CN103416333A - 一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，具体步骤为：选用多个具有不同优良性状的凡纳滨对虾群体；利用分子标记分析引进个体间的亲缘关系；基于亲缘关系信息和优良性状信息设计配种方案，建立大量家系，构成具有较丰富遗传变异和优良性状的凡纳滨对虾基础群体。本发明在对虾基础群体构建过程中，利用分子标记检测不同个体间的亲缘关系并设计配种方案，可以避免近亲交配、打破基因连锁、得到充分重组、定向交配，保证育种工作的连续性和科学性，这样有利于获得具有较丰富遗传变异和较多优良基因的凡纳滨对虾基础群体，进而可以对其后代进行较大程度的遗传改良和生产性能提高，并带来较好的经济效益。

Description

一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法

技术领域

本发明属于遗传育种技术领域，具体地说涉及一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法。

背景技术

在育种中要实施选育进行改良，必须具备完善的基础群体，这也是育种的重要基础。而作为基础群体必须具有丰富的遗传变异和具有需要改良性状的优良基因。实践证明建立遗传基础丰富的群体是提高选育效果的关键因素，但是并不是群体越大越好，因为组群材料越多不良基因混入群体的机会越大，势必影响基础群体的种质。为了保证基础群体的遗传多样性，减少不良基因的渗入，节省财力和人力，有必要综合考虑各项因素。

凡纳滨对虾，是世界上养殖产量最高的虾类之一。自20世纪90年代引进我国以来，因为其具有生长快、适应范围广、抗病抗逆性强、对食物要求不高、容易养殖等特点得到了快速的发展。但是目前我国优良的凡纳滨对虾种质主要靠从美国和厄瓜多尔等地的先进育种公司引入，而进口的原种只能满足养殖苗种需求的20%，剩余的是来源于其多代自繁苗种。这种苗种提供的方式已经使我国养殖的凡纳滨对虾出现了发病率与死亡率上升、生长速度下降、规格参差不齐、形态畸形等种质衰退的现象，严重影响了对虾养殖业的经济效益，已经制约了其养殖产业的可持续发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，本发明获得了具有较高遗传多样性以及较多优良基因的凡纳滨基础群体，解决了在选择育种过程中，由于引进群体的遗传背景不清楚导致基础群体近交水平高、遗传变异不够丰富而造成凡纳滨对虾选育进展有限的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，所述方法包括以下步骤：

（1）、选用多个具有不同优良性状的凡纳滨对虾群体，并对群体内所有个体进行编号；

（2）、利用分子标记对所述凡纳滨对虾个体进行遗传分析，检测个体间的亲缘关系，具体包括下述子步骤：

a、从凡纳滨对虾的大量微卫星位点中筛选出具备重复性好、稳定性好、符合哈代温伯格平衡定律、无连锁关系、不存在无效等位基因、多态信息含量值大于0.60的高多态性微卫星位点，以便于精确地计算个体间的亲缘关系；

b、分别提取所有个体的基因组DNA，每个个体的基因组DNA均使用筛选出的高多态性微卫星位点的正反向引物，分别进行PCR扩增；

所述PCR扩增体系为：100ng每个个体的基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μL；Mg²⁺，1.5mmol/L；5U/μL的rTaq，0.2μL；10mmol/L的dNTP，0.5μL；10μmol/L的所述正反向引物各0.5μL；加双蒸水补体系到25μL；

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃预变性30s，退火30s，延伸40s，循环32次，72℃延伸10min，4℃保存；

c、通过对PCR产物检测获得每个个体在每对正反向引物的遗传变异图谱信息；

d、利用图谱分析软件对所有的遗传变异图谱信息进行数字化处理；

e、将数字化数据信息导入亲缘分析软件计算，获得亲缘关系信息；

（3）、根据个体间的亲缘关系以及个体的优良性状制定配种方案，建立大量家系，构建出基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体。

进一步的，所述步骤（1）中优良性状为生长快、抗病性强、出肉率高、抗逆性强或存活率高中的一种或几种。

进一步的，所述步骤（3）中亲缘关系的度量指标采取亲缘系数，所述亲缘系数保持在0.050及以下。

进一步的，所述步骤c中将PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶-EB染色系统进行检测，在凝胶成像系统下观察，在不同个体间获得的多态性等位基因，就是本位点的遗传变异图谱信息。

进一步的，所述步骤d中使用的图谱分析软件为Quantity One4.5软件。

进一步的，所述步骤e中使用的亲缘分析软件为POPGEN软件和PHYLIP软件。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在引进凡纳滨对虾种虾前做好充分的考察工作，慎重选取一定数量的具有优良目标性状的群体和个体，并在构建基础群体前对引进的种质资源的遗传背景进行了解并制定合理的配种方案，构建了具有丰富遗传变异和较多目标性状优良基因的凡纳滨对虾基础群体，可以有效恢复和优化凡纳滨对虾的种质，有效解决人工养殖过程中出现的上述问题。克服了由于凡纳滨对虾产卵量大，可能会造成群体遗传多样性降低、一些优良性状丢失、品质下降的问题。

本发明方法在对虾基础群体构建过程中，利用分子标记检测不同引进群体个体间的亲缘关系并设计配种方案，可以避免近亲交配、打破基因连锁、得到充分重组，定向组配、保证育种工作的连续性和科学性，这样有利于获得具有较丰富遗传变异和较多优良基因的凡纳滨对虾基础群体，进而可以对其后代进行较大程度的遗传改良和生产性能提高，满足了育种的需求，并带来较好的经济效益。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细的阐述，但本发明不限于此。

实施例1

本发明所述基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法包括以下步骤：

1、根据凡纳滨对虾良种选育目标，主要针对生长快、抗病性强、抗逆性强、存活率高和适应高密度饲养等性状从国外不同的育种公司分批次引入7个凡纳滨对虾良种群体，对所有引进群体及群体内个体进行编号，其中群体的编号及名称见表1。

具体步骤为：综合考察国外不同的凡纳滨对虾育种公司所拥有的优良种质资源；根据育种目标的需求，引入国外具有不同优良性状的种质资源群体，并对各个群体的性能特征进行记录备案；对引进的各个优良群体及群体内个体进行编号，以便于亲缘关系的分析、配种方案的制定、基础群体的建立。

表1本实施例中涉及到的7个凡纳滨对虾引进良种群体

2、利用分子标记对来源于引进良种群体的个体进行遗传分析，检测个体间的亲缘关系，包括以下子步骤：

a、提取亲虾个体的基因组DNA：在引进亲虾的眼柄套上带有不同编号的橡胶圈，同时一对一地剪取游泳足放到有相同编号的离心管（可放入冰箱待用或直接用于提取DNA）；向离心管中加入0.5mL裂解液（每升裂解液中含有浓度为0.5%的十二烷基肌氨酸钠5g、蛋白酶K200mg和浓度为0.5mol/L的EDTA200mL）后在55℃条件消化3小时，消化液再放入65℃的环境中处理10min；之后用与消化液等体积的抽提液（抽提液由酚、氯仿和异戊醇组成，其体积比为25:24:1）抽提2次；然后用无DNA的RNA酶消化其中的RNA，并用抽提液抽提两次；接着吸取的上清中加2倍体积的预冷无水乙醇放-20℃1小时，经沉淀后离心去除上清液，再用70%的乙醇沉淀两次，并离心去除上清液在室温条件下干燥后加0.1×TE缓冲液水溶解。

在微卫星标记的筛选过程中，从大量位点中反复验证筛选出多个重复性好、稳定性好、符合哈代温伯格平衡定律、无连锁关系、不存在无效等位基因、多态性高的微卫星位点，以便于精确地计算个体间的亲缘关系。微卫星位点的多态性水平可用信息含量值（PIC）衡量，根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0.60的标记，最终筛选得到符合上述条件，PIC值大于0.60的位点用于凡纳滨对虾个体间亲缘关系分析。

b、亲虾DNA均用微卫星引物分别进行PCR扩增

利用选取的8个重复性好、稳定性好、多态信息含量（PIC）值大于0.60的微卫星位点，分别对所有引进个体的DNA进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：100ng每个凡纳滨对虾个体的基因组DNA，10×PCRBuffer，2.5μL；Mg²⁺，1.5mmol/L；rTaq（5U/μL），0.2μL；dNTP（10mmol/L），0.5μL；上述正反向引物（10μmol/L），各0.5μL；加双蒸水补体系到25μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃预变性30s，退火30s，延伸40s，循环32次，72℃延伸10min，4℃保存。本实施例利用的8个凡纳滨对虾微卫星引物的信息见表2。

表28个用于凡纳滨对虾亲缘关系分析的微卫星标记

c、PCR扩增产物先通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶-EB染色系统进行检测，在凝胶成像系统下观察，在不同个体间获得的多态性等位基因，进而获得本位点的遗传变异图谱信息。

d、利用图谱分析软件Quantity One4.5软件对所有的遗传变异图谱信息进行数字化处理。

e、数字化数据导入亲缘分析软件分析计算

使用的亲缘分析软件为POPGEN软件和PHYLIP软件进行遗传多样性和亲缘分析，引进的凡纳滨对虾良种群体的遗传多样性见表3，群体间的遗传距离见表4。

表3凡纳滨对虾引进群体的遗传多样性

表4凡纳滨对虾7个引进群体的遗传距离

3、根据遗传信息进行组配。本实施例中选择亲缘系数小于0.050的亲虾进行组配，二者间亲缘系数大于0.050的亲虾不参与家系的构建。基于亲缘系数和个体所在群体具有的优良性状从7个群体中挑选符合条件的亲虾进行组配，最终成功建立207个家系。

本发明将凡纳滨对虾优势基因收集起来组建成一个具有较丰富遗传多样性的基础群体，可以为满足多种育种目标奠定基础。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）、选用多个具有不同优良性状的凡纳滨对虾群体，并对群体内所有个体进行编号； 

（2）、利用分子标记对所述凡纳滨对虾个体进行遗传分析，检测个体间的亲缘关系，具体包括下述子步骤：

a、从凡纳滨对虾的大量微卫星位点中筛选出具备重复性好、稳定性好、符合哈代温伯格平衡定律、无连锁关系、不存在无效等位基因、多态信息含量值大于0.60的高多态性微卫星位点，以便于精确地计算个体间的亲缘关系；

b、分别提取所有个体的基因组DNA，每个个体的基因组DNA均使用筛选出的高多态性微卫星位点的正反向引物，分别进行PCR扩增；

所述PCR扩增体系为：100 ng每个个体的基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5 mL；Mg2+，1.5 mmol/L；5U/mL 的rTaq，0.2 mL；10 mmol/L 的dNTP，0.5 mL；10 mmol/L的所述正反向引物各0.5 mL；加双蒸水补体系到25 mL；

所述PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃预变性30 s，退火30 s，延伸40 s，循环32次，72 ℃延伸10min，4 ℃保存；

c、通过对PCR产物检测获得每个个体在每对正反向引物的遗传变异图谱信息；

d、利用图谱分析软件对所有的遗传变异图谱信息进行数字化处理；

e、将数字化数据信息导入亲缘分析软件计算，获得亲缘关系信息；

（3）、根据个体间的亲缘关系以及个体的优良性状制定配种方案，建立大量家系，构建出基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体。

2.根据权利要求1所述的一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中优良性状为生长快、抗病性强、出肉率高、抗逆性强或存活率高中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中亲缘关系的度量指标采取亲缘系数，所述亲缘系数保持在0.050及以下。

4.根据权利要求1所述的一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，其特征在于：所述步骤c中将PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶-EB染色系统进行检测，在凝胶成像系统下观察，在不同个体间获得的多态性等位基因，就是本位点的遗传变异图谱信息。

5.根据权利要求1所述的一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，其特征在于：所述步骤d中使用的图谱分析软件为Quantity One 4.5软件。

6.根据权利要求1所述的一种基于遗传信息和优良性状的凡纳滨对虾基础群体的构建方法，其特征在于：所述步骤e中使用的亲缘分析软件为POPGEN软件和PHYLIP软件。