CN106434977A - 一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物及方法 - Google Patents
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Abstract
一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物，属于生物技术领域，所述引物序列为L5979：5’‑TTTAGTATTCGGAGCCTGAG‑3’；H6241：5’‑CCTCAACACCTGATGAGGCC‑3’。本发明还提供一种利用引物鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的方法，具体步骤如下：提取邵氏鱚与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1％；所述邵氏鱚的分子标记序列为：SEQ NO.3；所述多鳞鱚的分子标记序列为SEQ NO.4；本发明方法有助于解决鱚属鱼类种质混杂问题，且操作简单，易于掌握，准确性高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体地涉及一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物及方法。
背景技术
邵氏鱚为2016年发现新种，隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属，目前仅在台湾海峡近海有分布。其外部形态与多鳞鱚极为相似：第一背鳍具XI硬棘，第二背鳍具I硬棘及20-22软条，臀鳍具II硬棘及21-22软条，具68-73侧线鳞；脊椎骨数34-37。邵氏鱚体背部青灰色，头部背侧深色，腹侧白色；体侧侧线下部时有由黑色小点组成的模糊条带。第一及第二背鳍淡黄色，密布黑色小点；腹鳍和臀鳍黄白色，臀鳍带黑点；尾叉浅，近截形；尾鳍深褐色至深灰色。邵氏鱚同多鳞鱚一样，皆为福建近海重要的经济鱼种。其肉质细腻鲜美，具有很高的食用价值。目前用于鉴定邵氏鱚的方法还没有见正式报道。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分邵氏鱚和多鳞鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物及方法，有助于解决鱚属鱼类种质混杂问题，本发明方法操作简单，易于掌握，准确性高。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物，所述引物序列为
L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；
H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。
本发明还提供一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记方法，具体步骤如下：提取邵氏鱚与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1％；所述邵氏鱚的分子标记序列为：
CAGGCATGGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTTATCCGCGCAGAACTCAGCCAACCTGGCGCCCTGCTTGGAGATGACCAAATTTATAATGTTATTGTTACGGCGCATGCCTTCGTAATAATCTTCTTTATGGTAATACCAATTCTTATCGGAGGGTTCGGAAACTGGCTGGTCCCCTTAATGATCGGGGCCCCGGACATGGCCTTCCCCCGCATGAACAACATGAGCTTTTGGCTTCTGCCCCCGTCTTTCCTTCTTCTTCT；
所述多鳞鱚的分子标记序列为
CAGGTATGGTGGGCACGGCCCTAAGCCTGCTTATCCGAGCAGAACTTAGCCAACCTGGCGCTCTGCTTGGTGACGACCAAATTTACAATGTCATTGTCACCGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCCTTATCGGAGGGTTCGGCAACTGGCTTGTTCCCCTGATGATCGGAGCCCCTGATATGGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTCCTTCCTCCTTCTTTCCTCCTTCTCTT；
所述的PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer2.5ul
dNTPs2ul，rTaq0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；
PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
本发明与现有技术相比的有益效果：
由邵氏鱚和多鳞鱚mtDNA COI基因262bp序列排序结果可以看出邵氏鱚与多鳞鱚存在40个碱基的差异，表现为12个颠换，28个转换。其结果稳定，可重复性强。邵氏鱚(东山群体，厦门群体和台湾群体)的扩增结果一致，表现出高度的一致性。因此基于COI基因的碱基差异可以作为邵氏鱚和多鳞鱚的种质区分的分子标记。同时，鉴别方法简单。
具体实施方法
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1：
选用福建厦门沿海、福建东山和台湾彰化的邵氏鱚与福建晋江沿海的多鳞鱚，组成3个不同地理群体的邵氏鱚样本群和多鳞鱚样本群，提取4个样本群体的DNA，然后所提取的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；
所述的引物序列为L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’；所述的PCR扩增的反应体系组成为：
0.2ml离心管中依次加入：
PCR扩增程序为94℃预变性5min，(94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec)×35个循环，72℃延伸10min，4℃保存∞。对PCR产物进行纯化后测序，并对4个群体的测序结果进行比对。
由邵氏鱚和多鳞鱚mtDNA COI基因262bp序列排序结果可以看出邵氏鱚与多鳞鱚存在40个碱基的差异，表现为12个颠换，28个转换。
3个邵氏鱚群体和多鳞鱚的mtDNA COI基因262bp序列比对结果为：
其中“*”表示相同的碱基序列位点，JJD：福建晋江沿海多鳞鱚样品；XMS：福建厦门沿海邵氏鱚样品；DSS：福建东山沿海邵氏鱚样品；TWS：台湾彰化沿海邵氏鱚样品。
测序结果表明，邵氏鱚的3个地点采集的21尾样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物及方法
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工设计的引物序列L5979
<400> 1
tttagtattc ggagcctgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工设计的引物序列H6241
<400> 2
cctcaacacc tgatgaggcc 20
<210> 3
<211> 262
<212> DNA
<213> sillage sihama
<400> 3
caggcatggt aggaacagcc ctaagcctgc ttatccgcgc agaactcagc caacctggcg 60
ccctgcttgg agatgaccaa atttataatg ttattgttac ggcgcatgcc ttcgtaataa 120
tcttctttat ggtaatacca attcttatcg gagggttcgg aaactggctg gtccccttaa 180
tgatcggggc cccggacatg gccttccccc gcatgaacaa catgagcttt tggcttctgc 240
ccccgtcttt ccttcttctt ct 262
<210> 4
<211> 262
<212> DNA
<213> sillage sihama
<400> 4
caggtatggt gggcacggcc ctaagcctgc ttatccgagc agaacttagc caacctggcg 60
ctctgcttgg tgacgaccaa atttacaatg tcattgtcac cgcacatgcc tttgtaataa 120
ttttctttat agtaatgcca atccttatcg gagggttcgg caactggctt gttcccctga 180
tgatcggagc ccctgatatg gcattcccac gaatgaataa catgagcttc tgactccttc 240
ctccttcttt cctccttctc tt 262
Claims (2)
1.一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物，其特征在于所述引物序列为
L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；
H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。
2.利用权利要求1所述引物鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的方法，其特征在于具体步骤如下：提取邵氏鱚与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1％；所述邵氏鱚的分子标记序列为：SEQ NO.3；所述多鳞鱚的分子标记序列为SEQ NO.4；所述的PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer2.5ul，dNTPs2ul，rTaq0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
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-
2016
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