CN117683911B - 一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关snp分子标记的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关SNP分子标记的引物，包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO：1所示，和SEQ ID NO：2所示，所述SNP分子标记位于棕点石斑鱼3号染色体的753101位碱基处，其突变类型为C/T，命名为Chr3:753101C>T，所述饲料蛋白利用性状包括低蛋白饲料投喂下个体体重增重率和体长增长率，其中，CC基因型为优选基因型，该基因型个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型，还公开了包括所述引物的试剂盒和选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼的方法，以及上述引物、试剂盒或方法在选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼中的应用。
Description
技术领域
本发明属于水产动物分子标记技术领域，具体涉及一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关SNP分子标记的引物及其应用。
背景技术
棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）隶属于鲈形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑鱼属（Epinephelus），又名褐点石斑鱼，俗称老虎斑。该物种在三大洋的热带与亚热带海域有广泛分布，其肉质细嫩、营养丰富、脂肪含量低、蛋白含量高，具有很高的食用价值，是养殖和捕捞的主要海水鱼品种。棕点石斑鱼在我国已成功实现人工苗种的繁育和生产，广泛养殖于广东、福建和海南等东南沿海省份，人工养殖条件下棕点石斑鱼可以实现全年产卵，是杂交育种的理想母本，因此其在石斑鱼杂交育种研究方面也有大量应用，例如由广东省海洋渔业试验中心培育出的虎龙杂交斑（棕点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus♀ × 鞍带石斑鱼Epinephelus lanceolatus♂），由中国水产科学研究院黄海水产研究所培育的金虎杂交斑（棕点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus♀ × 蓝身大斑石斑鱼Epinephelus tukula♂），均有明显的杂种优势，得到了广泛养殖。
棕点石斑鱼是肉食性鱼类，饲料蛋白质的含量对其良好生长十分重要，鱼粉是棕点石斑鱼饲料最主要的蛋白源，占到饲料总质量的一半以上。野生捕捞渔业是鱼粉的主要来源，但是近年来鱼粉供应逐渐减少，价格不断提高，棕点石斑鱼的养殖成本也随之增加，影响到了棕点石斑鱼养殖行业的进一步发展，同时对鱼粉的高度依赖往往造成饲料营养过剩，对海洋鱼类资源有害，不利于水产养殖的可持续发展。利用现代生物育种技术，对棕点石斑鱼饲料蛋白质利用性状开展分子标记的研究和开发，培育出生长快、饲料蛋白需求量低等优良性状的新品种，有助于降低饲料成本，提高养殖效率，是棕点石斑鱼养殖行业可持续发展的必要条件。
分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，其不易受外界环境影响，具有多态性和遗传稳定性高、数量多、高度一致性以及检测方便的优势。单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）是指基因组水平上由单个核苷酸的替换、颠换、缺失或插入等变化引起的DNA序列多态性。作为第三代分子标记技术，它利用生物基因组序列中的单个核苷酸的差异来鉴别同种生物不同个体之间的差异，相比于前几代分子标记技术优势更为突出，使用SNP分子标记能更方便地定位到与优势性状相关联的基因型或等位基因，已被广泛应用于动植物选择育种、种质资源保护等领域。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关SNP分子标记的引物、试剂盒以及利用所述引物或试剂盒选育具有优良饲料蛋白利用性状的棕点石斑鱼的方法。
本发明的目的还在于提供上述引物、试剂盒或方法在选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白高效利用性状相关SNP分子标记的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述SNP分子标记位于棕点石斑鱼3号染色体的753101位碱基处，其突变类型为C/T，命名为Chr3:753101C>T，其中，CC基因型为优选基因型，该基因型个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型。
可选地，所述饲料蛋白利用性状包括低蛋白饲料投喂下个体体重增重率和体长增长率。
具体地，上游引物和下游引物的序列如下：
上游引物：5'-ACTTCTAGTACCACAGTGG-3'（如SEQ ID NO：1所示）；
下游引物：5'-TCAGAAGTGTCTGCAGAGA-3'（如SEQ ID NO：2所示）。
本发明通过全基因组关联分析解析棕点石斑鱼混合家系群体的饲料蛋白利用性状，筛选到一个与低蛋白饲料投喂下个体体重增重率和体长增长率相关联的候选SNP分子标记，它位于3号染色体的753101位碱基处，突变类型为C/T，命名为Chr3: 753101C>T，其中，CC基因型为优选基因型，该基因型个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型；并且在另一个棕点石斑鱼群体中进一步验证，确定了该SNP位点与饲料蛋白高效利用性状相关联。
本发明还提供了一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白高效利用性状相关SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。
进一步地，本发明还提供了一种选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测棕点石斑鱼个体鳍条DNA；
（2）利用所述的引物或所述试剂盒对提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
（3）对扩增产物进行测序分析，确定待测棕点石斑鱼个体的SNP分子标记（Chr3:753101C>T SNP位点）的基因型，所述SNP分子标记的基因型中CC基因型的个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述引物在选育具有优良饲料蛋白利用性状的棕点石斑鱼中的应用。
本发明还进一步公开了上述试剂盒或方法在选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼中的应用。
本发明具有以下优点：
（1）本发明通过全基因组关联分析解析棕点石斑鱼混合家系群体的饲料蛋白利用性状，筛选到一个与低蛋白饲料投喂下个体体重增重率和体长增长率相关联的候选SNP位点，命名为Chr3: 753101C>T；并且在另一个棕点石斑鱼群体中进一步验证，确定了该SNP位点与饲料蛋白高效利用性状相关联；本发明SNP标记通过本发明中设计的一对引物即可判定，操作简单方便，且结果准确可靠；
（2）本发明提供的检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关的SNP分子标记的引物和试剂盒在棕点石斑鱼分子标记辅助育种中具有应用前景，该SNP分子标记不受个体年龄、性别等因素的影响，可用于早期棕点石斑鱼的筛选，能够显著缩短棕点石斑鱼育种时间。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1为实施例1中实验鱼去除极端个体后的增重率和体长增长率的分布图；
图2为实施例1中棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状全基因组关联分析曼哈顿图（中）和QQ图（右），其中上为体长增长率，下为体重增重率，左表为染色体与参考序列的对应关系，曼哈顿图中红线表示全基因组显著性阈值；
图3为实施例2中SNP位点Chr3: 753101C>T不同基因型增重率和体长增长率统计，其中A：增重率验证群体sanger测序验证结果；B：增重率验证群体全基因组高通量测序筛选结果；C：增长率验证群体sanger测序验证结果；D：增长率验证群体全基因组高通量测序筛选结果（BG:极大群体；SG：极小群体）。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。除非特别说明，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。
为更为详细地说明本发明，以下通过实施例进行展开。需要强调的是，以下实施例仅为了解释本发明，并不用于限制本发明的实质范围或内容。
其中石斑鱼全基因组液相芯片“石斑1号”可参考202310292624.4申请中所述。
实施例1：棕点石斑鱼饲料蛋白高效利用性状相关SNP分子标记的筛选及引物设计
实验棕点石斑鱼饲养于海南晨海水产有限公司，为4月龄混合家系。
随机取500尾实验鱼，测量记录每尾鱼的初始体长和体重，使用低蛋白饲料投喂90天后记录终末体长和体重，计算每尾鱼的增重率和体长增长率，并同时采集保存每尾鱼的尾鳍样品于95%酒精-20℃保存，用于DNA提取和测序。如图1所示，实验群体的增重率和体长增长率符合正态分布。
使用基因组提取试剂盒（天根生物科技有限公司，北京）提取鳍条DNA，具体步骤如下：
（1）将实验鱼鳍条样本约30 mg剪碎，进行研磨后置入1.5 mL离心管中，加入200 μL缓冲液GA，涡旋振荡30s。加入20 μL蛋白酶K溶液，在56℃振荡金属浴下裂解约2 h；
（2）加入200 μL缓冲液GB，加入后进行充分吹吸以保证和混匀。后置于70℃水浴，如若溶液变澄清则可以简单离心去除管壁水珠并进行下一步，若未变澄清则继续水浴，水浴时间约为10min以上；
（3）加入200 μL无水乙醇再振荡15 s以进行DNA沉淀，进行简单离心；
（4）将吸附柱CB3放入收集管，将离心管中的溶液与沉淀加入一个吸附柱中，在12000 rpm下离心30 s，去除废液再将吸附柱放回；
（5）将500 μL缓冲液GD加入吸附柱中，12000 rpm下离心30s，倒掉废液再将吸附柱放回；
（6）将600 μL漂洗液PW加入吸附柱中，12000rpm下离心30s，倒掉废液再将吸附柱放回，之后再重复一次本步骤；
（7）将吸附柱置入灭菌后的1.5 mL离心管，向吸附柱中心悬空加入150 μL洗脱缓冲液TE，常温环境下放置5 min，之后进行离心，参数为12000 rpm - 2 min，将过滤后的液体重新吸取加入吸附柱中，再重复进行一次离心。最后将过滤后的液体进行分装与保存；
所有DNA均经1％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）判断电泳结果，以保证基因组完整性。合格DNA样品随后用微量紫外分光光度计（Quawell，美国）测量浓度，并统一调整至50ng/μL。样品随后使用石斑鱼全基因组液相芯片“石斑1号”按照液相探针杂交的靶向基因捕获技术(http://www.molbreeding.com/index.php/Technology/GenoBaits.html)标准流程构建液相芯片DNA杂交捕获文库，合格文库使用华大MGISEQ2000平台测序。获得的原始测序数据经质控和处理后，使用BWA 软件将所有的测序Reads比对到“石斑1号”芯片的参考基因组上，使用GATK软件的标准流程检测SNP，进行基因分型。获得SNP位点共计45714个，在过滤后共得到11683个高质量SNP位点。
之后对样本进行完整度过滤，筛选SNP检出率超过80%的样本，11683个位点全部合格。使用Tassel软件的混合线性模型（Mixed linear model，MLM）进行棕点石斑鱼个体的增重率、体长增长率全基因组关联（Genome-wide association studies，GWAS）分析。随后，基于Bonferroni校正，将全基因组显著性SNP标记阈值设定为-log10(P value = 0.05/11683) =5.37（图2）。
经关联分析发现与个体增重率紧密关联的SNP标记36个，与个体体长增长率紧密关联的SNP标记17个，具体数据见表1。
表1 与个体增重率、体长增长率显著相关SNP位点信息
备注：Mark以石斑鱼全基因组液相芯片“石斑一号”参考基因组为基准。
从表1中发现，有15个SNP位点同时与个体的增重率和体长增长率相关，本发明选用了对增重率和体长增长率的变异表型解释最高的SNP位点作为分子标记，它位于3号染色体第753101个碱基处，突变类型为C/T，命名为Chr3: 753101C>T，其中CC基因型为优选基因型，其饲料蛋白利用性能更佳。
实施例2棕点石斑鱼饲料蛋白高效利用性状相关的SNP分子标记验证
验证试验使用不同的棕点石斑鱼群体，随机取200尾实验鱼，记录每尾鱼的初始体重和体长，使用低蛋白饲料投喂90天后记录终末体重和体长，计算体重增重率和体长增长率，其中增重率最高的50条鱼作为增重率极大群体，增重率最低的50条鱼作为增重率极小群体，体长增长率作同样区分处理，并采集保存每尾鱼的尾鳍样品于DNA提取，DNA提取具体流程同实施例1。
随后，以上述提取的DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增，获得包含SNP Chr3: 753101C>T的基因片段，如SEQ ID NO:3所示，SNP Chr3: 753101位于如SEQ ID NO:3所示序列的第157位。
具体地，上游引物和下游引物的序列如下：
上游引物：5' -ACTTCTAGTACCACAGTGG-3'（如SEQ ID NO：1所示）；
下游引物：5' -TCAGAAGTGTCTGCAGAGA-3'（如SEQ ID NO：2所示）。
PCR扩增总体积20μL，具体反应体系如表2。
表2 PCR扩增反应体系
具体扩增程序如下：95℃预变性5 min；40个循环的95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸5 min。
包含SNP Chr3: 753101C>T的基因片段的序列如下：
CTGGACCTGGTGCCTTGTTCTTTTTGAGGTTTTCAATAGCTTTTTTTATTTCTTGTTTTTTGGACTTGTTTGTATTGACCTGTGGGGGGTGTACATATAGTACTAATACCACAGAACCAACTTCTAGTACCACAGTGGTGGTACCACTAGTTCTAGCAGGAGTGTTTGACAGGTGTTTCTCTGCAGACACTTCTGATGTTCTGATCTTCTACACTCTGGATGGGTCGAAGCCGGCGGCAGTGCAGCGGGGGTCAGCTGGCAGCAGCAGGAAGTACACTGGGCCCATCCTTCTGCCTGCAGGTCGAG（SEQ ID NO:3所示）。
取2μL反应产物于1 %琼脂糖凝胶电泳检测，合格样品用于后续测序，以确定每个个体样本在SNP Chr3: 753101C>T的基因型。
随后统计了不同基因型个体的增重率和增长率数据，分析结果如图3所示。
图3显示了对SNP位点SNP Chr3: 753101C>T进行验证的结果。A：增重率验证群体sanger测序验证结果；B：增重率验证群体全基因组高通量测序筛选结果；C：增长率验证群体sanger测序验证结果；D：增长率验证群体全基因组高通量测序筛选结果（BG：极大群体；SG：极小群体）。
图3中的结果表明：在棕点石斑鱼中，SNP Chr3: 753101C>T不同基因型个体间增重率和体长增长率存在显著差异；其中，CC基因型个体在增重率和增长率极大群体中均占比较多，在增重率和增长率极小群体中均占比较少；而TT基因型个体在增重率和增长率极大群体中均占比较少，在增重率和增长率极小群体中均占比较多。
综上，SNP Chr3: 753101C>T与棕点石斑鱼饲料蛋白高效利用性状显著关联，其基因型可通过一对引物判定，操作简单可靠，该SNP位点在棕点石斑鱼分子标记辅助育种中具有应用前景。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
Claims (6)
1.一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关SNP分子标记的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述SNP分子标记为如SEQ ID NO:3所示序列的第157位，其突变类型为C/T，其中，CC基因型的个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型。
2.一种检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关SNP分子标记的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1中所述的引物。
3.一种选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取待测棕点石斑鱼个体鳍条DNA；
（2）利用权利要求1中所述的引物或权利要求2所述试剂盒对提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
（3）对扩增产物进行测序分析，确定待测棕点石斑鱼个体的SNP分子标记的基因型，所述SNP分子标记的基因型中CC基因型的个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型；
所述SNP分子标记为如SEQ ID NO:3所示序列的第157位，其突变类型为C/T。
4.权利要求1所述引物在选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼中的应用；所述引物用于检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关SNP分子标记，所述SNP分子标记为如SEQ ID NO:3所示序列的第157位，其突变类型为C/T，其中，CC基因型的个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型。
5.权利要求2所述试剂盒在选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼中的应用，所述试剂盒用于检测与棕点石斑鱼饲料蛋白利用性状相关SNP分子标记，所述SNP分子标记为如SEQ ID NO:3所示序列的第157位，其突变类型为C/T，其中，CC基因型的个体饲料蛋白利用性状优于CT和TT基因型。
6.权利要求3所述方法在选育具有饲料蛋白高效利用性状的棕点石斑鱼中的应用。
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