CN102653785A

CN102653785A - 团头鲂微卫星家系鉴定方法

Info

Publication number: CN102653785A
Application number: CN2011100511821A
Authority: CN
Inventors: 高泽霞; 王卫民; 曾聪; 罗伟; 王焕岭
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-03-03
Filing date: 2011-03-03
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2031-03-03
Also published as: CN102653785B

Abstract

本发明属于鱼的育种技术领域，涉及分子标记技术领域。本发明具体涉及一种利用微卫星标记准确鉴定团头鲂混养家系的方法。其步骤包括：①采用人工繁殖的方法繁育团头鲂家系，54个家系子代混合放养在同一池塘；②采用荧光标记引物和巢式PCR扩增法分析亲本在12个微卫星位点的基因型，筛选出适合家系鉴定的有效微卫星；③分析混养家系子代在有效微卫星位点的基因型；④鉴定各子代的亲本来源。本发明首次在团头鲂上建立了亲子鉴定的方法，其鉴定准确率达到了98.4％。通过家系的筛选和鉴定，可以减少在团头鲂群体选育中存在的近亲繁殖现象，更有利于实现家系选育，从而加快选育的进程，提高选育效果。

Description

团头鲂微卫星家系鉴定方法

技术领域

本发明涉及鱼育种和分子标记技术技术领域，具体涉及一种利用微卫星标记鉴定团头鲂混养家系子代亲本的方法。

背景技术

团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih，1955)，又名武昌鱼，隶属于硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，鲂属，其自然分布仅局限于长江中下游少数几个湖泊中。团头鲂是我国重要的草食性经济鱼类之一，由于其食性广、成本低、生长快、成活率高、易捕捞，能在池塘中产卵繁殖，凡具有味美、头小、含肉率高、体形好、规格适中等优点，因而被作为优良的草食性鱼类品种在全国普遍推广。

近年来，团头鲂成为市场畅销品种，养殖经济效益较好。因而市场对团头鲂优良苗种的需求十分迫切，亟待规范团头鲂的苗种繁育生产，加快团头鲂的种质资源保护和良种选育进程。由于团头鲂苗种生产中普遍存在近亲繁殖的现象，导致种质退化加剧，常规苗种的生长速度较慢，不仅影响了团头鲂的生长性能，而且在一定程度上制约了团头鲂在更大范围的推广。虽然我国已经选育出生长较快的浦江一号，但苗种仍不能满足市场需求。还有待进一步加强团头鲂种质资源监测、评估与保护，挖掘和创新种质资源，选育出生长快、抗逆性好的团头鲂优良品种。

在鱼类遗传育种中，准确的系谱记录对于育种计划的制定具有关键性作用。由于鱼类所处的环境特点以及繁育过程中自然交配、混合受精等原因，常常造成个体系谱不明确。对于鱼类来说，为了保持家系信息，对不同的家系实施分池养殖存在所需水体大、管理强度大的缺陷，同时，大大限制了家系的数目，不利于得出正确的估计值，更重要的是，不同的环境因素影响了不同家系的性状，使育种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于育种计划的制定(Gjederm 2005)；在混合养殖群体中保持家系信息，在鱼类上应用的传统的物理标记方法有剪鳍、烙印、体外标、编码金属标、被动整合雷达标、荧光染料、电子芯片等。其中一些标记在家畜上应用较广泛也有良好的效果，如烙印法。但是对水产动物尤其是鱼类来说，由于其所处的水体环境及鱼体自身的特点，使用物理标记存在操作繁琐、易损伤鱼体、对生长造成一定影响、标记保存时间不长等缺陷。而且，物理标记不适用于仔鱼或幼鱼，因此，在育种时首先需要对各家系分池养殖，待到可以进行物理标记时才能实施混养。这样不仅增加了养殖成本，更重要的是引入了环境误差。因此，对于鱼类个体标识、家系鉴定一直是难以解决的问题，这在很大程度上限制了良种选育工作的开展。

微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点，为水产动物选育中保持家系信息、确认亲缘关系、追踪系谱提供了有用的工具。如果已知父母的基因型，微卫星标记能在没有外部物理标记且不需要分开养殖的情况下区分出混养群体中个体所属的家系。有关研究(Vandeputte et al.2004；Jerry et al.2006；董世瑞等2008；Wang et al.2009)证实了微卫星在水产动物研究中确认父母本和分析家系关系中的应用价值。目前尚未见将微卫星标记应用于团头鲂家系鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用微卫星标记的多态性鉴定团头鲂家系，为团头鲂遗传育种提供必要的分子分子标记。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用微卫星标记的多态性鉴定团头鲂家系的方法，其步骤包括：

1)将来自天然群体的团头鲂亲本进行人工繁殖，得到至少50个家系，待鱼苗孵出10天后，从每个家系中随机选取200尾鱼苗混合放入池塘中，作为用于亲子鉴定的家系群体；

2)选取步骤1)的团头鲂繁殖亲本的鳍条组织，提取基因组DNA，以DNA为模板，选用12对微卫星引物，对TTF01，TTF02，TTF03，TTF04，TTF05，TTF06，TTF08，TTF09，MAC31，MAC46，MAC50，MAC53共12个微卫星位点进行巢式PCR扩增；

3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法指PCR反应体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加有M13通用序列(5’-CAGTCGGGCGTCATCA-3’)；位点特异性反向引物；FAM、NED、HEX三种荧光标记的M13通用引物。PCR反应体系为6μL：50ng DNA，3μL JumpStart Red Mix(购自Sigma公司)，1.5pmol反向引物和1.5pmol的荧光标记通用引物，0.1pmol的含加尾序列的正向引物，100μM的亚精胺；

4)团头鲂繁殖亲本在12个微卫星位点的PCR产物经ABI 3730型基因分析仪根据荧光标记进行基因型分析，使用P-LOCI软件模拟分析，筛选出适合鉴定团头鲂混养家系的有效微卫星位点9个TTF01，TTF02，TTF03，TTF04，TTF05，TTF08，MAC31，MAC46，MAC50；

5)将团头鲂子代混养1年后，随即选取182尾个体，剪取各个体的鳍条组织，提取个体基因组DNA，选取步骤4)中的9个有效微卫星位点，分析子代的基因型；

6)根据亲本和子代在9个微卫星位点的基因型，采用CERVUS 2.0软件对不同家系进行区分，鉴定子代个体的父母本。

其中

步骤2)所述的12对微卫星引物的核苷酸序列如下所示：

TTF01-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCATGGAGATGAAAGCTGAAGGAA-3’

R：5’-ATGCACGAACTGCCACATAA-3’

TTF02-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAAAACAGCTGCTACCCTTGGA-3’

R：5’-TTTGCCAGAAGAGCAAATCA-3’

TTF03-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA-3’

R：5’-CTGACCGGATAGCAAAGTGA-3’

TTF04-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAGACTGGAGTCGTCAGGCTTC-3’

R：5’-TGCCCCACATTGTTAGACTG-3’

TTF05-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCACTAGTGGGTAGGTGGCAGGT-3’

R：5’-TGACTGGGAGAGACAGAGGAG-3’

TTF06-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAGGCAGGTCAGGCACATTTAT-3’

R：5’-TCTCTACCTCACATTCTCTCATTCT-3’

TTF08-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAGGGGAAATAAAGGGAGAAAGTG-3’

R：5’-TTTCTCCTGATCCGTTGACC-3’

TTF09-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA-3’

R：5’-GAGGTGGGACTGTGTGGAAT-3’

MAC31-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAGCATCGGTAACAGTCAAA-3’

R：5’-CAGGGATAATGTAGGAAGAA-3’

MAC46-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCATACAAGAGCAGGTAAGCA-3’

R：5’-CAGCCACTGACTGAACAT-3’

MAC50-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAGGTATCGTGCTTGCTTGT-3’

R：5’-TTCCATTTAGAGCTACGG-3’

MAC53-F：5’-CAGTCGGGCGTCATCAAGCGGGTCTGTGCTAATC-3’

R：5’-CGGCCAGTTCCAAAGAGT-3’

步骤3)所述通用引物M13的核苷酸序列如下：

M13：5’-CAGTCGGGCGTCATCA-3’

本发明具有以下优点：

1.本发明可将不同家系子代混养在一起，不需要将各家系子代采用水族箱或水泥池分开放养，可极大节省人力、物力和财力。

2.本发明将不同家系子代在同一池塘混养，可避免家系分开放养引入的环境误差，提高选育效果；

3.本发明不需要对个体使用物理标记，避免了物理标记存在的操作繁琐、易损伤鱼体、对生长造成一定影响、标记保存时间不长等缺陷。

4.本发明采用巢式PCR扩增方法，只需要对通用引物M13进行荧光标记，采用微卫星位点正向引物5’端加M13序列的方法，不需要对每对微卫星引物进行荧光标记，极大节省了引物荧光标记的费用。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是扩增TTF01微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：2是扩增TTF01微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：3是扩增TTF02微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：4是扩增TTF02微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：5是扩增TTF03微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：6是扩增TTF03微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：7是扩增TTF04微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：8是扩增TTF04微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：9是扩增TTF05微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：10是扩增TTF05微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：11是扩增TTF06微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：12是扩增TTF06微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：13是扩增TTF08微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：14是扩增TTF08微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：15是扩增TTF09微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：16是扩增TTF09微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：17是扩增MAC31微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：18是扩增MAC31微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：19是扩增MAC46微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：20是扩增MAC46微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：21是扩增MAC50微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：22是扩增MAC50微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：23是扩增MAC53微卫星位点的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：24是扩增MAC53微卫星位点的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：25是M13通用引物序列。

图1：巢式一步法PCR扩增图解。(A，B)阴影框表示微卫星位点特异性引物；(C)波浪状灰色框表示通用引物M13序列，星号为荧光标记；(D)第一轮PCR循环，含有M13序列的正向引物整合到PCR产物中；(E)这些PCR产物成为了荧光标记M13引物的扩增模板，在下一PCR循环，退火温度时整合到PCR产物中；(F)最后的PCR产物带有了荧光标记，可以使用荧光检测系统检测。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方案：

1)团头鲂家系的繁育及子代混养

从团头鲂天然群体(湖北省淤泥湖和梁子湖，江西省鄱阳湖)中挑选了44尾优良母本和34尾父本，通过注射激素的方法进行人工催产，激素注射方法为：第一次注射，只注射雌鱼，注射促黄体素释放激素A2(LRH-A2)，注射剂量为1mg/kg体重；第二次注射约在第一次注射12h后进行，雌雄团头鲂均注射，注射药物为促黄体素释放激素A2和地欧酮(DOM)，注射剂量分别为4mg/kg体重和5mg/kg体重。在第二次注射完6～8h后，进行人工授精，通过1雄配2雌或1雌配2雄的方法构建了团头鲂父系和母系半同胞家系，共繁殖获得了54个家系，记录各雌雄亲本交配方式。剪取繁殖亲本的臀鳍鳍条一小块，储存在95％的酒精内，保存于-20℃。将受精卵放入容积为1m³的水缸内孵化，待鱼苗孵出10天后，从每个家系随机选取200尾鱼苗共同放入面积为4亩的池塘中。待子代在池塘内喂养1年后，随即选取182尾子代，剪取团头鲂小块臀鳍条组织，储存在95％的酒精内，保存于-20℃。

2)团头鲂亲本和子代基因组DNA提取

取团头鲂每个个体的一小块鳍条组织放入1.5mL的Eppendorf离心管中，加入600μL的细胞裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 8.0；EDTA 50mM，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125Mm)，用剪刀将鳍条组织剪碎，加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K 6μL，放入65℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解完。在常温下静置离心管直到其温度降到室温，加入200μL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放入4℃冰箱内10min，12,000rpm 4℃离心10min，取上清液，重复离心一次，取上清液到另一新离心管中。加入与上清液等量的异戊醇，充分混匀，室温下沉淀2min，12,000rpm 4℃离心10min，弃去上清液。用70％的酒精洗涤DNA两遍，室温干燥约10min，加入100μL去离子水溶解DNA。每个DNA样品加入10mg/mL RNA酶1μL。用NanoDrop ND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释成100ng/μL的工作液。

3)PCR引物的筛选及扩增反应体系优化

从已发表的团头鲂微卫星引物文献中(李绍戊等2006；Tang等2009)，选取了12个微卫星位点进行PCR扩增，扩增引物及条件如表1所示。引物优化时PCR反应体系为20μL：含有正、反引物各0.2μM，dNTP各200μM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg²⁺、1个单位的Taq酶，从个体中任意取5个个体的DNA工作液等量混合，再取100ng DNA作为PCR模板。扩增反应在Bio-Rad DNA Engine peltier Thermal Cycler PCR系统上完成，PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，Ta退火30s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；最后72℃再延伸5min。Ta值设置50.0，55.5，58.4，61.8℃四个温度梯度。各位点最终优化的PCR扩增温度如表1所示。

表1设计的12个团头鲂微卫星位点信息

4)微卫星位点基因型分析

PCR反应：在每一个反应体系中含三个引物，其包括5’末端有尾巴的表1所示的微卫星位点的正向引物和反向引物以及带荧光标记(FAM、NED和HEX三种，购自ABI公司)的M13通用引物。PCR反应体系为6μL：50ng DNA，3μL JumpStart Red Mix(Sigma公司)，1.5pmol反向引物和1.5pmol的荧光标记通用引物，0.1pmol的含M13序列的正向引物，100μM的亚精胺。

PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，Ta(视引物而定，见表1)退火45s，72℃延伸45s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min。各位点扩增时采用的M13荧光标记见表1。

PCR反应完后，从每个个体的每个位点的PCR产物中吸出1μL，根据片段的大小和荧光标记的颜色，将用荧光标记为NED、FAM、HEX各1个位点的PCR产物混合在一起，作为上机检测的样品。将混合3μL的PCR产物样品加入到ABI 3130基因分析仪配置的96孔板内，每个孔内加入0.5μL的GeneScan^TM 350ROX^TM标准片段(购自ABI公司)，另外在每个孔内加入6.5μL的Hi-Di^TM甲酰胺(ABI公司)，将96孔板放入PCR仪器内于95℃变性10分钟，变形后立即置于冰上，然后上样到ABI 3730基因分析仪(购自美国ABI公司)分析，或者用铝箔纸包好后放入-20℃保存待上机分析。待基因分析仪电泳结束后，用软件GeneMapper 4.0做基因型分析，读取各个体在各微卫星位点的基因型。

5)有效微卫星位点的选取及亲子鉴定分析

采用步骤4)的方法分析78尾团头鲂繁殖亲本在表1所示的12对微卫星位点的基因型，通过软件CERVUS 2.0(Marshall等1998)模拟各繁殖家系子代的基因型，筛选到9个微卫星位点(TTF01，TTF02，TTF03，TTF04，TTF05，TTF08，MAC31，MAC46，MAC50)鉴别子代亲本来源的准确率可以达到100％。选取这9个有效微卫星位点的引物在随即选取的182个个体中扩增，获得子代个体在这9个微卫星位点的基因型。采用软件CERVUS 2.0计算混养子代群体各微卫星座位等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率，并据LOD值鉴定182尾个体的父母本。对于任何一子代，其鉴定的亲本来源的可信度低于95％时，人工与其期望的亲本的基因型做比较评估。

6)结果

在9个微卫星位点对78尾团头鲂繁殖亲本和182尾混养家系子代个体进行了扩增和基因分型。基因型应用CERVUS 2.0软件分析结果如表2所示。为保证鉴定结果准确，据LOD值鉴定候选父母时，只有所有微卫星座位全部匹配，并符合亲本交配体制的才确认亲子关系。最终确认了179尾混养后裔的父母，混养家系的亲子鉴定率为98.4％。

表29个团头鲂微卫星位点在混养家系中的检测值

注：N_a为等位基因数目，n为检测家系子代个体数目，H_o为观察杂合度，H_E为期望杂合度，PIC为多态信息含量，HW为哈迪温伯格平衡检验，NS表示符合，^**表示偏离显著。

参考文献：

董世瑞，孔杰，张天时等.中国对虾微卫星家系鉴定的模拟分析与应用.水生生物学报，2008，32(1)：97-101李绍戊，常玉梅，梁利群等.团头鲂微卫星标记的快速制备.中国水产科学，2006，13(2)：187-192

Jerry D R，Preston N P，Crocos P J，et al.Application of DNA parentage analyses for determining relative growthrates of Penaeus japonicus families reared in commercial ponds.Aquaculture，2006，254：171-181

Gjedrem，T.Selection and breeding programs in aquaculture.The Netherlands：Springer，2005，1-195

Tang S J，Li S F，Cai W Q.Development of microsatellite markers for blunt snout bream Megalobramaamblycephala using 5’anchored PCR.Molecular Ecology Resources，2009，9(3)：971-974.

Vandeputte M，Kocour M，Mauger S，et al.Heritability estimates for growth-related traits using microsatelliteparentage assignment injuvenile common carp(Cyprinus carpio L.).Aquaculture，2004，335：223-236

Wang H P，Li L，Wallat G，Brown B，et al.Evaluation of relative growth performance and genotype byenvironment effects for cross-bred yellow perch families reared in communal ponds using DNA parentageanalyses.Aquaculture Research，2009，40(12)：1-11

Claims

1.一种团头鲂微卫星家系鉴定方法，其特征包括如下步骤：

3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法中PCR反应体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加有M13通用序列；位点特异性反向引物；FAM、NED、HEX三种荧光标记的M13通用引物；PCR反应体系为6μL：50ng DNA，3μL JumpStart Red Mix(购自Sigma公司)，1.5pmol反向引物和1.5pmol的荧光标记通用引物，0.1pmol的含加尾序列的正向引物，100μM的亚精胺；

4)团头鲂繁殖亲本在12个微卫星位点的PCR产物经ABI 3730基因分析仪根据荧光标记进行基因型分析，使用P-LOCI软件模拟分析，筛选出适合鉴定团头鲂混养家系的有效微卫星位点9个TTF01，TTF02，TTF03，TTF04，TTF05，TTF08，MAC31，MAC46，MAC50；

5)将团头鲂子代混养1年后，随即选取182尾个体，剪取各个体的鳍条组织，提取个体基因组DNA，选取步骤4)中的9个有效微卫星位点，分析各子代的基因型；

6)根据亲本和子代在9个微卫星位点的基因型，对不同家系进行区分，鉴定子代个体的父母本；

其中

步骤2)所述的12对微卫星引物的核苷酸序列如下所示：

TTF01-F：CAGTCGGGCGTCATCATGGAGATGAAAGCTGAAGGAA(5’-3’)，

R：ATGCACGAACTGCCACATAA(5’-3’)；

TTF02-F：CAGTCGGGCGTCATCAAAACAGCTGCTACCCTTGGA(5’-3’，)

R：TTTGCCAGAAGAGCAAATCA(5’-3’)；

TTF03-F：CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA(5’-3’)，

R：CTGACCGGATAGCAAAGTGA(5’-3’)；

TTF04-F：CAGTCGGGCGTCATCAGACTGGAGTCGTCAGGCTTC(5’-3’)，

R：TGCCCCACATTGTTAGACTG(5’-3’)；

TTF05-F：CAGTCGGGCGTCATCACTAGTGGGTAGGTGGCAGGT(5’-3’)，

R：TGACTGGGAGAGACAGAGGAG(5’-3’)；

TTF06-F：CAGTCGGGCGTCATCAGGCAGGTCAGGCACATTTAT(5’-3’)

R：TCTCTACCTCACATTCTCTCATTCT(5’-3’)；

TTF08-F：CAGTCGGGCGTCATCAGGGGAAATAAAGGGAGAAAGTG(5’-3’)

R：TTTCTCCTGATCCGTTGACC(5’-3’)；

TTF09-F：CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA(5’-3’)，

R：GAGGTGGGACTGTGTGGAAT(5’-3’)；

MAC31-F：CAGTCGGGCGTCATCAGCATCGGTAACAGTCAAA(5’-3’)，

R：CAGGGATAATGTAGGAAGAA(5’-3’)；

MAC46-F：CAGTCGGGCGTCATCATACAAGAGCAGGTAAGCA(5’-3’)，

R：CAGCCACTGACTGAACAT(5’-3’)；

MAC50-F：CAGTCGGGCGTCATCAGGTATCGTGCTTGCTTGT(5’-3’)，

R：TTCCATTTAGAGCTACGG(5’-3’)；

MAC53-F：CAGTCGGGCGTCATCAAGCGGGTCTGTGCTAATC(5’-3’)，

R：CGGCCAGTTCCAAAGAGT(5’-3’)；

步骤3)所述通用引物M13的核苷酸序列如下：

M13：5’-CAGTCGGGCGTCATCA-3’。

2.权利要求1所述的方法在团头鲂家系标记辅助选择中的应用。