CN103289992A

CN103289992A - Abcf1基因作为猪初生重性状相关的分子标记

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Publication number: CN103289992A
Application number: CN2012100515333A
Authority: CN
Inventors: 余梅; 李小平; 赵书红; 梁跃; 朱猛进; 李长春; 李新云; 曹建华
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-03-01
Filing date: 2012-03-01
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与初生重性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记由ABCF1基因克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述和图2所示。在序列表SEQ ID NO：1的第256bp处有一个A256-G256的碱基突变，导致MspI-RFLP多态性。本发明还公开了扩增ABCF1基因第16内含子部分序列所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

ABCF1基因作为猪初生重性状相关的分子标记

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关的分子标记的克隆及应用。本发明的分子标记与ABCF1基因有关。

背景技术

猪是重要的经济动物，猪肉由于其肉嫩味美长期以来广受消费者的青睐，是我国人民动物性蛋白的主要来源之一。近年来，人们对猪肉的消费量与日俱增，如何提高生产性能、降低生产成本成了猪育种工作者的工作重点之一。

分子生物学技术的迅速发展为此提供了重要的契机，凭借这一技术手段，科学家们发掘出了一大批与猪的初生重，断奶重，产仔数等重要繁殖性状显著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提高。猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，与猪出生后的生长速度及育成率有着不可分割的密切联系。最近有很多文献报道了初生重对生长速度的影响，李剑豪(李剑豪.长白猪初生重对生长速度及哺育率的影响.仔猪生产[J].2006.18)研究发现长白猪60日龄重与35日龄重均与初生重呈正相关且初生重与生长速度呈正相关。Beaulieu等(Beaulieu AD，Aalhus JL，Williams NH，Patience JF.Impact of piglet birth weight，birth order and litter size on subsequent growthperformance，carcass quality，muscle composition and eating quality of pork[J].J Anim Sci.2010)研究发现，初生重较低的猪生长速度较慢，从而使其进入市场的时间增加。另有研究表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在1.0Kg以下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1.0Kg以上时仔猪育成率没有明显的规律。初生重小于等于0.5Kg时仔猪育成率仅为55.56％(高建国.二花脸猪初生重对生长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992，24(1)：26)。此外，科学家发现体重越轻的新生儿，其长大后患II型糖尿病、心血管疾病和高血压的风险越大，有研究证明这一现象与基因的变异有关(Freathy等，Variants in ADCY5 and near CCNL1 are associated with fetal growth and birth weight[J].Nat Genet，2010，42(5)：430-435)。因此，对猪初生重相关基因的克隆和鉴定可为解释猪和其它哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。

ABCF1是ATP结合盒(The ATP-binding cassette，ABC)蛋白家族的GCN20亚家族成员，它与eIF2以及核糖蛋白结合以促进mRNA的翻译(Paytubi S，Wang X，Lam YW，Izquierdo L，Hunter MJ，Jan E，HundalHS，Proud CG.ABC50 Promotes Translation Initiation in Mammalian Cells [J].J Biol Chem，2009，284：24061-24073)。然而，该蛋白缺乏多数ABC转运蛋白所具有的横跨膜域。ATP结合盒超家族转运蛋白(ABC transporter super family)属于一类分布广泛、数目众多的跨膜转运体系。它们可以转运代谢产物、离子、糖、氨基酸、脂类、固醇等多种底物通过细胞膜。有研究表明，胎儿在母体内生长发育所需的营养物质包括氧气、葡萄糖、氨基酸等是通过转运蛋白从母体胎盘运输到胎儿胎盘的，因此转运蛋白的转运效率可能影响到胎儿的发育从而影响到仔猪的初生重。申请人前期用猪的SNP芯片对影响猪初生重变异的基因进行了研究，发现7号染色体上含有与该性状显著关联的基因，而猪ABCF1基因也位于7号染色体上，因此本发明拟探讨ABCF1基因与猪初生重的关系，寻求获得一种与猪初生重性状相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于从ABCF1基因中克隆一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关的分子标记，揭示其在猪标记辅助选择特别是猪初生重性状关联分析中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人从报道猪基因ABCF1克隆得到与猪初生重性状相关基因的部分DNA序列，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和图2所述。在序列表SEQ ID NO：1的第256bp处有一个A256-G256的碱基突变，导致MspI-RFLP多态性。这个碱基突变位于ABCF1基因第16内含子中。

本发明所述的分子标记的制备方法是：

用猪STS序列(GenBank收录号：BV726776)为模板设计引物；提取猪基因组DNA，设计引物，该引物的DNA序列如下所示：正向引物5’-TGGGGTGAGTTAAGGCTG-3’，反向引物5’-GGGCTTGGTTGGTTTGC-3’。

通过PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1和图2所示的核苷酸序列。

应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：1和图2所示的第256位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪初生重性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪初生重性状相关基因ABCF1的部分DNA序列，序列全长为597bp，在该序列的的第256bp处有一个A256-G256的碱基突变。

图1：是本发明技术流程图。

图2：是本发明克隆猪ABCF1基因的DNA序列(与序列表1所示的序列对应)，在图2所示序列的256bp处存在一个等位基因的突变，记为“R”，“R”之后的括号即(A/G)为突变位点(用标有下划线的加粗斜体字显示)，该扩增片段的首尾显示的引物序列用斜体加粗及阴影显示。

图3：是本发明中猪ABCF1基因第16内含子区的MspI-RFLP的三种基因型(AA AG GG)和基因组扩增电泳结果(P)，图中M：DNA分子量标准(DL50 ladder)。

图4：是本发明中猪ABCF1基因正向测序发现的A-G突变。

具体实施方式

实施例1：猪ABCF1基因部分DNA序列扩增

(1)利用苯酚抽提法提取大白猪(长白猪)肌肉组织总DNA

1)将大白猪(或长白猪，来自湖北省武汉市华中农业大学精品猪场，为常规推广的外来血缘的瘦肉型猪种)的肌肉组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET溶液(1ml)，蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度200μg/mL，十二烷基硫酸钠(即SDS，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴摇床中温育过夜消化。

2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。

7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)引物设计：

以报道的猪STS序列(GenBank收录号：BV726776)为模板，利用生物学引物设计软件Primer Premier 5.0，设计扩增ABCF1基因第16内含子的引物，该引物对的DNA序列如下：

ABCF1：正向引物：5’-TGGGGTGAGTTAAGGCTG-3’，(对应于序列表SEQ ID NO：1的第1-18位)，

反向引物：5’-GGGCTTGGTTGGTTTGC-3’(对应于序列表SEQ ID NO：1的第581-597位)；

该引物的DNA序列扩增片段长度为597bp。

(3)PCR扩增反应：

PCR反应：反应总体积为10μl，其中上述制备得到的猪DNA模板0.5μl，双蒸水7.0μl，buffer 1μl，Mg²⁺ 0.6μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl(10U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸25s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)PCR产物的纯化和测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自新长江生物科技(北京)有限公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物，具体步骤是按照100mg胶块加入400μl Gel-Shift结合缓冲液(GS Buffer)的比例加入GS缓冲液，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μl Wash Buffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管(DNA溶液)置于-20℃保存备用。

(5)DNA序列测定：序列测定由深圳华大基因科技有限公司完成，基因片段测正反两个反应。

实施例2：PCR-RFLP诊断方法建立

(1)PCR-RFLP引物序列(该引物也是扩增ABCF1基因第16内含子的引物)，该引物对的序列如下：

ABCF1 SNP：正向引物5’-TGGGGTGAGTTAAGGCTG-3’，(对应于图2所示序列的第1-18位)，

反向引物5’-GGGCTTGGTTGGTTTGC-3’。(对应于图2所示序列的第581-597位)；

该引物扩增片段长度为597bp(见图2和序列表SEQ ID NO：1)。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中上述制备的猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.1μl，10×缓冲液1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl(5U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物3μl，双蒸水5.9μl，10×缓冲液1μl，限制性内切酶MspI为0.1μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用4％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

用引物扩增猪基因组DNA得到了597bp特异性扩增片段，测序结果发现该片段在第256位发现一个A-G转换，位于第16内含子区(如图4所示)，造成一个MspI酶切位点

其中第254bp处为多态性酶切位点。酶切产生三种基因型，AA基因型只有597bp一条带，GG基因型有343bp和254bp两条带，杂合子AG基因型有597bp，343bp和254bp的三条带，如图3所述。

实施例3：本发明的分子标记在猪繁殖性状关联分析中的应用1

本实施例猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群(为常规推广应用品种)，仔猪出生0天测定体重。

根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析ABCF1基因第16内含子区A/G多态性位点的基因型效应及其与初生重性状的关系，其中固定效应包括性别效应、胎次效应、线别效应、候选基因的基因型效应，随机效应包括公畜效应、公畜内母畜效应；采用SAS(VersioB 8.0)软件中MIXED MODELS程序进行最小二乘均数估计(Breslow，N.E.；Clayton，D.G.Approximate Inference in GeneralizedLinear Mixed Models[J].Journal of the American Statistical Association，1993，88(421)：9-25)与统计分析。

对猪ABCF1基因第16内含子区MspI-RFLP多态性位点与初生重性状进行关联分析，具体结果见表1。由表1可知：在水台原种猪场的长白猪群的343个个体中AA基因型有14个，AG基因型有81个，GG基因型有248个，说明在该群体中G等位基因占优势。不同基因型之间性状差异显著性的结果显示猪ABCF1基因第16内含子区MspI-RFLP多态性位点各基因型与长白猪初生重呈极显著关联(P＜0.0001)。通过对AA、AG和GG基因型个体的最小二乘均数值进行两两比较，结果表明AA基因型个体的初生重显著高于AG型和GG型个体(P值均为＜0.0001)。

表1猪ABCF1基因第16内含子区A/G多态性位点基因型与长白猪初生重的关联分析结果

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。

实施例4：本发明的分子标记在猪繁殖性状关联分析中的应用2

本实施例猪群来自湖北金林原种畜牧有限公司原种猪场的纯种大白猪(为常规推广应用的品种)群，子代出生0天测定体重。

根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析ABCF1基因第16内含子区A/G多态性位点的基因型效应及其与初生重性状的关系，其中公畜、性别、胎次、基因型为固定效应，公畜内母畜为随机效应，以窝产仔数为协变量。采用SAS(Version 8.0)软件中MIXED MODELS程序进行数据处理与统计分析。分析结果见表2所述。

由表2可知：在湖北金林原种畜牧有限公司原种猪场纯种大白猪群的359个个体中，AA基因型有185个，AG基因型有82个，GG基因型有92个，说明在该群体中A等位基因占优势。不同基因型之间性状差异显著性的结果显示猪ABCF1基因第16内含子区MspI-RFLP多态性位点各基因型与大白猪初生重呈极显著关联(P＝0.0003)。通过最小二乘均数对AA、AG和GG基因型的个体进行两两比较，结果表明AG基因型个体的初生重显著低于AA型和GG型个体(P值分别为0.0002和0.0076)，而AA型和GG型个体之间初生重无显著差异(p＝0.7987)。

表2猪ABCF1基因第16内含子区A/G多态性位点基因型与大白猪初生重的关联分析结果

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。

Claims

1.一种与猪初生重性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如下所示：

TCCCCTGACTTAACCCTGCCTTGACCACTGTGACATTTCCACACTCTTCTCTAAAACCCA

GCTACCTCCAGGGCTGGCGGAAGACGCTGCTCATCGTCTCCCACGACCAGGGCTTCCT

GGATGATGTCTGTACAGATATCATCCATCTTGATGCCCAGCGGCTCCATTACTACAGGG

GCAATTACAGTAAGGAGGGTCATTGGGAGGCCTGGGGAGGAGGAGAGGTGGTGCCTA

GAGAGAGGCCTGGGGGGAGCC

GGAGGGAGTGATGAGAAGCTGCATCTTTCTGAATT

CTGGGCATCCTGCTGGGCAGAGCGACAGCCATTGATTCCAGCCCTTGTTTTGCTTCAGT

GACCTTCAAGAAGATGTACCAGCAGAAGCAGAAGGAGCTCCTAAAGCAGTATGAGAA

GCAAGAGAAAAAGCTGAAGGAGCTGAAGGCGGGCGGCAAGTCCACCAAGCAGGCGGT

GAGCAGGGGTCTTCCTGGCAGGGGCCCGTCTCAGGAGCAGGGAGAAGGGGCGGGACT

CAGACCCAACCTGCCTCTGGAGGCCCTTGGTGAAGGGCACGGGTGTCTCCCCAGGAAA

AGCAAACCAAGGAAGCCC

上述序列中的R是A或G，导致MspI-RFLP多态性。

2.一种检测如权利要求1所述的分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-TGGGGTGAGTTAAGGCTG-3′，

反向引物：5′-GGGCTTGGTTGGTTTGC-3′。

3.权利要求1所述的分子标记在猪初生重性状关联分析中的应用。

4.权利要求2所述引物对在猪初生重性状关联分析中的应用。