CN107287323B - 新品种半滑舌鳎的分子选育方法 - Google Patents

新品种半滑舌鳎的分子选育方法 Download PDF

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CN107287323B CN201710574005.9A CN201710574005A CN107287323B CN 107287323 B CN107287323 B CN 107287323B CN 201710574005 A CN201710574005 A CN 201710574005A CN 107287323 B CN107287323 B CN 107287323B
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Abstract

本发明公开了新品种半滑舌鳎的分子选育方法，它解决了目前半滑舌鳎养殖和培育中，种内杂交方法随机性大，选育优良品种的概率低，群体选育方法存在易产生近亲交配，导致经济性状和生产性能下降的问题。选育步骤：一、挑选表型性状；二、检测分析雌雄亲本间的遗传组成；三、选择位于不同繁殖系谱的亲本，以亲本间的遗传距离0.7～1.0作为“阈值”范围进行配组；四、培育子代至性成熟；五、以子代半滑舌鳎为新一代亲本，重复操作步骤一至四，直到达到新品种半滑舌鳎性状的设计要求。本发明方法在选育新品种半滑舌鳎的过程中，始终检测各代亲本的繁殖谱系，以各代亲本间的遗传距离0.7～1.0作为“阈值”范围进行配组，从而既能避免近亲交配，又能按照所设定的方向选择半滑舌鳎新品种的性状，显著提高其经济性状和生产性能，增加优良新品种的出现概率。

Description

新品种半滑舌鳎的分子选育方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类新品种的选育方法，尤其涉及一种新品种半滑舌鳎的分子选育方法。
背景技术：
半滑舌鳎是我国海水养殖的主导鱼类之一，具有个体大、生长快、肉味鲜美等特点，经济价值很高。目前常用的育种方法以种内杂交和群体选育为主，由于在育种前不了解选育亲本的遗传信息，同时种内杂交随机性大，选育优良品种的概率低，群体选育容易使亲本近亲交配，会出现种质退化现象，以致出现了孵化率、出苗率降低、生长速度减慢、抗逆性差等性状退化现象，使半滑舌鳎经济性状和生产性能下降。
发明内容：
本发明的目的是为解决目前半滑舌鳎养殖和培育过程中，种内杂交方法随机性大，选育优良品种的概率低，群体选育方法存在易产生近亲交配，出现种质退化，导致经济性状和生产性能下降的问题，针对上述问题提供的一种新品种半滑舌鳎的选育方法。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：新品种半滑舌鳎的分子选育方法，其特征在于新品种半滑舌鳎按以下步骤选育：
一、根据新品种的设计需求，挑选表型性状符合要求的半滑舌鳎作为亲本，表型性状挑选公式为
Figure 872753DEST_PATH_IMAGE001
，公式中Xn为亲本的表型性状测定值，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
为半滑舌鳎群体表型性状的平均值，S为半滑舌鳎群体表型性状的标准差；
二、检测分析亲本间的遗传组成，a.提取亲本基因组DNA；b.用20对微卫星标记引物对亲本基因组DNA分别进行PCR扩增；c.将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，获得产物条带图片；d.利用凝胶图像分析软件，将PCR扩增产物电泳条带图片转化成数字信息数据；e.将数字信息数据导入遗传分析软件，计算获得亲本间的遗传组成；
三、根据遗传组成，选择亲本间的遗传距离0.7～1.0作为“阈值”范围进行配组，亲本分成2个或2个以上繁殖群体；
四、繁殖群体内亲本自由组合交配，生产、培育子代半滑舌鳎至性成熟；
五、以子代半滑舌鳎为新一代亲本，重复操作步骤一至四，直到达到新品种半滑舌鳎性状的设计要求，即得到新品种半滑舌鳎。
为了进一步实现本发明的目的，所述的第二步骤的步骤a中提取亲本基因组DNA采用常规酚-氯仿抽提的方法或者使用基因组DNA纯化试剂盒。
为了进一步实现本发明的目的，所述的第二步骤的步骤b中每对微卫星标记引物的PCR扩增反应总体积为15L，包括10.8L反应缓冲液、100ng亲本个体基因组DNA、0.6μL微卫星标记上下游引物、0.5U TaqDNA聚合酶和余量的灭菌超纯水；其中反应缓冲液含有终浓度10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.3）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 µmol/L dNTP和余量的超纯水。
为了进一步实现本发明的目的，所述的第二步骤的步骤b中PCR扩增反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环25次；最后72℃延伸5分钟。
为了进一步实现本发明的目的，所述的第二步骤的步骤c中PCR扩增产物凝胶电泳检测过程为：PCR扩增产物先使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2-3小时，之后将凝胶染色10分钟，然后显色5-10分钟，将凝胶扫描或照相获得产物条带图片。
为了进一步实现本发明的目的，所述的染色用染色液为0.1%硝酸银溶液，所述的显色用显色液每升含有20g的NaOH、0.4g的Na2CO3和4mL的甲醛溶液。
为了进一步实现本发明的目的，所述的第二步骤的步骤b中选用的20对微卫星标记引物的序列为：
微卫星标记引物（1） 上游引物：gggagtcaacaaccaaacca
下游引物：cactcgcaaagactgaggtg
微卫星标记引物（2） 上游引物：actgcgtccaaactgaggag
下游引物：cattccccactcactgtcct
微卫星标记引物（3） 上游引物：tcctgtgggaggagaggaga
下游引物：acacacctgcacacaccagt
微卫星标记引物（4） 上游引物：ccatccgagaccttcagtgt
下游引物：acctgctcctcctctgtgag
微卫星标记引物（5） 上游引物：acaaagctgcgttcctatcg
下游引物：ggatcctgcctttggtttct
微卫星标记引物（6） 上游引物：atcgaggaggatctgtgtgg
下游引物：gcgtgagatgcaagaaaaca
微卫星标记引物（7） 上游引物：tgcagcgcacattacctaac
下游引物：ggcacgctgaagctttaca
微卫星标记引物（8） 上游引物：cgttgccatcacacaatttc
下游引物：caacgtgcatcgtgtctctt
微卫星标记引物（9） 上游引物：tgtgaagtcatgtggttctg
下游引物：tgagttggttgtatgtcctg
微卫星标记引物（10）上游引物：ggctgcctacaaacctcaac
下游引物：gaggactcagatgcacacga
微卫星标记引物（11）上游引物：gtttccttcctttcattcct
下游引物：gaaatggacgtctgtgattt
微卫星标记引物（12）上游引物：cacaaaattgctgcttgcat
下游引物：aacactccaaccccaggtaa
微卫星标记引物（13）上游引物：ctgccgtgatcttcacaaaa
下游引物：tccactgggacaagaaaaca
微卫星标记引物（14）上游引物：ctgtgaccctcctcctgct
下游引物：ctccatgctgccagtgttt
微卫星标记引物（15）上游引物：aaagaggcgtgtcatcggtt
下游引物：cccaatcgctcaagaaatcc
微卫星标记引物（16）上游引物：taccacgctgccttcaaatg
下游引物：ttcaccactgttctgctccac
微卫星标记引物（17）上游引物：gacgaaggtttttgaatggtta
下游引物：gtgaggcacaggcttttgga
微卫星标记引物（18）上游引物：tccgacccacagttgtatca
下游引物：taaacagatctgctgcagtgagt
微卫星标记引物（19）上游引物：tcatcagcccagttcaaagt
下游引物：ctacctctgcttcagctgtg
微卫星标记引物（20）上游引物：tctttaccgagaatctccctcc
下游引物：aaagggcctaccgaaagaat 。
为了进一步实现本发明的目的，所述的第二步骤的步骤d中使用的凝胶图像分析软件为Gel-Pro Analyzer（Version 4.0）。
为了进一步实现本发明的目的，所述的第二步骤的步骤e中使用的遗传分析软件为“基于遗传背景的分子育种软件1.0”。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：本发明解决了目前半滑舌鳎养殖和培育过程中，种内杂交方法随机性大，选育优良品种的概率低，群体选育方法存在易产生近亲交配，出现种质退化，导致经济性状和生产性能下降的问题，本发明方法在选育新品种半滑舌鳎的过程中，始终检测各代亲本的繁殖谱系，以各代亲本遗传距离0.7～1.0作为“阈值”范围进行配组，从而既能避免近亲交配，又能按照所设定的方向选择半滑舌鳎新品种的性状，显著提高其经济性状和生产性能，增加优良新品种的出现概率。
具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式做详细说明：
具体实施方式一：本实施方式新品种半滑舌鳎按以下步骤选育：一、根据新品种的设计需求，挑选表型性状符合要求的半滑舌鳎作为亲本；二、检测分析亲本间的遗传组成；三、根据遗传组成，选择亲本间遗传距离0.7～1.0作为“阈值”范围进行配组，亲本分成2个或2个以上繁殖群体；四、繁殖群体内亲本自由组合交配，生产、培育子代半滑舌鳎至性成熟；五、以子代半滑舌鳎为新一代亲本，重复操作步骤一至四，直到达到新品种半滑舌鳎性状的设计要求，即得到新品种半滑舌鳎。
本实施方式可根据具体需要进行设计，如选择培育生长速度快、体重、体厚、不可量化的表型性状进行挑选。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中表型性状挑选公式为
Figure 727577DEST_PATH_IMAGE003
，公式中Xn为亲本的表型性状测定值，
Figure DEST_PATH_IMAGE004
为半滑舌鳎群体表型性状的平均值，S为半滑舌鳎群体表型性状的标准差，2倍S表示选择强度中等，本实施方式保留小于表型性状平均值+2倍标准差和大于表型性状平均值-2倍标准差的半滑舌鳎个体。其他步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中检测分析亲本间的遗传组成：a.提取亲本基因组DNA；b.用20对微卫星标记引物对亲本基因组DNA分别进行PCR扩增；c.将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，获得产物条带图片；d.利用凝胶图像分析软件，将PCR扩增产物电泳条带图片转化成数字信息数据；e.将数字信息数据导入遗传分析软件，计算获得亲本间遗传信息。其他步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式中要对被检测分析遗传组成的亲本个体进行标记，可采用外部标记如挂牌标记、内部标记如PIT射频标记或分池饲养等方法。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤a中提取亲本基因组DNA可以采用常规酚-氯仿抽提的方法或者使用基因组DNA纯化试剂盒。其他步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤b中每对微卫星标记引物的PCR扩增反应总体积为15L，包括10.8L反应缓冲液、100ng亲本个体基因组DNA、0.6μL微卫星标记上下游引物、0.5U TaqDNA聚合酶和余量的灭菌超纯水；其中反应缓冲液由终浓度10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.3）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 µmol/LdNTP和余量的超纯水组成。其他步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤b中PCR扩增反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环25次；最后72℃延伸5分钟。其他步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤c中PCR扩增产物凝胶电泳检测过程包括，产物先使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2-3小时，之后将凝胶染色10分钟，然后显色5-10分钟，将凝胶扫描或照相获得产物条带图片。其他步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七的不同点是：步骤c中染色用染色液为0.1%硝酸银溶液，所述的显色用显色液每升含有20g的NaOH、0.4g的Na2CO3和4mL的甲醛溶液。其他步骤及参数与实施方式七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤b中选用的20对微卫星标记引物的序列如下，其他步骤及参数与实施方式三相同：
微卫星标记引物（1） 上游引物：gggagtcaacaaccaaacca
下游引物：cactcgcaaagactgaggtg
微卫星标记引物（2） 上游引物：actgcgtccaaactgaggag
下游引物：cattccccactcactgtcct
微卫星标记引物（3） 上游引物：tcctgtgggaggagaggaga
下游引物：acacacctgcacacaccagt
微卫星标记引物（4） 上游引物：ccatccgagaccttcagtgt
下游引物：acctgctcctcctctgtgag
微卫星标记引物（5） 上游引物：acaaagctgcgttcctatcg
下游引物：ggatcctgcctttggtttct
微卫星标记引物（6） 上游引物：atcgaggaggatctgtgtgg
下游引物：gcgtgagatgcaagaaaaca
微卫星标记引物（7） 上游引物：tgcagcgcacattacctaac
下游引物：ggcacgctgaagctttaca
微卫星标记引物（8） 上游引物：cgttgccatcacacaatttc
下游引物：caacgtgcatcgtgtctctt
微卫星标记引物（9） 上游引物：tgtgaagtcatgtggttctg
下游引物：tgagttggttgtatgtcctg
微卫星标记引物（10）上游引物：ggctgcctacaaacctcaac
下游引物：gaggactcagatgcacacga
微卫星标记引物（11）上游引物：gtttccttcctttcattcct
下游引物：gaaatggacgtctgtgattt
微卫星标记引物（12）上游引物：cacaaaattgctgcttgcat
下游引物：aacactccaaccccaggtaa
微卫星标记引物（13）上游引物：ctgccgtgatcttcacaaaa
下游引物：tccactgggacaagaaaaca
微卫星标记引物（14）上游引物：ctgtgaccctcctcctgct
下游引物：ctccatgctgccagtgttt
微卫星标记引物（15）上游引物：aaagaggcgtgtcatcggtt
下游引物：cccaatcgctcaagaaatcc
微卫星标记引物（16）上游引物：taccacgctgccttcaaatg
下游引物：ttcaccactgttctgctccac
微卫星标记引物（17）上游引物：gacgaaggtttttgaatggtta
下游引物：gtgaggcacaggcttttgga
微卫星标记引物（18）上游引物：tccgacccacagttgtatca
下游引物：taaacagatctgctgcagtgagt
微卫星标记引物（19）上游引物：tcatcagcccagttcaaagt
下游引物：ctacctctgcttcagctgtg
微卫星标记引物（20）上游引物：tctttaccgagaatctccctcc
下游引物：aaagggcctaccgaaagaat
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤d中使用的凝胶图像分析软件为Gel-Pro Analyzer（Version 4.0）。其他步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤e中使用的遗传分析软件为“基于遗传背景的分子育种软件1.0”。其他步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式十二：本实施方式半滑舌鳎新品种按以下步骤选育：
步骤一，根据生长速度快、体重大的新品种设计要求，对海阳市黄海水产有限公司的3000尾半滑舌鳎亲鱼进行表型性状挑选，挑选公式为
Figure 943532DEST_PATH_IMAGE005
， 公式中Xn为亲本的表型性状测定值，
Figure 276425DEST_PATH_IMAGE004
为半滑舌鳎群体表型性状的平均值，S为半滑舌鳎群体表型性状的标准差，2倍S表示选择强度中等，本实施方式保留小于表型性状平均值+2倍标准差和大于表型性状平均值-2倍标准差的半滑舌鳎个体作为亲本。
步骤二，检测分析亲本间的遗传组成：
a. 提取亲本基因组DNA
对被检测分析遗传信息的亲本个体进行标记，并对应个体编号剪取0.5cm×0.5cm大小的尾鳍（约0.05g），置于4℃保温盒内备用，用于提取基因组DNA；使用基因组DNA纯化试剂盒（TaKaRa，Code No.9765）提取亲本基因组DNA。
b. 用20对微卫星标记引物对亲本基因组DNA分别进行PCR扩增
每对微卫星标记引物的PCR扩增反应总体积为15L，包括10.8L反应缓冲液、100ng亲本个体基因组DNA、0.6μL微卫星标记上下游引物、0.5U TaqDNA聚合酶和余量的灭菌超纯水；其中反应缓冲液由终浓度10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.3）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/LMgCl2、200 µmol/L dNTP和余量的超纯水组成。PCR扩增反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环25次；最后72℃延伸5分钟。选用的20对微卫星标记引物的序列如下：
微卫星标记引物（1） 上游引物：gggagtcaacaaccaaacca
下游引物：cactcgcaaagactgaggtg
微卫星标记引物（2） 上游引物：actgcgtccaaactgaggag
下游引物：cattccccactcactgtcct
微卫星标记引物（3） 上游引物：tcctgtgggaggagaggaga
下游引物：acacacctgcacacaccagt
微卫星标记引物（4） 上游引物：ccatccgagaccttcagtgt
下游引物：acctgctcctcctctgtgag
微卫星标记引物（5） 上游引物：acaaagctgcgttcctatcg
下游引物：ggatcctgcctttggtttct
微卫星标记引物（6） 上游引物：atcgaggaggatctgtgtgg
下游引物：gcgtgagatgcaagaaaaca
微卫星标记引物（7） 上游引物：tgcagcgcacattacctaac
下游引物：ggcacgctgaagctttaca
微卫星标记引物（8） 上游引物：cgttgccatcacacaatttc
下游引物：caacgtgcatcgtgtctctt
微卫星标记引物（9） 上游引物：tgtgaagtcatgtggttctg
下游引物：tgagttggttgtatgtcctg
微卫星标记引物（10）上游引物：ggctgcctacaaacctcaac
下游引物：gaggactcagatgcacacga
微卫星标记引物（11）上游引物：gtttccttcctttcattcct
下游引物：gaaatggacgtctgtgattt
微卫星标记引物（12）上游引物：cacaaaattgctgcttgcat
下游引物：aacactccaaccccaggtaa
微卫星标记引物（13）上游引物：ctgccgtgatcttcacaaaa
下游引物：tccactgggacaagaaaaca
微卫星标记引物（14）上游引物：ctgtgaccctcctcctgct
下游引物：ctccatgctgccagtgttt
微卫星标记引物（15）上游引物：aaagaggcgtgtcatcggtt
下游引物：cccaatcgctcaagaaatcc
微卫星标记引物（16）上游引物：taccacgctgccttcaaatg
下游引物：ttcaccactgttctgctccac
微卫星标记引物（17）上游引物：gacgaaggtttttgaatggtta
下游引物：gtgaggcacaggcttttgga
微卫星标记引物（18）上游引物：tccgacccacagttgtatca
下游引物：taaacagatctgctgcagtgagt
微卫星标记引物（19）上游引物：tcatcagcccagttcaaagt
下游引物：ctacctctgcttcagctgtg
微卫星标记引物（20）上游引物：tctttaccgagaatctccctcc
下游引物：aaagggcctaccgaaagaat
c. 将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，获得产物条带图片
PCR扩增产物先使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2-3小时，之后将凝胶染色（染色液为0.1%硝酸银溶液）10分钟，然后显色（显色液每升含有20g的NaOH、0.4g的Na2CO3和4mL的甲醛溶液）5-10分钟，将凝胶扫描或照相获得产物条带图片。
d. 利用凝胶图像分析软件，将PCR扩增产物电泳条带图片转化成数字信息数据
使用凝胶图像分析软件Gel-Pro Analyzer（Version 4.0）将PCR扩增产物电泳条带图片转化成表格形式的数字信息数据。
e.将数字信息数据导入遗传分析软件，计算获得亲本间遗传组成
使用遗传分析软件“基于遗传背景的分子育种软件1.0”进行遗传参数的分析和计算，获得亲本间的遗传组成。雌性群体的有效等位基因数(Ne)为1.792~5.686，平均为3.578；雄性群体Ne为1.471~6.116，平均为3.508。雌性群体的观测杂合度(Ho)为0.418~0.835，平均为0.606；雄性群体为0.28~0.798，平均为0.548。雌性群体的期望杂合度(He)为0.444~0.822，平均为0.696；雄性群体为0.321~0.839，平均为0.655。雌、雄亲本个体间的遗传距离，在0.254~1.959之间，平均值为0.890。
步骤三，根据亲本间的遗传组成，选择亲本间的遗传距离0.7～1.0作为“阈值”范围进行配组，将雌雄亲本分成2个或2个以上繁殖群体，即繁殖群体内任意一对雌雄亲本的个体间的遗传距离都在0.7～1.0之间。。
步骤四，繁殖群体内亲本自由组合交配，生产、培育子代半滑舌鳎至性成熟。
步骤五，以子代半滑舌鳎为新一代亲本，重复操作步骤一至四，直到子代半滑舌鳎群体成为生长速度快、体重大的新品种半滑舌鳎。
本实施方式得到1个新品种半滑舌鳎。
将海阳市黄海水产有限公司的另外300尾半滑舌鳎作为对照组，与本实施方式获得的1个新品种半滑舌鳎进行对比，在养殖条件相同的情况下，本实施方式获得的1个新品种半滑舌鳎的生长速度比对照组平均快26.23%，本实施方式获得的1个新品种半滑舌鳎的体重比对照组平均重27.43%。
序列表
<110>海阳市黄海水产有限公司
中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
<120>新品种半滑舌鳎的分子选育方法
<160>40
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（1）的上游引物
<400>1
gggagtcaacaaccaaacca 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（1）的下游引物
<400>2
CACTCGCAAAGACTGAGGTG 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（2）的上游引物
<400>3
ACTGCGTCCAAACTGAGGAG 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（2）的下游引物
<400>4
CATTCCCCACTCACTGTCCT 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（3）的上游引物
<400>5
TCCTGTGGGAGGAGAGGAGA 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（3）的下游引物
<400>6
ACACACCTGCACACACCAGT 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（4）的上游引物
<400>7
CCATCCGAGACCTTCAGTGT 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（4）的下游引物
<400>8
ACCTGCTCCTCCTCTGTGAG 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（5）的上游引物
<400>9
ACAAAGCTGCGTTCCTATCG 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（5）的下游引物
<400>10
GGATCCTGCCTTTGGTTTCT 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（6）的上游引物
<400>11
ATCGAGGAGGATCTGTGTGG 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（6）的下游引物
<400>12
GCGTGAGATGCAAGAAAACA 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（7）的上游引物
<400>13
TGCAGCGCACATTACCTAAC 20
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（7）的下游引物
<400>14
GGCACGCTGAAGCTTTACA 19
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（8）的上游引物
<400>15
CGTTGCCATCACACAATTTC 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（8）的下游引物
<400>16
CAACGTGCATCGTGTCTCTT 20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（9）的上游引物
<400>17
TGTGAAGTCATGTGGTTCTG 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（9）的下游引物
<400>18
TGAGTTGGTTGTATGTCCTG 20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（10）的上游引物
<400>19
GGCTGCCTACAAACCTCAAC 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（10）的下游引物
<400>20
GAGGACTCAGATGCACACGA 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（11）的上游引物
<400>21
GTTTCCTTCCTTTCATTCCT 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（11）的下游引物
<400>22
GAAATGGACGTCTGTGATTT 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（12）的上游引物
<400>23
CACAAAATTGCTGCTTGCAT 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（12）的下游引物
<400>24
AACACTCCAACCCCAGGTAA 20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（13）的上游引物
<400>25
CTGCCGTGATCTTCACAAAA 20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（13）的下游引物
<400>26
TCCACTGGGACAAGAAAACA 20
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（14）的上游引物
<400>27
CTGTGACCCTCCTCCTGCT 19
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（14）的下游引物
<400>28
CTCCATGCTGCCAGTGTTT 19
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（15）的上游引物
<400>29
AAAGAGGCGTGTCATCGGTT 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（15）的下游引物
<400>30
CCCAATCGCTCAAGAAATCC 20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（16）的上游引物
<400>31
TACCACGCTGCCTTCAAATG 20
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（16）的下游引物
<400>32
TTCACCACTGTTCTGCTCCAC 21
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（17）的上游引物
<400>33
GACGAAGGTTTTTGAATGGTTA 22
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（17）的下游引物
<400>34
GTGAGGCACAGGCTTTTGGA 20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（18）的上游引物
<400>35
TCCGACCCACAGTTGTATCA 20
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（18）的下游引物
<400>36
TAAACAGATCTGCTGCAGTGAGT 23
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（19）的上游引物
<400>37
TCATCAGCCCAGTTCAAAGT 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（19）的下游引物
<400>38
CTACCTCTGCTTCAGCTGTG 20
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（20）的上游引物
<400>39
TCTTTACCGAGAATCTCCCTCC 22
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（20）的下游引物
<400>40
AAAGGGCCTACCGAAAGAAT 20
序列表
<110>海阳市黄海水产有限公司
中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
<120>新品种半滑舌鳎的分子选育方法
<160>40
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（1）的上游引物
<400>1
GGGAGTCAACAACCAAACCA 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（1）的下游引物
<400>2
CACTCGCAAAGACTGAGGTG 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（2）的上游引物
<400>3
ACTGCGTCCAAACTGAGGAG 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（2）的下游引物
<400>4
CATTCCCCACTCACTGTCCT 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（3）的上游引物
<400>5
TCCTGTGGGAGGAGAGGAGA 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（3）的下游引物
<400>6
ACACACCTGCACACACCAGT 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（4）的上游引物
<400>7
CCATCCGAGACCTTCAGTGT 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（4）的下游引物
<400>8
ACCTGCTCCTCCTCTGTGAG 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（5）的上游引物
<400>9
ACAAAGCTGCGTTCCTATCG 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（5）的下游引物
<400>10
GGATCCTGCCTTTGGTTTCT 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（6）的上游引物
<400>11
ATCGAGGAGGATCTGTGTGG 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（6）的下游引物
<400>12
GCGTGAGATGCAAGAAAACA 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（7）的上游引物
<400>13
TGCAGCGCACATTACCTAAC 20
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（7）的下游引物
<400>14
GGCACGCTGAAGCTTTACA 19
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（8）的上游引物
<400>15
CGTTGCCATCACACAATTTC 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（8）的下游引物
<400>16
CAACGTGCATCGTGTCTCTT 20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（9）的上游引物
<400>17
TGTGAAGTCATGTGGTTCTG 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（9）的下游引物
<400>18
TGAGTTGGTTGTATGTCCTG 20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（10）的上游引物
<400>19
GGCTGCCTACAAACCTCAAC 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（10）的下游引物
<400>20
GAGGACTCAGATGCACACGA 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（11）的上游引物
<400>21
GTTTCCTTCCTTTCATTCCT 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（11）的下游引物
<400>22
GAAATGGACGTCTGTGATTT 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（12）的上游引物
<400>23
CACAAAATTGCTGCTTGCAT 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（12）的下游引物
<400>24
AACACTCCAACCCCAGGTAA 20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（13）的上游引物
<400>25
CTGCCGTGATCTTCACAAAA 20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（13）的下游引物
<400>26
TCCACTGGGACAAGAAAACA 20
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（14）的上游引物
<400>27
CTGTGACCCTCCTCCTGCT 19
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（14）的下游引物
<400>28
CTCCATGCTGCCAGTGTTT 19
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（15）的上游引物
<400>29
AAAGAGGCGTGTCATCGGTT 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（15）的下游引物
<400>30
CCCAATCGCTCAAGAAATCC 20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（16）的上游引物
<400>31
TACCACGCTGCCTTCAAATG 20
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（16）的下游引物
<400>32
TTCACCACTGTTCTGCTCCAC 21
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（17）的上游引物
<400>33
GACGAAGGTTTTTGAATGGTTA 22
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（17）的下游引物
<400>34
GTGAGGCACAGGCTTTTGGA 20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（18）的上游引物
<400>35
TCCGACCCACAGTTGTATCA 20
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（18）的下游引物
<400>36
TAAACAGATCTGCTGCAGTGAGT 23
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（19）的上游引物
<400>37
TCATCAGCCCAGTTCAAAGT 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（19）的下游引物
<400>38
CTACCTCTGCTTCAGCTGTG 20
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（20）的上游引物
<400>39
TCTTTACCGAGAATCTCCCTCC 22
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星标记引物（20）的下游引物
<400>40
AAAGGGCCTACCGAAAGAAT 20

Claims (3)

1.新品种半滑舌鳎的分子选育方法，其特征在于新品种半滑舌鳎按以下步骤选育：
一、根据新品种的设计需求，挑选表型性状符合要求的半滑舌鳎作为亲本，表型性状挑 选公式为
Figure 79632DEST_PATH_IMAGE001
，公式中Xn为亲本的表型性状测定值，
Figure 59089DEST_PATH_IMAGE002
为半滑舌鳎群体表型 性状的平均值，S为半滑舌鳎群体表型性状的标准差；
二、检测分析亲本间的遗传组成，a.提取亲本基因组DNA，采用常规酚-氯仿抽提的方法或者使用基因组DNA纯化试剂盒；b.用20对微卫星标记引物对亲本基因组DNA分别进行PCR扩增，每对微卫星标记引物的PCR扩增反应总体积为15L，包括10.8L反应缓冲液、100ng亲本个体基因组DNA、0.6μL微卫星标记上下游引物、0.5U TaqDNA聚合酶和余量的灭菌超纯水；其中反应缓冲液含有终浓度10 mmol/L Tris-Cl、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200µmol/L dNTP和余量的超纯水；c.将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，获得产物条带图片，PCR扩增产物凝胶电泳检测过程为：PCR扩增产物先使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2-3小时，之后将凝胶染色10分钟，然后显色5-10分钟，将凝胶扫描或照相获得产物条带图片；所述的染色用染色液为0.1%硝酸银溶液，所述的显色用显色液每升含有20g的NaOH、0.4g的Na2CO3和4mL的甲醛溶液；d.利用凝胶图像分析软件，将PCR扩增产物电泳条带图片转化成数字信息数据；e.将数字信息数据导入遗传分析软件，计算获得亲本间的遗传组成；
步骤b中选用的20对微卫星标记引物的序列为：
微卫星标记引物（1） 上游引物：gggagtcaacaaccaaacca
下游引物：cactcgcaaagactgaggtg
微卫星标记引物（2） 上游引物：actgcgtccaaactgaggag
下游引物：cattccccactcactgtcct
微卫星标记引物（3） 上游引物：tcctgtgggaggagaggaga
下游引物：acacacctgcacacaccagt
微卫星标记引物（4） 上游引物：ccatccgagaccttcagtgt
下游引物：acctgctcctcctctgtgag
微卫星标记引物（5） 上游引物：acaaagctgcgttcctatcg
下游引物：ggatcctgcctttggtttct
微卫星标记引物（6） 上游引物：atcgaggaggatctgtgtgg
下游引物：gcgtgagatgcaagaaaaca
微卫星标记引物（7） 上游引物：tgcagcgcacattacctaac
下游引物：ggcacgctgaagctttaca
微卫星标记引物（8） 上游引物：cgttgccatcacacaatttc
下游引物：caacgtgcatcgtgtctctt
微卫星标记引物（9） 上游引物：tgtgaagtcatgtggttctg
下游引物：tgagttggttgtatgtcctg
微卫星标记引物（10）上游引物：ggctgcctacaaacctcaac
下游引物：gaggactcagatgcacacga
微卫星标记引物（11）上游引物：gtttccttcctttcattcct
下游引物：gaaatggacgtctgtgattt
微卫星标记引物（12）上游引物：cacaaaattgctgcttgcat
下游引物：aacactccaaccccaggtaa
微卫星标记引物（13）上游引物：ctgccgtgatcttcacaaaa
下游引物：tccactgggacaagaaaaca
微卫星标记引物（14）上游引物：ctgtgaccctcctcctgct
下游引物：ctccatgctgccagtgttt
微卫星标记引物（15）上游引物：aaagaggcgtgtcatcggtt
下游引物：cccaatcgctcaagaaatcc
微卫星标记引物（16）上游引物：taccacgctgccttcaaatg
下游引物：ttcaccactgttctgctccac
微卫星标记引物（17）上游引物：gacgaaggtttttgaatggtta
下游引物：gtgaggcacaggcttttgga
微卫星标记引物（18）上游引物：tccgacccacagttgtatca
下游引物：taaacagatctgctgcagtgagt
微卫星标记引物（19）上游引物：tcatcagcccagttcaaagt
下游引物：ctacctctgcttcagctgtg
微卫星标记引物（20）上游引物：tctttaccgagaatctccctcc
下游引物：aaagggcctaccgaaagaat
三、根据遗传组成，选择亲本间的遗传距离0.7～1.0作为“阈值”范围进行配组，亲本分成2个或2个以上繁殖群体；
四、繁殖群体内亲本自由组合交配，生产、培育子代半滑舌鳎至性成熟；
五、以子代半滑舌鳎为新一代亲本，重复操作步骤一至四，直到达到新品种半滑舌鳎性状的设计要求，即得到新品种半滑舌鳎。
2.根据权利要求1所述的新品种半滑舌鳎的分子选育方法，其特征在于所述的第二步骤的步骤d中使用的凝胶图像分析软件为Gel-Pro Analyzer，版本号为Version 4.0。
3.根据权利要求1所述的新品种半滑舌鳎的分子选育方法，其特征在于所述的第二步骤的步骤e中使用的遗传分析软件为“基于遗传背景的分子育种软件1.0”。
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