CN109136387A - 一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物及方法 - Google Patents

一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物及方法，引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。鉴别方法的具体步骤为：提取褐斑鯒与印度鯒的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。有益效果为：本发明分子标记引物对PCR反应的扩增较为合适，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性；本发明鉴别方法结果稳定、可重复性强、鉴别方法简单、不同个体的扩增结果一致、表现出高度的一致性。

Description

一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物及方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物及方法。
技术背景
褐斑鯒与印度鯒一样，在分类学上属于硬骨鱼纲、鲉形目、鯒科、鯒属。褐斑鯒与印度鯒形态上极为相似，背鳍鳍棘I-I-VI~VII-I，背鳍鳍条13~14，胸鳍鳍条17~19，腹鳍鳍棘I，腹鳍鳍条5，臀鳍鳍条13~14，侧线鳞83~99，侧线上鳞18~21，侧线下鳞30~35。体延长，头部平扁，向后渐细。背部暗褐色，腹部白色，背部散布褐色斑点，尾鳍白色，上具2~3条黑色条纹。主要分布于太平洋西部大陆架海域，我国黄渤海、东海、南海均有分布。褐斑鯒与印度鯒一样，皆为中国近海重要的经济鱼种。其肉质细腻鲜美，具有很高的食用价值。目前用于鉴定褐斑鯒的分子标记方法还没有见正式报道。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分褐斑鯒与印度鯒的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种对PCR反应的扩增较为合适，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性的鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物。
本发明的目的之二在于提供一种结果稳定、可重复性强、鉴别方法简单、不同个体的扩增结果一致、表现出高度的一致性的鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物，引物序列为：
12SF：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
12SR：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
本发明分子标记引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。
本发明还提供一种利用上述的引物鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，具体步骤如下：提取褐斑鯒与印度鯒的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。
作为优选，测序结果显示褐斑鯒与印度鯒种内遗传差异不大于1%。
作为优选，褐斑鯒的分子标记序列为：GCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGCGGTTATACGAGAGGCCCAAGCTGATAGACTACGGCGTAAAGGGTGGTTAAGATGAAACACACACTAAAGTCGAACGCCTTCAAAGCTGTTATACGCTTACGAAGCTAGCAGAAGCTCAACTACGAAAGTGACTTTAAACCTTCTGACTCCACGAAAGCTAGGAAACAAACTGGGATTAGATACCCCACTATG。
作为优选，印度鯒的分子标记序列为：
GCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGCGGTTATACGAGAGGCCCAAGCTGATAGACTGCGGCGTAAAGAGTGGTTAAGATGAGACAAAAACTAAAGTCGAATGCCTTCAAAGCTGTTATACGCTTCCGAAGTTAGCAGAAGCTCAACCACGAAAGTGACTTTAAACCCACTGACTCCACGAAAGCTAGGGAACAAACTGGGATTAGATACCCCACTATG。
由褐斑鯒与印度鯒mtDNA 12S rRNA基因219bp序列排序结果可以看出褐斑鲬与印度鲬存在12个碱基的差异。
作为优选，PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul。
作为优选，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
本发明还提供了含有上述引物的试剂盒。试剂盒中还包括PCR反应试剂。
本发明还提供了上述引物或试剂盒在鉴别褐斑鯒与印度鯒中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明分子标记引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性；2）由褐斑鯒与印度鯒mtDNA 12S rRNA基因219bp序列排序结果可以看出褐斑鲬与印度鲬存在12个碱基的差异，本发明鉴别方法利用褐斑鲬与印度鲬存在12个碱基的差异进行鉴别，结果稳定，可重复性强，鉴别方法简单，不同个体的扩增结果一致，表现出高度的一致性，因此基于12S rRNA基因的碱基差异可以作为褐斑鯒与印度鯒的种质区分的分子标记。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物，引物序列为：
12SF：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
12SR：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
该分子标记引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。
一种利用上述的引物鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，具体步骤如下：
1）提取褐斑鯒与印度鯒的DNA：取肌肉样品置于1.5ml离心管中，加入650μl消化缓冲液和20μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于56℃烘箱内消化5h，每30min摇晃一次，待溶液冷却至室温后，于离心管中加入650μl平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，在10000rpm条件下离心10min，用1000μl移液枪吸出上层液体，然后加入600μl（相同体积）苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）按照步骤（b）再次提取两次，将上层液体转移到新的1.5ml离心管中，加入1ml -20℃预冷酒精，轻轻振动离心管，可以观察到DNA沉淀下来，在10000rpm条件下离心10min后，用300μl 75%酒精溶液漂洗两次，在10000rpm条件下离心10min后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，提取的DNA溶液置于4℃冰箱保存待用；
2）PCR扩增：以两种鱼的DNA为模板，利用上述分子标记引物分别进行PCR扩增；
3）对步骤2的PCR产物用8.0％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果，将PCR的电泳检测结果进行测序，比对测序结果。上述测序结果显示褐斑鯒与印度鯒种内遗传差异不大于1%。
上述褐斑鯒的分子标记序列为：GCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGCGGTTATACGAGAGGCCCAAGCTGATAGACTACGGCGTAAAGGGTGGTTAAGATGAAACACACACTAAAGTCGAACGCCTTCAAAGCTGTTATACGCTTACGAAGCTAGCAGAAGCTCAACTACGAAAGTGACTTTAAACCTTCTGACTCCACGAAAGCTAGGAAACAAACTGGGATTAGATACCCCACTATG。
上述印度鯒的分子标记序列为：
GCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGCGGTTATACGAGAGGCCCAAGCTGATAGACTGCGGCGTAAAGAGTGGTTAAGATGAGACAAAAACTAAAGTCGAATGCCTTCAAAGCTGTTATACGCTTCCGAAGTTAGCAGAAGCTCAACCACGAAAGTGACTTTAAACCCACTGACTCCACGAAAGCTAGGGAACAAACTGGGATTAGATACCCCACTATG。
由褐斑鯒与印度鯒mtDNA 12S rRNA基因219bp序列排序结果可以看出褐斑鲬与印度鲬存在12个碱基的差异。
上述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul。
上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
本实施例还提供了含有上述引物的试剂盒。试剂盒中还包括PCR反应试剂。
本实施例还提供了上述引物或试剂盒在鉴别褐斑鯒与印度鯒中的应用。
实施例2：
选用采自青岛、舟山和厦门群体的10尾褐斑鯒与5尾采自广州群体的印度鯒样品，提取15个样本的DNA，然后所提取的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；
其中，引物序列为：
12SF：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
12SR：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG -3’。
PCR扩增的反应体系组成为：0.2ml离心管中依次加入：
超纯水 17.5ul
10×buffer 2.5ul
dNTPs 2ul
rTaq 0.15ul
模板 1ul
Primer 各1ul；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，（94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec）×35 个循环，72℃延伸10min，4℃保存∞。
对PCR产物进行纯化后测序，并对15个样品的测序结果进行比对。
由褐斑鯒与印度鯒mtDNA 12S rRNA基因219bp序列排序结果可以看出褐斑鯒与印度鯒间存在12个碱基的差异。
褐斑鯒与印度鯒测序样品的mtDNA 12S rRNA基因219bp序列比对结果为：
PIG GCCGGTAAAA CTCGTGCCAG CCACCGCGGT TATACGAGAG GCCCAAGCTG
PS1 ********** ********** ********** ********** **********
PS2 ********** ********** ********** ********** **********
PS3 ********** ********** ********** ********** **********
Ruler.........10.........20.........30.........40.........50
PIG ATAGACTGCG GCGTAAAGAG TGGTTAAGAT GAGACAAAAA CTAAAGTCGA
PS1 *******A** ********G* ********** ***G**C*C* **********
PS2 *******A** ********G* ********** ***G**C*C* **********
PS3 *******A** ********G* ********** ***G**C*C* **********
Ruler .........60.........70.........80.........90.........100
PIG ATGCCTTCAA AGCTGTTATA CGCTTCCGAA GTTAGCAGAA GCTCAACCAC
PS1 *C******** ********** *****A**** *C******** *******T**
PS2 *C******** ********** *****A**** *C******** *******T**
PS3 *C******** ********** *****A**** *C******** *******T**
Ruler........110........120........130........140........150
PIG GAAAGTGACT TTAAACCCAC TGACTCCACG AAAGCTAGGG AACAAACTGG
PS1 ********** *******TT* ********** *********A **********
PS2 ********** *******TT* ********** *********A **********
PS3 ********** *******TT* ********** *********A **********
Ruler ........160........170........180........190........200
PIG GATTAGATAC CCCACTATG
PS1 ********** *********
PS2 ********** *********
PS3 ********** *********
Ruler ........210.......219
其中“*”表示相同的碱基序列位点，PIG表示：广州印度鯒样品；PS1表示：青岛褐斑鯒样品；PS2表示：舟山褐斑鯒样品；PS3表示：厦门褐斑鯒样品。
测序结果表明，采集自不同地理群体的10尾褐斑鯒样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(12SF)
<400> 1
gtcggtaaaa ctcgtgccag c 21
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(12SR)
<400> 2
catagtgggg tatctaatcc cagtttg 27
<210> 3
<211> 219
<212> DNA
<213> 褐斑鯒( Platycephalus sp.1)
<400> 3
gccggtaaaa ctcgtgccag ccaccgcggt tatacgagag gcccaagctg atagactacg 60
gcgtaaaggg tggttaagat gaaacacaca ctaaagtcga acgccttcaa agctgttata 120
cgcttacgaa gctagcagaa gctcaactac gaaagtgact ttaaaccttc tgactccacg 180
aaagctagga aacaaactgg gattagatac cccactatg 219
<210> 4
<211> 219
<212> DNA
<213> 印度鯒(Platycephalus indicus)
<400> 4
gccggtaaaa ctcgtgccag ccaccgcggt tatacgagag gcccaagctg atagactgcg 60
gcgtaaagag tggttaagat gagacaaaaa ctaaagtcga atgccttcaa agctgttata 120
cgcttccgaa gttagcagaa gctcaaccac gaaagtgact ttaaacccac tgactccacg 180
aaagctaggg aacaaactgg gattagatac cccactatg 219

Claims (9)

1.一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的分子标记引物，其特征在于：所述引物序列为：
12SF：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
12SR：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
2.一种利用权利要求1所述的引物鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，其特征在于：具体步骤如下：提取褐斑鯒与印度鯒的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。
3.根据权利要求2所述的一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，其特征在于：所述测序结果显示褐斑鯒与印度鯒种内遗传差异不大于1%。
4. 根据权利要求2所述的一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，其特征在于：所述褐斑鯒的分子标记序列为SEQ ID NO.3。
5. 根据权利要求2所述的一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，其特征在于：所述印度鯒的分子标记序列为SEQ ID NO.4。
6. 根据权利要求2所述的一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul。
7.根据权利要求2所述的一种鉴别褐斑鯒与印度鯒的方法，其特征在于：所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
8.含有权利要求1所述的引物的试剂盒。
9.权利要求1所述引物或权利要求8所述试剂盒在鉴别褐斑鯒与印度鯒中的应用。
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