘴鳜的SNP标记的基因型是否为AA纯合型个体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征为，所述PCR扩增的反应体系为：以50μL总体积反应体系计，包括25μL 2×Taq PCR Master Mix，2.5μL基因组DNA，正反向引物各1μL，20.5μL水。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。

8.权利要求1所述SNP标记或权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂盒在翘嘴鳜中的应用。