CN108588241A - 鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物及方法，该用于鉴别棕点石斑鱼的分子特异性引物的如SEQ ID NO:1所示上游引物LHF：5’‑GCTAATTCGAGCTGAGCTT‑3’；如SEQ ID NO:2所示下游引物LHR：5’‑GCCAATTATAAGTGGAA‑3’。本发明利用分子特异性标记引物LHF/LHR，通过常规PCR方法对棕点石斑鱼进行快速的分子鉴定，方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成，是形态特征辨别棕点石斑鱼的有效辅助。

Description

鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物及方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异引物对棕点石斑鱼标本快速鉴别的方法。

背景技术

棕点石斑鱼(学名：Epinephelusfuscoguttatus)又称，俗称老虎斑，褐点石斑，隶属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)。棕点石斑鱼为暖水性海洋底层鱼类，分布范围在北纬29°至南纬27°，东经33°至西经171°之间，广泛分布于印度洋及太平洋地区，棕点石斑鱼常栖息于泻湖顶部、渠道、珊瑚丰富的干净水域，一定年龄大小时，雌鱼发生性转变，变成雄鱼。棕点石斑鱼资源量稀少，营养丰富，肉质鲜美，经济价值高，且抗病力强，对配合饲料的适应性较好，市场潜力大，养殖前景看好。目前，棕点石斑鱼已经成为我国福建，广东，海南，台湾等地海水养殖的重要养殖鱼类。随着养殖规模集约化，病害的频繁发生，严重影响到石斑鱼养殖业的可持续发展。杂交育种是解决种质资源退化的有效手段，迄今已获得至少8种具有不同优良性状的杂交石斑鱼，如虎龙斑是棕点石斑鱼(Epinephelusfuscogutatus♀，俗称老虎斑)和鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus♂，俗称龙趸)杂交获得的新型杂交斑。具有父母双方的优点(生长快、抗病能力强)。棕点石斑鱼具有抗病力强的优点，选择他作为亲本进行杂种育种，子代能表现出其显著的杂种优势。目前，对棕点石斑鱼的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。由于石斑鱼种子资源明显下降；加之国内外有关棕点石斑鱼的基础生物学研究较少。因此，要实现石斑鱼遗传育种的目标，首要任务是对传统育种技术进行改造，利用生物技术向传统育种技术进行渗透，提高亲本选育和物种鉴定工作。

DNA条形码技术(DNA barcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前在动物中最常见的分子标记是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome coxidase I,COI)基因的部分序列。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对棕点石斑鱼进行快速、有效的鉴定。

物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些经济物种，分类鉴定工作就显得尤其重要。该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决鉴定中标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且有利于快速鉴定。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。也没有棕点石斑鱼的相关基因序列。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴别棕点石斑鱼的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

用于鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物，该引物的核苷酸序列如下：

如SEQ ID NO:1所示上游引物LHF：5’-GCTAATTCGAGCTGAGCTT-3’；

如SEQ ID NO:2所示下游引物LHR：5’-GCCAATTATAAGTGGAA-3’。

该对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对棕点石斑鱼标本的COI区序列的克隆序列，然后通过NCBI的序列比对，上述引物具有极高的专一性，用此对引物进行PCR扩增，可以获得150bp左右的特异性片段。

本发明还涉及上述的分子特异性标记引物(LHF/LHR)在鉴别棕点石斑鱼标本中的应用。

本发明还涉及上述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别棕点石斑鱼标本的试剂盒中的应用。

一种用于鉴别棕点石斑鱼的试剂盒，该试剂盒中包含上述的分子特异性标记引物。该试剂盒中还包含PCR常用试剂。

一种快速鉴别棕点石斑鱼的方法，以待测样本的基因组DNA为模板，以上述的分子特异性标记引物(LHF/LHR)作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为棕点石斑鱼。上述的DNA目的条带为约150±10bp的DNA目的条带。

上述PCR扩增的反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，50℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。

上述方法中扩增的选择、基因组DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。

需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于棕点石斑鱼的形态学特征初步的判断，再将判断为棕点石斑鱼的标本运用发明方法鉴别。

本发明所述鉴别棕点石斑鱼方法的具体步骤如下：

(1)从待鉴定组织样本中分离提取基因组DNA；

(2)生物公司试剂盒方法提取样品中的基因组DNA，于-20℃保存备用。

(3)以步骤(2)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(LHF/LHR)作为扩增引物，进行PCR扩增；

PCR反应体系(总体积为50μL)组成为：

PCR反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，50℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。

取2μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示，检出大小约为150±10bp的条带，可初步判定待测样本可能是棕点石斑鱼。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明的分子特异性标记引物(LHF/LHR)可对棕点石斑鱼进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别棕点石斑鱼的有效辅助手段。

附图说明

图1是采用本发明的分子特异性标记引物对棕点石斑鱼进行PCR扩增的电泳图。其中，M：DNA标准分子量标；1,2为目标的片段；3,4为空白；5,6为阴性对照。

图2是采用本发明的分子特异性标记引物对实施例2进行PCR扩增的电泳图，其中，M：DNA标准分子量标；1，2为目标的片段；3，4为鞍带石斑鱼的片段；5，6为斜带石斑鱼的片段；7，8为空白。

图3是采用本发明的分子特异性标记引物对实施例3进行PCR扩增的电泳图，其中，M：DNA标准分子量标；1-5为非棕点石斑鱼的组织样本；6-10为棕点石斑鱼的组织样本；

具体实施方式

本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别棕点石斑鱼。下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：

(1)待测棕点石斑鱼基因组DNA的提取

取棕点石斑鱼组织样品，剪碎后使用基因组DNA提取试剂盒进行提取，利用1.5％琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，于-20℃冰箱存放备用。

(2)设计合成特异性PCR扩增引物，设计合成基于棕点石斑鱼的特异性引物。

上游引物LHF：5’-GCTAATTCGAGCTGAGCTT-3’；

下游引物LHR：5’-GCCAATTATAAGTGGAA-3’。由技术人员设计，并由引物设计公司合成。

(3)分子特异性标记引物(LHF/LHR)的PCR扩增

PCR反应体系50μL：Buffer I 5μL，dNTPs 4μL，Long Tag 1μL，LHF引物(10μM)1μL，LHR引物(10μM)1μL，DNA模板(约10ng/μL)1μL，ddH₂O 37μL。

PCR反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，50℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。

(4)电泳检测：

取2μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。

M：DNA标准分子量标；1,2为目的的片段；3,4为空白；5,6为阴性对照。由图1可见，扩增出分子量约为150bp左右的特异性DNA条带。

实施例2：

用实施例1的方法进行棕点石斑鱼、斜带石斑鱼、鞍带石斑鱼三种冰冻鱼块检测，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，在实验人员未知物种名称的情况下开展实验，图2的结果表明仅仅有一种鱼块可扩增出分子量约为150bp左右的特异性DNA条带，另两种鱼块样本不能扩增出，检测结果与取样人记录信息完全一致。因此可表明本发明的引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别棕点石斑鱼。

实施例3：

从鱼类组织样本中选取2组肌肉组织样，保存在95％酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的鱼类，其中一组为棕点石斑鱼(5个样品)，另一组为其他品种(5个样品)，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，在图3中，PCR产物测序结果显示其中一组的5个样品能够扩增出150bp左右的特异性DNA条带为棕点石斑鱼的组织样本，另一组的5个样品为非棕点石斑鱼的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致。

上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳华大海洋科技有限公司

深圳市华大海洋研究院

<120> 鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物及方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctaattcga gctgagctt 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccaattata agtggaa 17

Claims (9)

1.用于鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物，其特征在于：该引物的核苷酸序列如下：

如SEQ ID NO:1所示上游引物LHF：5’-GCTAATTCGAGCTGAGCTT-3’；

如SEQ ID NO:2所示下游引物LHR：5’-GCCAATTATAAGTGGAA-3’。

2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别棕点石斑鱼中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为棕点石斑鱼。

4.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别棕点石斑鱼的试剂盒中的应用。

5.一种用于鉴别棕点石斑鱼的试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含权利要求1所述的分子特异性标记引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中还包含PCR常用试剂。

7.一种快速鉴别棕点石斑鱼的方法，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为棕点石斑鱼。

8.根据权利要求7所述的鉴别棕点石斑鱼的方法，其特征在于：所述的DNA目的条带为150±10bp的DNA目的条带。

9.根据权利要求7所述的鉴别棕点石斑鱼的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，50℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。