CN104561351A - 一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法 - Google Patents

Abstract

一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法，涉及石斑鱼。提取石斑鱼个体基因组DNA，PCR扩增其线粒体COI基因和核基因RYR3，COI基因PCR产物直接测序，RYR3基因的PCR产物经直接测序和克隆测序，获得RYR3的等位基因序列，与NCBI数据库中进行同源性比对，若所获得的RYR3等位基因序列分属于两种石斑鱼，则可判定该个体为杂交个体。进步结合COI序列的同源比对结果，则可确定杂交石斑鱼个体的父本种类和母本种类。利用797bp的核基因兰尼受体3序列片段和线粒体654bp的COI基因片段，可快速、准确地鉴别杂交石斑鱼个体。

Description

一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法

技术领域

本发明涉及石斑鱼，尤其是涉及一种利用797bp的核基因兰尼受体3(RYR3)序列片段和654bp线粒体COI基因片段快速、准确地鉴别杂交石斑鱼个体的方法。

背景技术

石斑鱼类，一般指鲈形目石斑鱼科下的所有鱼类，全球共有16个属160余种，我国沿海分布11属60余种。石斑鱼属热带亚热带鱼类，喜栖息在沿岸岛屿附近的岩礁、砂砾、珊瑚礁底质的海区。其不仅种类繁多，还具有非常重要的商业价值，是热带亚热带近岸岩滩和珊瑚礁渔业的重要代表。但由于其为定居性鱼类，长期以来相似生活环境造成的平行演化使得它们在外部及骨骼形态上都表现出较高趋同性，许多种类之间缺乏可用于比较的同源性状，分类上多以条纹、斑点及体色作为主要依据。然而在不同生理条件下，许多石斑鱼类的体色花纹往往会发生明显变化，某些种类的幼鱼与成鱼之间也有显著差别，因此，石斑鱼类的分类一直是鱼类系统分类学中的一个难题。

尽管石斑鱼有很重要的经济和社会效益，但现阶段对其野生资源的管理非常缺乏，有些种类已面临灭绝或处于濒危的地位。石斑鱼养殖业的兴起在一定程度上缓解了对其野生资源的捕捞压力。石斑鱼种间亲缘关系较近，容易出现杂交现象，在生产上，为获得品性更为优良的石斑鱼，种间杂交的方法已被广为应用。但由于石斑鱼杂交后代可育，而杂交后代由于与双亲的形似特征使得其极易混入进行杂交育种的亲本群体，导致杂交子代的品质出现严重衰退，优良性状消失。此外杂交个体的逃逸现象也会对野生群体的基因库造成一定影响，不利于种质资源的保护。因此有效的鉴别和管理杂交石斑鱼无论对石斑鱼遗传育种还是资源保护都是必不可少的。

杂交石斑鱼通常具有两种不同亲本的形态特征，非常容易造成混淆。这使得单从形态鉴定杂交石斑鱼要比鉴定纯种鱼类更加困难，因此我们希望能够借助分子手段解决杂交石斑鱼鉴定这个问题。但是传统条形码基因(如COI)都是线粒体基因，由于线粒体为母系遗传，只含有母本的遗传信息，因此无法鉴别某个个体是否为杂交种。核基因包含了双方亲本的遗传信息，理论上可以用作杂交种的鉴别，但目前国际上尚未有通用的核基因作为可作为物种鉴定的标准基因。通过筛选，我们发现核基因兰尼受体3(RYR3)为单拷贝核基因，且在石斑鱼类中种内相对保守，而种间则存在较大变异，因此我们设计出一对适合在石斑鱼类中扩增核基因兰尼受体3的通用引物，利用核基因与线粒体基因序列信息相结合的方式，并借助NCBI上较全的石斑鱼相关序列数据，提出了一种可快速准确鉴别杂交石斑鱼个体的技术方法。

中国专利CN102373283A公开一种用于石斑鱼成分鉴别的特异性寡核苷酸引物、PCR检测试剂盒和检测方法，所述引物对由正向引物Grof和反向引物Gror组成，其核苷酸序列见SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。该发明具有引物特异性好，检测方法快速准确的特点，为进出口鱼类食品安全提供了保证。

发明内容

本发明旨在提供一种利用797bp的核基因兰尼受体3(RYR3)序列片段和线粒体654bp的COI基因片段快速、准确地鉴别杂交石斑鱼个体的方法。

本发明包括以下步骤：

1)提取石斑鱼个体基因组DNA；

2)设计并合成一对石斑鱼类核基因RYR3的通用引物如下：

RYR3F15:5’-GGAACTATCGGTAAGCAGATGG-3’

RYR3R849:5’-GCCAGTGAAGAGCATCCAGAAGAAG-3’

3)以步骤1)所得的基因组DNA为模版，对RYR3基因进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小为797bp；

4)将步骤3)所得的PCR扩增产物直接测序，若所得序列无单核苷酸杂合位点，则直接判断该待测个体为纯种石斑鱼个体；

5)若步骤4)所得序列存在单核苷酸杂合位点，则进一步将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，链接至pMD19-T载体，转化E.coli DH5α进行克隆，挑取阳性克隆，PCR检测并测序，最终得到两个石斑鱼RYR3等位基因序列；

6)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤5)所得两条RYR3等位基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，若两条等位基因序列均与同种石斑鱼同源性最高，则待测个体仍为纯种石斑鱼；若两条等位基因序列分别与两个不同种类的石斑鱼有最高的同源性，则该待测石斑鱼个体为杂交个体；

7)为进一步确定杂交个体的双方亲本，以步骤1)所得的基因组DNA为模版，使用鱼类条形码COI基因通用引物进行PCR扩增，并将PCR产物直接测序，得到该杂交石斑鱼线粒体COI基因序列；

8)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤7)所得COI基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，与其同源性最高的种类即为该杂交石斑鱼的母本；

9)结合两条RYR3等位基因序列对应的两种石斑鱼，排除与母本相同的种类，另一个种类即为杂交石斑鱼的父本。

在步骤3)、7)中，所述PCR扩增的反应条件可为：94℃变性5min，进入30个循环：94℃变性30s，55℃退火，30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。

本发明利用797bp的核基因兰尼受体3(RYR3)序列片段和线粒体654bp的COI基因片段，可快速、准确地鉴别杂交石斑鱼个体。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步说明。

本发明实施例选用市场及养殖场上所购得的多种杂交和纯种石斑鱼进行鉴定。

实施例1：

1)选取广东大亚湾养殖场的“珍珠龙胆”石斑鱼，经调研已知其为杂交个体，父本为鞍带石斑鱼，母本为褐点石斑鱼。按常规方法采用分氯仿抽提法提取基因组DNA；

2)合成一对石斑鱼类核基因RYR3的通用引物

RYR3F15:5’-GGAACTATCGGTAAGCAGATGG-3’

RYR3R849:5’-GCCAGTGAAGAGCATCCAGAAGAAG-3’

3)以步骤1)所得基因组DNA为模版，对RYR3基因进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min，进入30个循环：94℃变性30s，55℃退火,30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。得到的扩增产物片段大小为797bp；

4)将步骤3)所得PCR产物直接进行测序，序列存在单核苷酸杂合位点13个，分别在第84，123，147，159，174，222，307，318，375，405，576，609和612bp位点处；

5)将步骤3)所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，链接至pMD19-T载体，转化E.coli DH5α进行克隆，挑取阳性克隆，PCR检测并测序，最终得到两条“珍珠龙胆”石斑鱼RYR3等位基因的序列；

6)登陆NCBI网站，使用BLAST功能将步骤5)所得两条RYR3等位基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，发现其中一条与褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)同源性最高(100％)，而另一条与鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)同源性最高(100％)，因此证实该“珍珠龙胆”石斑鱼为杂交个体；

7)以步骤1)所得的基因组DNA为模版，使用鱼类条形码COI基因通用引物进行PCR扩增，反应条件与步骤3)所述相同，得到的扩增产物片段大小为654bp；将PCR产物直接测序，得到“珍珠龙胆”石斑鱼线粒体COI基因序列；

8)登陆NCBI网站，使用BLAST功能将步骤7)所得序列与网站上所有序列进行同源性比对，发现该序列与褐点石斑鱼同源性最高(100％)，因此确定褐点石斑鱼为“珍珠龙胆”石斑鱼的母本种类；

9)由于已通过两个RYR3等位基因序列确定“珍珠龙胆”石斑鱼的双方亲本为褐点石斑鱼和鞍带石斑鱼，由步骤8)可推测出鞍带石斑鱼为其父本，与已知结果一致。

实施例2：

与实施例1类似，其不同在于待检测对象为福建东山岛石斑鱼养殖场送检的一批斜带石斑鱼(7尾)进行实验。PCR扩增其RYR3基因片段，经直接测序后发现大多数(5尾)个体无单核苷酸杂合位点，因此判断这部分待测个体均为纯种石斑鱼个体。对其RYR3序列进行同源性比对后发现该序列与斜带石斑鱼(E.coioides)同源性最高(100％)，其COI序列也与斜带石斑鱼同源性最高(100％)，进一步证实这些石斑鱼个体为纯种的斜带石斑鱼。但我们发现有少数(2尾)个体的RYR3基因有4个单核苷酸杂合位点，分别在其第309，364，594和595处。对其两条RYR3序列进行同源性比对后发现其中一条与斜带石斑鱼(E.coioides)同源性最高(100％)，而另一条与点带石斑鱼(E.malabaricus)同源性最高(100％)，因此判断这2尾石斑鱼为点带石斑鱼和斜带石斑鱼的杂交子代；其COI序列也与点带石斑鱼同源性最高(100％)，因此判断这些杂交个体的母本为点带石斑鱼，父本为斜带石斑鱼。

实施例3：

与实施例1类似，其不同在于待检测对象为来自福建厦门养殖场的赤点石斑鱼。PCR扩增其RYR3基因片段，经直接测序后发现无单核苷酸杂合位点，因此判断该待测个体为纯种石斑鱼个体。对其RYR3序列进行同源性比对后发现该序列与赤点石斑鱼(E.akaara)同源性最高(99.87％)，其COI序列也与赤点石斑鱼同源性最高(100％)，进一步证实该石斑鱼个体为纯种的赤点石斑鱼。

实施例4:

与实施例1类似，其不同在于待检测对象为来自海南海口市场的布氏石斑鱼。PCR扩增其RYR3基因片段，经直接测序后发现有1个单核苷酸杂合位点，对其两条RYR3序列进行同源性比对后发现两条序列均与布氏石斑鱼(E.bleekeri)同源性最高，相似度分别为100％和99.87％，其COI序列也与布氏石斑鱼同源性最高(99.85％)，因此判断该石斑鱼个体为纯种的布氏石斑鱼。

Claims (2)

1.一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取石斑鱼个体基因组DNA；

2)设计并合成一对石斑鱼类核基因RYR3的通用引物如下：

RYR3F15:5’-GGAACTATCGGTAAGCAGATGG-3’

RYR3R849:5’-GCCAGTGAAGAGCATCCAGAAGAAG-3’

3)以步骤1)所得的基因组DNA为模版，对RYR3基因进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小为797bp；

4)将步骤3)所得的PCR扩增产物直接测序，若所得序列无单核苷酸杂合位点，则直接判断该待测个体为纯种石斑鱼个体；

5)若步骤4)所得序列存在单核苷酸杂合位点，则进一步将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，链接至pMD19-T载体，转化E.coli DH5α进行克隆，挑取阳性克隆，PCR检测并测序，最终得到两个石斑鱼RYR3等位基因序列；

6)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤5)所得两条RYR3等位基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，若两条等位基因序列均与同种石斑鱼同源性最高，则待测个体仍为纯种石斑鱼；若两条等位基因序列分别与两个不同种类的石斑鱼有最高的同源性，则该待测石斑鱼个体为杂交个体；

7)为进一步确定杂交个体的双方亲本，以步骤1)所得的基因组DNA为模版，使用鱼类条形码COI基因通用引物进行PCR扩增，并将PCR产物直接测序，得到该杂交石斑鱼线粒体COI基因序列；

8)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤7)所得COI基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，与其同源性最高的种类即为该杂交石斑鱼的母本；

9)结合两条RYR3等位基因序列对应的两种石斑鱼，排除与母本相同的种类，另一个种类即为杂交石斑鱼的父本。

2.如权利要求1所述一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法，其特征在于在步骤3)、7)中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃变性5min，进入30个循环：94℃变性30s，55℃退火，30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。