CN106554996A - 一种团头鲂转铁蛋白受体基因snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于鱼类分子标记筛选与应用技术领域，具体涉及一种团头鲂转铁蛋白受体基因SNP分子标记及其应用，该分子标记可应用于辅助团头鲂抗病品种的选育。本发明的分子标记从转铁蛋白受体基因(GenBank accession No.KM225267)中克隆得到，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列的267位碱基处的R是A或G(该突变位于基因内含子部分)，该突变导致NocI酶酶切多态性。利用本发明筛选的分子标记对团头鲂抗病性状进行了关联分析的应用表明，本发明的分子标记可在团头鲂抗病性状辅助选择中应用。

Description

一种团头鲂转铁蛋白受体基因SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于鱼类分子标记制备领域，具体涉及一种团头鲂转铁蛋白受体基因SNP分子标记及其应用，所述的分子标记可应用于辅助团头鲂抗病品种的选育。
背景技术
团头鲂(Megalobrama amblycephala)又名武昌鱼，属鲤形目，鲤科，鲌亚科，鲂属，是我国重要的经济养殖鱼类。随着团头鲂养殖在全国进行推广，团头鲂在淡水养殖鱼产量渐渐占有一定比重。近年来人们对团头鲂需求量的提升使得养殖规模进一步扩大，团头鲂已成为我国主要的经济养殖鱼类之一。但在大规模养殖的过程中，由于近亲繁殖、养殖密度高、水质恶化等导致疾病爆发频繁，其中，细菌性败血症是危害最大的疾病之一。细菌性败血症发病率高、爆发性强、流行性广、周期长、殃及鱼类品种多、死亡率高，一旦爆发，会给渔民造成很大的经济损失。因此，在推广生态养殖、改善养殖环境、发展养殖技术的同时，深入分析鱼类的免疫应答机制、研究抗病相关基因、选育获得抗病品种成为不可阻挡的趋势。
同哺乳类动物比较，鱼的特异性免疫系统还没有发育完善，非特异性免疫在抵御外部的刺激和外源微生物中发挥十分重大的意义，已有研究表明转铁蛋白受体参与鱼类的非特异性免疫过程。铁代谢的平衡对机体生命活动的正常进行起着至关重要的作用，脊椎动物对铁的转运是通过转铁蛋白受体等基因的调控进行的，转铁蛋白受体(TransferrinReceptor，TfR)是一种参与铁的吸收同时可以调节细胞生长的必需蛋白质。细胞吸收铁是通过转铁蛋白结合三价铁离子，再与转铁蛋白受体结合，通过内吞作用形成内吞小体。铁不仅是机体生命活动必要的微量元素之一，也是多数病原菌不可或缺的营养元素，当病原菌入侵机体时，两者对铁的共同需求形成了竞争关系，转铁蛋白受体可以通过调控铁代谢发挥免疫作用。
单核苷酸多态(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起DNA序列的多态性。由于其具有分布广泛、密度高、数量多、易于自动化分析等优点，SNP成为继微卫星之后的第三代遗传标记，是研究基因组多态性以及进行疾病、生长、繁殖性能等相关基因识别和定位的一种新工具，许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种团头鲂转铁蛋白受体基因的SNP分子标记，用于辅助团头鲂抗病品种的选育。
本发明通过给团头鲂注射嗜水气单孢菌进行感染，采用引物设计、PCR扩增测序、序列比对分析的方法获得SNP位点，通过高分辨率熔解曲线法对SNP位点进行分析，用SPSS软件对数据进行处理和统计，通过卡方检验分析不同基因型与抗病性状的显著性差异关系。通过试验分析发现在转铁蛋白受体基因中有1个与团头鲂抗病性状显著相关的SNPs位点，这个SNPs位点为序列1中267位A突变为G(267A/G)。
申请人通过基因克隆技术，采用高分辨率溶解曲线法，首次证实1个与团头鲂抗病相关基因转铁蛋白受体基因(GenBank accession No.KM225267)多态性SNP分子标记。
申请人筛选到一个与团头鲂抗病性状相关的基因即转铁蛋白受体基因SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：
TCACTCTGAAAACATGTAAGGGCAAGTCATGAAGCTATTCTCTTCAATATAGAAGATTTTCAGCACAAGAAGTAAAACGTAATATCAGGAACATTGAGGAGGTTTCAGTTGAAGTGCCTAAAATCTGCTTGATTAAAGACAGACATTTAAATCTCATAAAGACACTGTTTTTTCTTTGTTATCTCTCAAATGGCAACTGATTCAGATAATTCTGTTATAATACCATR(A/G)GCAAAATAAATTTGAATGGGAAGAATGGCTTACGATTTTTGAAATTGTTGTCCTGGCTTGATCCATCGTGGTCTCAAATAACTGCAGCAAGAGAATGAGAAATGTTTAGTGGAACACAGAAATCTAAGATCACTCTGTAGGAGGTAAATTTATCATAAAACAAAGATAGATTCCTTATGTCAACAAAAAGGGCTGTATAATGATCTGCAGTAACAGATATTATATT
上述序列的267位碱基处的R是A或G的突变(该突变位于基因内含子部分)，该突变导致NocI酶酶切多态性。
申请人提供了一种检测转铁蛋白受体基因SNP分子标记的引物对，该引物对的序列如下所示：
正向引物F：AGTTGAAGTGCCTAAAATCTGCT，
反向引物R：TCGTAAGCCATTCTTCCCATT。
申请人提供了一种用于转铁蛋白基因基因型分型的引物对，该引物对的序列如下所示：
正向引物F：AGTTGAAGTGCCTAAAATCTGCT，
反向引物R：TCGTAAGCCATTCTTCCCATT。
本发明筛选的团头鲂转铁蛋白受体基因SNP分子标记可在辅助团头鲂抗病性状的选择中应用。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是一个用于检测267位A/G位点的团头鲂转铁蛋白受体基因序列(即，与团头鲂抗病性状相关的分子标记1，该序列的267位碱基处的碱基R是A或G的突变)。
序列表SEQ ID NO：2是检测本发明的分子标记的引物对的正向引物序列Tfr-snp-F。
序列表SEQ ID NO：3是检测本发明分子标记的引物对的反向引物序列Tfr-snp-R。
序列表SEQ ID NO：4是本发明设计的用于模板扩增的正向引物序列Tfr-s-F。
序列表SEQ ID NO：5是本发明设计的用于模板扩增的反向引物序列Tfr-s-R。
图1：团头鲂转铁蛋白受体基因267位碱基位A/G位点不同基因型的测序峰图
图2：用于模板扩增的引物PCR产物凝胶电泳检测图，泳道1为2000bp的marker凝胶电泳条带，作为参照；泳道2为用于模板扩增的引物PCR产物条带，条带大小为1924bp。
图3：用于基因型分型的引物PCR产物凝胶电泳检测图，泳道1为用于基因型分型的引物PCR产物条带，大小为156bp；泳道4为2000bp的marker凝胶电泳条带，作为参照条带。
图4：采用高分辨率熔解曲线法对转铁蛋白受体基因267位碱基位A/G位点进行分型的结果统计图。
图:5：与团头鲂抗病性状相关的基因即转铁蛋白受体基因SNP分子标记的核苷酸序列，在该序列的267位碱基处的R存在A或G的突变。
具体实施方式
实施例1
1.试验对象(试验材料)
实验所用团头鲂为一龄团头鲂，共1500尾，样本采自湖北百容水产良种有限公司。从池塘打捞上来后先在桶里暂养至稳定后，对其注射嗜水气单胞菌进行感染，注射嗜水气单胞菌的浓度为1×107cfu/mL，水温保持在27-29℃。采集12h内死亡(易感组)以及5d后仍然存活的鱼(抗性组)的鳍条样本，置于无水乙醇中保存，后带回实验室于-20℃保存。
2.试验方法
2.1利用酚-氯仿法提取团头鲂基因组DNA，具体步骤如下所述：
(1)取0.2g团头鲂的鳍条放入2mL离心管中，加入600μL细胞裂解液，用消过毒的剪刀将鳍条剪碎，加入6μL蛋白酶K(20mg/μL)，60℃水浴消化至澄清(需2-4h)。
(2)用等体积(600μL)酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)提取2次，4500r/min离心20min，取上清于1.5mL离心管中。
(3)加入2倍体积预冷的无水乙醇进行沉淀，-20℃静置30min左右。
(4)4℃，12500r/min离心20min，弃上清。
(5)用70％乙醇洗涤沉淀2次，4℃，12500r/min离心10min。
(6)将沉淀晾干，加入50-100μL ddH2O溶解沉淀，静置过夜，待其充分溶解后于-20℃保存。
2.2获取SNP位点
在易感组和抗性组中各随机选择5个样本DNA作为模板。根据转铁蛋白受体基因的基因组DNA序列，用Primer premier 5.0软件设计引物(见表1)分别对10个模板进行PCR扩增(扩增体系见表2)，将扩增产物送武汉擎科创新生物科技有限公司进行纯化测序。用DNAstar软件对测序结果进行分析，通过序列比对和峰图分析，筛选出候选SNP位点。
表1本发明设计的用于模板扩增的引物序列
表2PCR扩增体系
扩增程序：95℃，5min；95℃，30sec；61℃，30sec；72℃，1min；72℃，5min.38Cycles
2.3SNP分型及其与抗病性的关联性分析
采用高分辨率熔解曲线法对转铁蛋白受体基因的267A/G位点进行分型，反应体系见表3，分型所用引物见表4，用SPSS软件对分型结果进行统计分析。
表3高分辨率溶解曲线法体系
高分辨率熔解曲线法程序：预变性：95℃，5min扩增(45cycles)：95℃，1min；60℃，10s；72℃，15s(搜集荧光值)高分辨率溶解曲线：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃连续搜集荧光值。
表4本发明设计的用于基因型分型的引物序列
3结果分析
本实施例的分析结果见表5。
表5分子标记1-转铁蛋白基因267A/G位点的抗病关联分析
表5说明：该位点与团头鲂抗病性状相关，AA基因型的个体更易感病，在抗性个体中，AG基因型占优势。
用SPSS软件对分型结果进行统计分析，通过卡方检验分析发现本发明中1个SNP位点基因型频率在抗病组和易感组中表现为差异极显著(P<0.01)。
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Claims (4)

1.一个与团头鲂抗病性状相关的基因即转铁蛋白受体基因SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：
TCACTCTGAAAACATGTAAGGGCAAGTCATGAAGCTATTCTCTTCAATATAGAAGATTTTCAGCACAAGAAGTAAAACGTAATATCAGGAACATTGAGGAGGTTTCAGTTGAAGTGCCTAAAATCTGCTTGATTAAAGACAGACATTTAAATCTCATAAAGACACTGTTTTTTCTTTGTTATCTCTCAAATGGCAACTGATTCAGATAATTCTGTTATAATACCATRGCAAAATAAATTTGAATGGGAAGAATGGCTTACGATTTTTGAAATTGTTGTCCTGGCTTGATCCATCGTGGTCTCAAATAACTGCAGCAAGAGAATGAGAAATGTTTAGTGGAACACAGAAATCTAAGATCACTCTGTAGGAGGTAAATTTATCATAAAACAAAGATAGATTCCTTATGTCAACAAAAAGGGCTGTATAATGATCTGCAGTAACAGATATTATATT
上述序列的267位碱基处的R是A或G，该突变导致NocI酶酶切多态性。
2.一种检测转铁蛋白受体基因SNP分子标记的引物对，该引物对的序列如下所示：
正向引物F：AGTTGAAGTGCCTAAAATCTGCT，
反向引物R：TCGTAAGCCATTCTTCCCATT。
3.一种用于转铁蛋白基因基因型分型的引物对，该引物对的序列如下所示：
正向引物F：AGTTGAAGTGCCTAAAATCTGCT，
反向引物R：TCGTAAGCCATTCTTCCCATT。
4.如权利要求1所述的一个与团头鲂抗病性状相关转铁蛋白受体基因SNP分子标记在团头鲂转铁蛋白受体基因SNP分子标记的应用。
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