CN110396546A - 一种与猪高繁殖性状相关的基因和snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪遗传标记辅助选择技术领域的一种与猪高繁殖性状相关的基因和SNP分子标记及应用。该基因为BMPR1B基因，位于猪的8号染色体上，与猪高繁殖性状相关的功能区域位于BMPR1B基因的第一个内含子，该功能区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其第一个内含子包括一个保守的雌激素受体1结合区，雌激素受体1结合区中含有雌激素应答元件，所述雌激素应答元件与雌激素受体1结合，影响BMPR1B基因的表达水平以及子宫内膜腺体的发育情况，影响所述雌激素应答元件与雌激素受体1结合的SNP位点位于8号染色体第134,093,159位。本发明还提供一种与猪高繁殖性状相关的SNP分子标记，位于猪8号染色体第134,093,159位，此处碱基为G。本发明为辅助后期保种、育种工作奠定基础。

Description

一种与猪高繁殖性状相关的基因和SNP分子标记及应用

技术领域

本发明属于猪遗传标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪高繁殖性状相关的基因和SNP分子标记及应用。

背景技术

猪是在大约10,000年前的近东和中国地区被人类最早驯化的动物之一(Larsonet al.,2005；Larson et al.,2010)。一经驯化，猪迅速融入人类文明发展的进程，猪肉也在全世界范围内被广泛地作为最重要的动物蛋白来源之一。因此，猪作为畜牧业生产非常重要的经济动物，具有很高的研究价值。我国国土幅员辽阔，地形地貌复杂、气候多样，加之我国民族众多，各民族间的文化差异较大，造就了我国家猪以及其他畜禽品种遗传资源的丰富多样。据统计，中国拥有76个地方猪品种(王林云,2011)，约占世界地方猪品种总数(543个地方品种)(FAO,2014)的14.0％，是世界上拥有最丰富的猪遗传资源的国家。并且这些中国地方猪遗传资源具有独特的种质特点，例如，繁殖力强、抗逆性强、肉质好、性情温顺、耐粗饲等(王林云,2011)。

太湖猪——中国地方猪种中产仔数最多的品种之一，属江海型猪种，在我国享有“国宝”之誉，历史典籍和分子数据均证实该品种曾为世界猪种的遗传改良工作做出过巨大贡献。太湖猪具有杂交优势强，肉质鲜美等特点，尤其是“高繁殖”性状，长期以来受到养殖者、科研人员的青睐。产仔性状是繁殖性能的重要组成部分，在生产过程中繁殖性状主要通过测定初生产仔数、初生活仔数、平均初生体重、初生窝重、20日龄窝重、断奶重、断奶窝重等数据进行评估，其中产仔数是最受关注的性状。

发明内容

本发明的目的是提供一种与猪高繁殖性状相关的基因和SNP分子标记及应用。具体技术方案如下：

一种与猪高繁殖性状相关的基因，为BMPR1B基因，位于猪的8号染色体上，与猪高繁殖性状相关的功能区域位于BMPR1B基因的第一个内含子，该功能区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种与猪高繁殖性状相关的SNP分子标记，位于猪8号染色体第134,093,159位，此处碱基为G。

所述的SNP分子标记在鉴定或检测高繁殖性能猪中的应用。

当8号染色体第134,093,159位的碱基为G，且基因型表现为GG时，表明待测猪属于高繁殖性能猪。

所述SNP分子标记通过如下引物对获得：

F(5’-3’):TAAGAGCTCAACCGACCTGCGTTTTCTTTTC，

R(5’-3’):TAAGATATCTCTTCCCTTCCTACCACCCTCCT。

所述的SNP分子标记在高繁殖性能猪育种中的应用。

一种高繁殖性能猪的鉴定或检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测猪中的基因组DNA；

(2)以上述基因组DNA为模版，利用上述引物对进行PCR扩增；

(3)检测上述PCR扩增产物，如果扩增序列对应的8号染色体第134,093,159位的碱基为G，且基因型为GG时，表明待测猪属于高繁殖性能猪。

本发明的有益效果为：

(1)本发明基于全基因组重测序，应用特定生物信息学分析方法，筛选出与太湖猪种质特性相关联的基因组区段，进一步锚定太湖猪代表性种质特性——“高繁殖力”，定位影响太湖猪高繁殖力性状的新基因BMPR1B，并通过比较基因组学分析、BMPR1B基因的结构分析、序列保守性分析以及Encode表观基因组注释信息，锚定位于BMPR1B基因第一内含子内的一段太湖猪特有的单倍型，该区域存在能与ESR1相结合的雌激素受体反应元件(ERE)，进一步对猪的BMPR1B基因功能的系统解析，验证BMPR1B基因调控太湖猪的繁殖力分子机制是通过其第一内含子中ESR1结合chr8：134093159位点影响ERE ESR1的结合能力，从而影响太湖猪孕期子宫内膜BMPR1B基因的表达及太湖猪孕期子宫内膜腺体的发育。

(2)本发明还提供一种与猪高繁殖性状相关的SNP分子标记，可用于鉴定或检测高繁殖性能猪，为辅助后期保种、育种工作奠定基础。

附图说明

图1为猪基因组DNA电泳图。

图2为系统发生树，其中，树和分支长度代表群体间的遗传距离，DR-杜洛克猪，LR-长白猪，TH-太湖猪，DZ-滇南小耳猪和藏猪。

图3为太湖猪选择性清除分析，a)黑色框为选取的Het-minFST异常值；b)Manhattan图(基于minF_ST值)，黑色条块为a图红色框选择区域在基因组上的分布。Het，杂合度；minF_ST，最小F_ST值。

图4利用测序和RFLP验证8号染色体太湖猪10个SNP的特定基因型(6个品种176个个体)，TH：太湖猪；TB：藏猪；DNSE，滇南小耳猪；DR，杜洛克猪；LD，长白猪；LW，大白猪。

图5为ERE突变与ESR1结合活性的分析，其中，X轴为萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶，Y轴为实验处理，*,p<0.05；**,p<0.01。

图6为pGL4.10-[luc2]载体图谱。

图7为利用ChIP实验分析ESR1与梅山猪ERE(TH)及杜洛克ERE(DR)的结合效率。

图8为ChIP实验灰度值分析。

图9为杜洛克(DR)和梅山(TH)妊娠母猪子宫内膜BMPR1B基因mRNA表达量。

图10为杜洛克(DR)和梅山(TH)妊娠母猪子宫内膜BMPR1B蛋白表达量。

图11为杜洛克(DR)和梅山猪(TH)子宫内膜腺体数目。

图12为ESR1变异区测序结果峰图。

图13为双荧光分析SNP，其中，N1、N2、N3和N4依次为hr8:134,093,159、chr8:134,093,231、chr8:134,093,257和chr8:134,093,418，而N23是将chr8:134,093,231和chr8:134,093,257同时突变为太湖猪特有位点的区段，其余位点均为杜洛克型，*表示差异极显著(0.01＜p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。

图14为双荧光分析chr8:134,093,159，其中，TH-N1为仅突变chr8:134,093,231为太湖猪型，其余3个位点为杜洛克型，D+ESR1表明4个位点均为杜洛克型，*表示差异极显著(0.01＜p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明。所述实验材料和试剂如无特殊说明均可通过商业途径获得，所述实验方法如无特殊说明均为常规实验方法。

太湖猪初产母猪平均窝产仔数12头，经产16头左右，三胎以上可达到20头。藏猪和滇南小耳猪作为中国地方猪驯化程度较低的品种，这两个品种受人工选择程度较低，受自然选择因素影响较大，这两者均具有性成熟早、繁殖力低等特点；其中，藏猪生长缓慢，平均初产窝产仔数4头，经产5头左右；滇南小耳猪初产7头左右，经产10头左右。长白猪，其原产于丹麦，是全球范围内商品化程度较高的品种之一，其主要特点为生产发育速度较快、饲料转化率高、胴体瘦肉率高、经产母猪窝产仔数可以达到11.8头，生产中常被作为三元杂交猪的第一父本或者第一母本。杜洛克猪，原产于美国，世界著名的瘦肉型猪种之一，杜洛克猪具有适应性强、胴体品质好、瘦肉率高等特点，但其最大的劣势就是其繁殖性能较低，初产母猪窝产仔数8头，经产9头左右，生产中作为三元杂交猪的终端父本来使用。

候选基因实验所采用的样本为妊娠中期的梅山猪(属于太湖猪品种)和杜洛克的子宫内膜组织，分别采自上海、北京种猪场；基因分型使用的实验群体DNA受赠于方美英老师和张浩老师；Hela细胞购自北京肿瘤医院细胞库；宿主菌大肠杆菌Top10购自汇天东方(北京)有限公司；真核表达载体pCDH为实验室保存，双荧光素载体psiCheck2购自Promega公司。

实施例1：全基因组重测序

(一)选择二花脸猪和枫泾猪(两者都属于太湖猪品种)作为中国高繁殖力组，藏猪和滇猪作为中国低繁殖力组，杜洛克猪作为外国高繁殖力组，长白猪作为外国高繁殖力组。对不同群体间其种质特性-繁殖力存在明显差异的上述4个群体，含48个个体，进行耳组织样品采集，并提取基因组DNA。

所用动物耳组织样品分别采自北京顺新龙养殖有限责任公司、山东华盛江泉农牧产业发展有限公司、西藏林芝、云南地区。具体样品分组情况如表1所示。

表1样本分组

猪耳组织基因组DNA提取，根据天根组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)说明书进行，具体操作步骤如下：

(1)取0.5cm 3耳组织用酒精清洗，后加入PBS缓冲液，用剪刀剪碎，10,000rpm离心1min后去上清，加入200μl溶液GA，振荡；

(2)加入20μl蛋白酶K，振荡混匀，56℃水浴至组织消化完全，简短离心；

(3)加入200μl溶液GB，颠倒混匀，70℃水浴10min至溶液清亮，简短离心；

(4)加入200μl预冷的无水乙醇，充分振荡15s，简短离心；

(5)将上一步所得的溶液和絮状沉淀加入吸附柱CB3中(吸附柱套入收集管中)，5,000rpm离心3min，重复收集一次，弃收集管中液体后，将吸附柱CB3放回收集管；

(6)向吸附柱CB3中加入500μl溶液GD，12,000rpm离心1min，弃收集管中液体后，将吸附柱CB3放回收集管；

(7)向吸附柱CB3中加入700μl溶液PW，12,000rpm离心1min，弃收集管中液体后，将吸附柱CB3放回收集管；重复一次；

(8)将吸附柱CB3放入收集管，13,000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱CB3放入新的离心管中，开盖子室温放置，彻底晾干吸附柱CB3至酒精完全挥发；

(9)向吸附膜中心位置悬空滴加100μl预热的ddH 2O，室温放置5min，12,000rpm离心2min，离心管中液体即为基因组DNA，样品可于-20℃长期保存。

对提取的DNA质量和浓度检测：

(1)利用NanoDrop2000测量DNA浓度及OD值，OD 260/OD 280＝1.8-2.0，OD 260/OD230＝2.2-2.3；

(2)利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，DNA条带单一，主带明显说明DNA质量好(如图1)。

(二)测序文库构建及全基因组重测序流程

测序文库构建及其进行全基因组重测序对DNA的质量要求标准包括DNA浓度为50ng/μl，总量大于3μg，OD 260/OD 280＝1.8-2.0，琼脂糖电泳条带单一，主带明显，无降解，无蛋白及RNA污染，此时认定该DNA样品符合测序要求。

检测合格DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度为500bp的片段，经双末端修复、3’端加A尾、连接测序接头、纯化回收大小合适的DNA片段、PCR扩增步骤完成整个文库的构建。构建后的文库，使用Qubit2.0初步定量，并稀释至1ng/μl。随后使用Agilent2100Bioanalyzer对文库片段大小进行检测，片段大小符合预期后，使用qPCR对文库进行定量。多个样品DNA文库通过均一化后按照等体积进行混合。

将混合好的DNA文库，利用Illumina Hiseq 2000高通量测序平台进行双末端全基因组重测序(PE125)。文库的平均插入片段长度500bp，两端125bp进行双末端测序。重测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成，每个样本测序预计深度为12X，数据量为30G左右。

(三)数据分析流程

HiSeq2000平台测序得到的原始图像数据经base calling转换为序列数据，也就是我们获得的重测序的原始数据(raw data)。

(1)通过对数据进行质量控制，过滤掉接头信息、低质量碱基、未测出的碱基(10％N碱基)，最终得到clean data，同时对产出数据量以及数据质量加以统计。

(2)随后用BWA-MEN(version:0.7.12)(Li,2013)将质控后的clean data比对到猪参考基因组上(Sscrofa10.2)(Groenen et al.,2012)。因为在测序过程中可能会产生一些冗余的读段信息，因此利用samblaster(version:0.1.22)(Faust and Hall,2014)去除掉这些读段，并统计了重测序对于参考基因组的对比率，基因组的覆盖度及测序深度。

(3)然后在全基因组范围内寻找各种变异，主要关注SNPs(Single NucleotidePolymorphisms，单核苷酸多态性)和InDels(insertion-deletion，插入/缺失)，使用的程序为SAMTools mpileup(Li et al.,2009)和VarScan2(Version:2.3.7,--min-coverage6--min-reads2 4--min-avg-qual 20--p-value 1E-2)(Koboldt et al.,2012)两个软件相结合。对于变异的检出标准为：最小深度不小于6×，不含有N碱基，平均覆盖度不小于20×，不大于2个等位基因。

(4)遗传变异注释。采用ANNOVAR软件对检测出的变异信息进行注释，参数设置为默认值(Wang et al.,2010)。

将获得的高质量测序数据进行质控、比对之后，通过寻找变异位点，共鉴定得到大约1,300万个SNP和172万InDel，用于后续分析使用。

实施例2：选择性清除分析

选择清除分析基于的理论是以太湖猪群体为主要研究对象，寻找太湖猪基因组上受选择的基因组区段，且与其他三个群体(杜洛克、长白、滇南小耳猪和藏猪)不同的基因组区段。因此选择的两个计算统计量为杂合度(Het)和固定指数(F_ST)。计算公式如下：

混池群体杂合度(Het)：Het＝2p(1-p)，其中p为一个混池群体某一个等位基因的频率。

固定指数用于衡量两个群体间的遗传分化情况，对于一个SNP位点，F_ST的计算公式为：

其中p1和p2分别为一个等位基因在两个群体的频率。

比较太湖猪vs杜洛克猪，太湖猪vs长白猪，太湖猪vs滇南小耳猪和藏猪三个F_ST值，取三者的最小值代表太湖猪与其他三组的分化情况，定义为minF_ST。随后利用100kb滑动窗口，50kb的滑动步长，分别计算每一个窗口的Het和minF_ST，为了保证估计的准确性，要求每一个窗口不少于50个SNP。最后分别设定Het<0.02和minF _ST>0.35为筛选阈值(Carneiro etal.,2014；Ai et al.,2015；Qanbari et al.,2015)，保留下来的窗口即为潜在的太湖猪特有的受选择区段。

以太湖猪为研究对象，以Het和F_ST为度量指标，寻找太湖猪既受到选择又与其余三组表现出明显分化的基因组区域。通过设立100kb的滑动窗口，50kb的滑动步长，计算每个滑窗的Het和F_ST。以太湖猪为研究对象，分别计算太湖猪vs中国低繁殖力组、太湖猪vs外国低繁殖力组和太湖猪vs外国高繁殖力组的F_ST。对于每一滑窗来说，得到了3个F_ST值。因为要寻找的太猪湖的选择位点应与三个群体均表现出遗传分化，所以对于每一个滑窗来说取三个F_ST值的最小值(minF_ST)用于后续分析指标。经过统计分析，发现94.78％的minF_ST是由太湖猪vs中国低繁殖力组贡献的，这是因为中国低繁殖力组与太湖猪的遗传距离最近(如图2)。

采用Het-minF_ST异常值的筛选方法，保留了同时满足Het<0.02和minF_ST>0.35的基因组区域(Carneiro et al.,2014；Ai et al.,2015；Qanbari et al.,2015)，最终得到受选择基因组区域43个。随后合并了距离小于1Mb的基因组区域，最终获得39个候选区域作为太湖猪特异的选择信号(如图3)。

通过将上述39个太湖猪候选的受选择基因组区域与Animal QTL database(Hu etal.,2016)进行对比分析，结果发现有33个基因组区域与一个或者多个繁殖性状相关的QTL有重叠。其中27个区域与乳头数相关的QTL重叠，11个区域与产仔数相关的QTL重叠(3个位于6号染色体，8个位于8号染色体)。在11个与产仔数相关的区域中，位于8号染色体134.05-134.15Mb区间的选择信号，定位于已报道与产仔数显著相关的8号染色体123.3–147.4Mb的QTL区间内，距离该QTL峰(SW1551)只有1.28Mb(King et al.,2003；Hernandez et al.,2014)。通过基因注释，发现该区域的基因骨形态发生蛋白受体1B(bone morphogeneticprotein receptor type-1B，BMPR1B)，该基因是在美利奴羊中鉴定到的第一个多羔性状的主效基因(Mulsant et al.,2001；Souza et al.,2001；Wilson et al.,2001)。同时，在X染色体49–51.55Mb区间鉴定到了另外一个繁殖相关基因——骨形态发生蛋白15(bonemorphogenetic protein 15，BMP15)(Hanrahan et al.,2004；Bodin et al.,2007)。将这两个受选择区域在基因组上放大，二者均表现为在太湖猪群体杂合度较低，且这两段区域内在太湖猪与其他组别之间遗传分化程度较高。

实施例3：太湖猪正选择信号分析

高度分化的SNP很有可能是直接受到选择的靶标位点，或者是在受到直接选择的位点附近(Carneiro et al.,2014)，因此在全基因组范围内寻找太湖猪与其他组别高度分化的SNP。

等位基因频率差异，用来衡量群体与群体之间具有较大差异的位点，计算公式为：

ΔAF＝p1-p2,其中p1和p2分别为一个等位基因在两个群体的频率。

通过计算等位基因频率差异(minΔAF)，并设定minΔAF的阈值为0.75，即保留minΔAF>0.75的SNP定义为太湖猪特有的SNP。同minF_ST相同，93.62％的minΔAF值由太湖猪vs中国低繁殖力组贡献的。最终，得到了132,078个SNP太湖猪特有的SNP位点，约占SNP总数的1％，并且这些位点在太湖猪品种里面已经被固定或近似固定。

对在基因区内太湖猪特有的SNP进行分析，保留了包含大于或等于10个太湖猪特有SNP的前1,000基因进行GO富集。基因功能富集分析，利用PANTHER在线软件，使用默认参数，对太湖猪特有的基因进行功能富集分析。

GO富集分析显著富集到了与形态形成相关的条目，例如发育过程(developmentalprocess)，结构发育以及结构形态发生(anatomical structure development,anatomicalstructure morphogenesis)等条目。在这些GO条目中，鉴定到了在发育过程中关键的信号通路，包括TGF-β/smad信号通路(BMPR1B,BMP6,BMP7,SMAD9和BMPR2)和Wnt/β-catenin(WNT7B,CDH12和CSNK1E)。可以看出太湖猪受到正选择的位点主要是参与形态发育过程的基因。在前人发表的太湖猪的研究中，已经证实太湖猪妊娠期间的卵巢和子宫的形态表现出明显的差异(Christenson et al.,1997)。

实施例4：太湖猪高繁殖力候选基因——BMPR1B基因

(1)由于BMPR1B基因在绵羊中已经被证实为高繁殖力性状的主效基因，是由基因编码区的突变(FecB)引起的(Mulsant et al.,2001；Souza et al.,2001；Wilson et al.,2001)。BMPR1B基因编码区并没有太湖猪特有的SNP。进一步缩小范围，与minF_ST峰重合的基因组区域为chr8：134,092,836–134,094,077，大约1.2kb，位于BMPR1B基因的第一内含子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该区域呈现太湖猪特有的单倍型。在这个区域内共有19个SNP，其中有18个SNP在太湖猪与其他对照组呈现显著的基因型频率差异。将猪基因组与人基因组进行同源比对分析，发现这1.2kb单倍型同源比对到人类4号染色体的长臂。基于多物种比对分析，发现这1.2kb的单倍型只是在哺乳动物中保守存在的，而在卵生动物中(例如鸟类、两栖动物、鱼类)是不存在的。基于人类基因组的注释信息，我们发现与猪1.2kb的单倍型直系同源的人类基因组区段存在一个保守的ESR1(雌激素受体1)结合区，其中含有雌激素应答元件(Estrogen response element，ERE)，而在猪的这个区间内，太湖猪只有4个特有的SNP(如表2)。

表2 ESR1结合区太湖猪特有SNP的分布信息

(2)筛选出来的候选功能基因，利用PCR技术，针对特定的突变位点，扩大检测群体规模，重复验证突变的准确性。

通过对位于8号染色体的12个SNP位点，采用6个品种(杜洛克、大白、长白、滇南小耳猪、藏猪、二花脸猪)的176个个体，每个品种30个个体左右，进行PCR测序和限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测。RFLP引物设计使用dCAPS Finder 2.0软件进行引物及酶切位点的设计(Neffet al.,2002)。

检测引物序列及酶切位点如表3所示。

表3 PCR及RFLP引物

PCR反应体系如表4：

表4 PCR反应体系

PCR反应的运行参数为：95℃5min；95℃30s，退火60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

对扩增得到的PCR产物进行琼脂糖检测，对扩增良好的PCR产物在恒温培养箱中37℃酶切过夜，酶切体系见表5。

表5酶切反应体系

酶切产物进行4％琼脂糖凝胶电泳检测。随机选择了10个SNP，均在太湖猪呈现不同的基因型及基因频率(如图4)。

实施例5：BMPR1B基因内含子I的突变对猪高繁殖性状的遗传效应分析

根据重测序的分析结果显示，候选突变位点位于BMPR1B基因的第一内含子。由于是基因的非编码区，并不影响最终的蛋白表达，所以主要从基因调控角度入手进行其进一步的功能分析。

为了验证ESR1与ERE结合的作用，利用荧光素报告酶系统进行相关的实验。在此前检测的1.2kb的单倍型的分析中，其中的18个SNP处于完全连锁的状态。为避免由于主观推断导致假阴性结果，将1.2kb每两个距离不小于200bp的保守的SNP群划分成一段，最终从太湖猪特有的单倍型中找到2段保守区，分别命名为T2(chr8:134,093,059-134,093,518)和T3(chr8:134,093,778-134,094,177)。其中T2为突变的ERE元件区。将太湖猪T2、T3与杜洛克猪T2、T3分别连接到pGL4.10载体上(TH-T2/DR-T2(TH-ERE/DR-ERE)、TH-T3/DR-T3)。同时，由于太湖猪ESR1基因与杜洛克ESR1基因编码区不存在突变，我们克隆猪ESR1基因，并连接到pCDH表达载体上。将连接好的双荧光报告载体分别与pCDH-ESR1重组载体共转染到Hela细胞中，在此过程中一直使用10nM的雌激素处理细胞。

1、猪ESR1基因克隆及表达载体构建

(1)PCR扩增克隆猪ESR1基因

基于NCBI网站上公布的猪ESR1基因的序列(Accession：NM_214220.1)，利用primer5软件设计引物克隆猪ESR1基因的编码区，以猪子宫内膜DNA为模版，使用高保真酶进行扩增。先使用ESR1-clone引物进行扩增，测序完成后，以ESR1引物添加酶切位点。扩增引物及添加酶切位点引物如表6，引物序列中斜体加下划线部分即酶切位点序列，扩增反应体系与扩增程序同实施例4。

表6猪ESR1基因克隆引物信息

(2)PCR产物切胶回收

通过PCR扩增，EcoRI和BamHI酶切位点被成功引入。对PCR产物进行切胶回收，目的是为了在连接载体之前去除PCR产物中的杂质(剩余的引物或者DNA模版)。采用的是OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。具体操作步骤如下：

①PCR扩增产物50μl全部点入点样孔，90V恒压电泳40min；

②切胶：取出1.5ml离心管，称重去皮，切下含有目的条带的琼脂糖胶块放入1.5ml离心管中，称重；

③溶胶：以每1g胶加入3ml溶胶液的比例，加入溶胶液XP2，置于50℃水浴10min，待胶完全溶解，放置于冰上，使溶胶液温度降至室温；

④上柱：将上步骤溶胶液添加到吸附柱上，静置2min，5,000rpm离心3min；再把收集管液体倒回柱子上，重复过柱一次，倒掉收集管中液体；

⑤漂洗：向吸附柱加入700μl洗涤液PW，12,000rpm离心1min；重复一次；

⑥空离柱子，13,000rpm离心2min，去除剩余漂洗液；

⑦将吸附柱放入新的1.5ml离心管，开盖，使剩余酒精充分挥发后，向吸附柱中央加30μl预热的ddH 2O，室温静置2min，12,000rpm离心2min；

⑧取1μl回收样品，用Nanodrop2000检测回收DNA的浓度及质量。

(3)PCR回收产物及载体的双酶切

回收PCR产物1μg，pCDH载体1μg，利用EcoRI和BamHI进行双酶切反应，反应体系及反应条件同表4。酶切后产物用琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收pCDH载体和回收PCR产物酶切片段，回收步骤同上。

(4)连接

将回收后的双酶切产物，按照表7的反应体系进行连接反应，条件为16℃连接过夜。

表7连接反应体系

(5)转化

①取15μl连接产物直接加入50μl冰上解冻的大肠杆菌Top10感受态细胞，轻弹管底，使其混匀，冰浴30min；

②42℃水浴热激90s，立即冰浴5min；

③加700μl无抗LB培养基，37℃摇床，>200r/min摇1h；

④2,000rpm离心5min，用枪头吸掉600μl上清，用剩余液体将离心到管底的感受态细胞吹匀，吸出100μl，加至Amp的LB平板上，并涂抹至均匀，即涂布器在平板上稍微发涩即可停止；

⑤37℃恒温培养箱培养12h，待后续挑取单克隆鉴定重组质粒。

(6)重组质粒目的片段鉴定

从上一步骤得到的平板上，挑取10个单克隆，在Amp的LB平板进行划线培养，培养至12h，挑取部分菌体做菌体PCR，反应程序及反应体系同表3，鉴定引物为pCDH载体通用引物。鉴定正确的单克隆，接种到5ml含Amp的液体培养基中，取2ml菌液送测序(北京六合华大基因科技有限公司)，剩余菌液待测序结果正确后接种到200ml含Amp的液体培养基中，用于后续质粒的中提。

2、pGL4.10载体构建

内含子调控区活性检测部分采用pGL4.10-[luc2]载体为基础载体(如图6所示)，载体构建过程与上述相同。根据实验目的，需要将内含子调控区片段插入载体9-66bp范围内。BMPR1B基因内含子调控区按照每个两个SNP距离不小于200bp，划分为2个区段，分别为T2(134,093,447-134,093,103)和T3(134,094,164-134,093,856)。根据实验需求，利用各自特异性引物(表8)构建了2个载体，分别是pGL4.10-T2和pGL4.10-T3。

表8猪BMPR1B基因内含子调控区重组载体构建引物信息

3、重组质粒的中量提取

pCDH-ESR1、pGL4.10-T2和pGL4.10-T3构建完成后，利用测序结果与基因组序列比对，序列正确无突变后，进行质粒的中量提取以用于后续转染实验，保证质粒内毒素去除干净，我们使用的是Qiagen Midi Plasmid Kit，具体操作步骤如下：

(1)相应菌液加入200ml含Amp的LB培养基中，37℃摇床，>200r/min，过夜；

(2)4℃，10,000rpm离心15min收集菌体，多次收集，直至将200ml菌液全部收集完；

(3)加入4ml溶液P1(已提前加入RNA酶和裂解蓝试)，枪头反复吹打至菌体完全悬浮；

(4)加入4ml溶液P2(37℃预热)，轻轻颠倒离心管至形成均一的蓝色悬液，室温静置4-5min，不能超过5min，否则会有菌体DNA污染；

(5)加入4ml预冷的溶液P3，立即颠倒混匀直至形成无色溶液，此时有白色沉淀，冰上放置15-20min；

(6)样品混匀后，4℃，15,000rpm离心30min，将上清液吸取至新的离心管；重复一次；

(7)向Qiagen-tip100吸附柱上加入4mlQBT缓冲液平衡吸附柱，使缓冲液在重力作用下过柱子；

(8)将步骤6获得的上清液加入平衡好的吸附柱上，使其在重力作用下通过吸附膜；

(9)上清液全部过完吸附柱后，向吸附柱中加入10ml缓冲液QC洗柱子，洗2遍；

(10)将吸附柱转移至新管，加入5ml缓冲液QF，此时收集DNA洗脱液；

(11)加入3.5ml异丙醇沉淀DNA，混匀后，4℃，15,000rpm离心15min，弃上清；

(12)加入2ml 70％乙醇冲洗DNA沉淀，4℃，15,000rpm离心15min，弃上清；

(13)在空气中晾干沉淀15min，至乙醇完全挥发，加入100-200μl ddH 2O溶解DNA；

(14)取1μl质粒NanoDrop检测浓度，1μl质粒用1％琼脂糖电泳检测，其余于-20℃保存。

4、细胞转染

(1)10cm细胞培养皿汇合度达90％的Hela细胞，消化离心后，用1ml DMEM培养液将该皿所收集的细胞，吹打成细胞悬液，取320-350μl细胞悬液加入9.7ml的完全培养基中(DMEM+10％FBS)，充分吹匀，接种到顶底透明白色壁的96孔细胞培养板，培养16-20h左右，待细胞汇合度大于70％时进行转染，转染前1小时换成Opti-MEM培养基；

(2)稀释质粒，将pCDH-ESR1、pCDH空载、pGL4.10-T2、pGL4.10-T3稀释成100ng/μl和pRL-TK稀释成10ng/μl，待用；

(3)配制DNA/脂质体复合物，如表9所示，根据需要转染的处理数，将脂质体溶液配制好，室温静置5min；质粒溶液根据实验处理，按照表9配制好，充分混匀并短暂离心；吸取与质粒溶液等体积的脂质体溶液加入质粒溶液中，温柔地混匀，室温下静置20min，形成DNA/脂质体复合物；

表9 96孔板转染体系

(4)向每孔细胞中滴加混合好的质粒DNA/脂质体复合物，做好每个孔的标记，将培养板前后轻轻晃动混匀，37℃、5％CO₂、100％湿度培养4-6h；

(5)培养4h后，将培养液更换为完全培养基；

(6)继续培养，36h后检测荧光强度。

5、Dual-Glo双荧光素酶活性检测：

(1)从培养箱中取出细胞培养板，吸掉培养液上清，向每个孔中加入75μl PBS溶液。

(2)向每个孔中加入75μl Dual-Glo Luciferase Reagent，混匀。等待10分钟，让细胞充分裂解，然后在酶标仪中测量萤火虫荧光。

(3)连续测两次之后，向每孔中加入75μl Dual-Glo Stop&Reagent，混匀。等待10分钟，然后测量海肾荧光，重复测两次。

(4)通过计算萤火虫荧光/海肾荧光得到每一个处理的活性值。

转染结果显示，T3段突变对ESR1结合ERE的能力没有显著差异。如图5所示，只有ERE元件区(chr8:134,093,059-134,093,518)在太湖猪组和杜洛克组差异不大，并且添加ESR1与不添加ESR1组，在太湖猪组与杜洛克组均有差异，说明ERE的活性必须在ESR1存在的条件下才能被激活，且太湖猪ERE结合ESR1后的活性显著高于杜洛克猪。推测太湖猪的ERE可以显著提高与ESR1的结合后的转录活性，进而上调BMPRIB基因的转录。

实施例6：ERE与ESR1在动物体内的结合效率

通过染色质免疫共沉淀实验(ChIP)比较梅山猪(属于太湖猪品种)和杜洛克猪子宫内膜组ERE与ESR1的结合情况。

本实验使用EpiQuik tissue Chromatin Immunoprecipitation Kit(P-2003)完成，实验材料为梅山母猪和杜洛克母猪妊娠中期的子宫内膜组织。

(1)样品准备

①取子宫内膜组织置于预冷的PBS中，用剪刀剪碎至1-2mm；

②将剪碎的组织块转移至15ml离心管中，加入10ml PBS，每40mg组织加入1ml固定液，上下颠倒混匀，使DNA和组蛋白交联，37℃交联15-20min(摇床上轻摇)；

③加入1ml 1.25M甘氨酸溶液，上下颠倒混匀，800rpm离心5min，弃掉上清液，加入10ml预冷的PBS洗细胞一次，800rpm离心5min，弃上清；

④将组织碎片转移到匀浆器中，加入1ml匀浆液，碾磨10-20下；

⑤将匀浆后的细胞悬液转移到2ml离心管中，4℃，5,000rpm离心5min，弃上清。

(2)细胞裂解及超声

①每20mg组织加入100μlCP3(提前加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞，冰上孵育10min，每隔2min左右涡旋振荡一次；

②超声，功率～50W，超声15-20s，冰上放置30-40s，反复8次，电泳检测，DNA主峰应该在200-1,000bp；

③加入0.1体积10％Triton-X，混匀，4℃，14,000rpm离心10min。

(3)染色质免疫共沉淀

①超声合格样品，转移上清液至新的1.5ml离心管，按体积比1：1加入CP4溶液稀释DNA；

②吸取20μl样品作为“input”置于冰上，余下样品用于后续实验；

③准备Strip wells：根据实验设计计算好需要的Strip well的数量，每个孔加入120μl CP1清洗一次，然后每个孔加入100μlCP2，然后一部分孔加入3μl ESR1抗体，一部分加入1μl鼠IgG抗体作为阴性对照，一部分孔加1μl RNA聚合酶II抗体作为阳性对照；用封口膜封上样品孔，室温孵育90min；吸取孔内的抗体溶液，每个孔加入120μl CP2洗样品孔，每个孔洗3次，待用；

④向每个准备好的样品孔中加入100μl步骤②的样品，用封口膜封好后，室温孵育90min(摇床上轻轻摇晃)；

⑤移去上清液，加入150μl CP1清洗样品孔6次，每次2min，至于摇床上轻摇，然后用1×TE 150μl清洗样品孔一次，每次2min；

(4)反交联及ChIP DNA纯化

①每个样品(所有样品孔以及“input”样品)加入40μl CP5(已经提前加入1μl蛋白酶K)，混匀，用样品空盖盖上样品孔后，65℃水浴15min；

②加入40μl CP6，混匀，重新盖上盖子，65℃水浴90min；同样在“input”样品中加入40μl CP6，混匀，65℃孵育90min；

③加入150μl CP7，混匀，将所有样品转移至吸附柱，5,000rpm离心2min；

④吸取200μl 70％酒精加入吸附柱，12,000rpm离心15s，弃收集管中液体；

⑤吸取200μl90％酒精加入吸附柱，12,000rpm离心20s，弃收集管中液体；

⑥吸取200μl90％酒精加入吸附柱，12,000rpm离心35s，弃收集管中液体；

⑦将吸附柱转移至新的1.5ml离心管，室温开盖晾干酒精；

⑧向吸附柱中央吸附膜悬空滴加20μl预热的CP8溶液，静置2min，12,000rpm离心20s得到ChIP DNA溶液，可于-20℃保存。

(5)PCR检测ESR1结合序列

PCR反应条件，反应体系同表3所示，所用引物如下表10所示。

表10染色质免疫共沉淀PCR引物

试验结果如图7和8。图7为利用ChIP实验分析ESR1与梅山猪ERE(TH)及杜洛克ERE(DR)的结合效率，图8为ChIP实验灰度值分析。通过对条带灰度值进行分析，梅山猪的ERE元件与ESR1的结合效率显著高于杜洛克猪，说明在动物体内，太湖猪特有的单倍型的ERE元件对ESR1的结合效率相比于其他猪种也是显著提高的。

实施例7：BMPR1B基因的表达分析

通过双荧光以及ChIP实验结果显示，ERE突变会影响其与ESR1结合后的转录活性。因为ERE位于BMPR1B基因的第一内含子，因此推测ERE可能影响BMPR1B基因的表达。采用qPCR和western blot分别检测了梅山猪和杜洛克猪两个品种妊娠中期母猪子宫内膜中BMPR1B基因的mRNA和蛋白的表达情况。

1、组织总RNA提取

(1)实验所用枪头、离心管等为Axygen去RNA酶枪头和离心管；

(2)取-80℃冻存的组织，每30-50mg组织加入1ml TRIzol，经液氮研磨，样品体积一般不要超过TRIzol体积的10％；

(3)振荡仪剧烈振荡，冰上放置5min，使核蛋白复合物充分分离；

(4)每1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min左右至样品略有分层；

(5)4℃，12,000rpm离心15分钟，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新的离心管中；将上层水相转移至新离心管(约占TRIzol体积的60％)；

(6)向离心管中缓慢加入0.5倍上清体积预冷的无水乙醇(约0.3ml)，并上下颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转移至吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，5,000rpm离心5min，弃收集管废液，将吸附柱放回收集管中；

(7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(8)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀(天根试剂盒提供，DNase I储存液提前分装至200μl离心管)；

(9)向吸附柱CR3中央滴加80μl的DNase I工作液，室温放置15min；

(10)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(11)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；重复一次；

(12)13,000rpm离心2min，空离心，以去除残余的漂洗液。将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，置于冰上开盖放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(13)向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl RNase-Free ddH 2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液，于-80℃保存。

RNA质量和浓度检测：取1μl RNA，利用NanoDrop 2000检测RNA浓度及OD值，OD260/OD 280＝1.8-2.0，OD 260/OD 230在2.3左右；RNA的完整性通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，当RNA无明显降解时28s和18s条带清晰可见，无拖尾现象，有少量的5s条带。

2、Quantitative PCR反应

(1)cDNA合成

根据天根反转录试剂盒步骤，取200μl离心管，按下表依次加入下列溶液：

①基因组DNA的去除

按照表4-11的体系配制混合液，彻底混匀，简短离心，并置于42℃，孵育3min，然后置于冰上。

表11 gDNA去除反应体系

②反转录反应

按照表12的反转录反应体系配制混合液，将反转录反应中的混合液，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min；95℃，孵育3min后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或于-20℃保存。

表12 cDNA的合成

(2)荧光定量PCR反应(qPCR)

以NCBI上公布的猪BMPR1B和GAPDH基因的mRNA序列模板，设计目的基因和参照基因的引物。为了避免cDNA中在残留的基因组DNA，扩增引物设计时通常跨内含子设计。定量引物序列如表13。

表13实时荧光定量PCR引物

实时定量PCR的反应体系如表14。

表14 qPCR反应体系

实时定量PCR的扩增程序如表15。

表15 qPCR扩增程序

图9为杜洛克(DR)和梅山(TH)妊娠母猪子宫内膜BMPR1B基因mRNA表达量。

3、Western Blot免疫印记

(1)猪子宫内膜组织蛋白提取：

①在1.5ml离心管中计入600μl组织蛋白抽提试剂，10μlPMSF，置于冰上待用；

②取猪子宫内膜组织，液氮研磨组织，加入上述离心管中；

③涡旋振荡混匀后，冰上孵育6h，4℃，12,000rpm离心40min；

④吸取上清至新管，准备蛋白定量分析，后续放于-80℃保存。

(2)蛋白定量

本实验使用的是BCA Protein Assay Kit(Novagen)对蛋白进行定量。

①配制标准BSA溶液用于制作标准曲线，如表16；

表16 BSA标准溶液配制

注：BSA原液浓度为2μg/μl

②配制工作液，试剂A：试剂B＝49：1；

③取酶标板，每孔加入200μl工作液；

④按顺序向每个孔中加入20μl标准溶液A-H和待测样品，每个样品3个技术重复；

⑤将加好样品的酶标板，放入酶标仪，设定程序为：shaking 30s，37℃孵育30min，shaking30s，562nm测吸收光。

(3)Western Blot

①SDS-PAGE电泳：配制10％的分离胶和4％的浓缩胶的SDS-PAGE胶，按每孔20μg蛋白上样，上样前样品99℃变性10min；先60V电泳50min，再90V电泳2h，至溴酚蓝跑到胶板底部即可；

②转膜：PVDF膜置于甲醇浸泡10min，ddH₂O清洗3次，连同滤纸、海绵一起在转膜液中浸泡，待用；按负极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-正极海绵的顺序制作转膜夹板，并在此过程中用玻璃棒擀出气泡；设定转膜条件为60V恒压转膜2h，在槽放入冰盒中，并在槽的两边放置冰袋，以免电转时过热影响转膜效果；

③封闭：取出PVDF膜，将膜置于自封袋中，加入5ml封闭液，封口，4℃封闭过夜封闭过夜；

④一抗孵育：将一抗用一抗稀释液按照1:1000稀释，将封闭好的PVDF膜转移到新的自封袋，37℃，摇床，孵育1h；孵育完成后，用TBST洗膜5次，每次5min；

⑤二抗孵育：同样的方法稀释二抗、孵育二抗、清洗二抗；

⑥显色：使用化学发光试剂盒SuperSignal West Pico kit，按照说明书进行显色操作。在暗室中压片曝光约30s-5min，然后进行胶片显影，定影清洗后照相。

图10为杜洛克(DR)和梅山(TH)妊娠母猪子宫内膜BMPR1B蛋白表达量。从mRNA和蛋白的表达水平可以看出，太湖猪(梅山)妊娠期子宫内膜中BMPR1B基因的表达水平均显著高于同时期杜洛克猪的表达量。

实施例8：BMPR1B基因对子宫发育表型的影响

在本发明中，猪BMPR1B基因编码区并未存在突变，而是太湖猪非编码区第一内含子的突变影响BMPR1B基因的表达水平，这可能是影响猪繁殖力的关键。在前人发表的关于BMPR1B基因敲除鼠的研究结果显示，缺失BMPR1B基因小鼠表现不孕并且子宫内膜腺不发育。因此，为进一步验证BMPR1B基因对繁殖力的贡献，本发明中比较了杜洛克和梅山猪妊娠母猪子宫内膜腺体的发育情况。

1、冰冻切片

实验材料准备：收集梅山母猪和杜洛克母猪妊娠中期子宫内膜组织。

(1)固定，将相应的子宫内膜组织置于20倍体积的4％PFA中，固定时间随组织大小决定，一般4℃过夜；

(2)沉降：使用PBS配制的30％蔗糖溶液，放入组织块，4℃沉降过夜；

(3)包埋：使用OCT包埋剂包埋组织，液氮速冻，以防止形成冰晶；

(4)切片：预冷切片机，使用-20℃冰冻切片将包埋好的组织按照10-20μm厚度切片，用载玻片贴片，贴片后放置于干燥的染色缸内，室温风干30min或置于-80℃中保存；

(5)后固定：使用4％PFA(4℃提前预冷)将切片室温后固定10min，使用PBS清洗3次，每次5min；

(6)苏木精染色：使用一定量的苏木精染色3min，随后用自来水冲洗多余的苏木精；

(7)分色：1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色，在显微镜下观察控制分色程度，直至细胞质和细胞核染色清晰为止，使用蒸馏水冲洗多余的分色液；

(8)伊红染色：将切片放于梯度酒精(50％、70％、85％、95％)脱水至95％酒精，每级5min。随后使用一定量的伊红染色10s。再经95％酒精、100％酒精脱水，每级5min；

(9)使用二甲苯透明两次，每次5min；

(10)最后使用中性树胶封片。

从两个品种子宫内膜腺体的发育情况可以看出，梅山猪的子宫内膜腺体数目显著高于杜洛克猪。我们在50倍显微镜下，每个品种每个个体选择了15个视野，对子宫内膜腺体的数量进行了比较。结果显示梅山猪子宫内膜腺体的数目(74.77±8.29个/视野)极显著高于杜洛克(33.18±15.68个/视野)(图11)。

实施例:9：BMRP1B基因ESR1变异区SNP的确定

确定了太湖猪的ESR1变异区(chr8:134,093,059-134,093,518)为太湖猪ERE与ESR1结合的功能区，我们对位于ESR1变异区的4个SNP进行了测序(如图12)。从图中可以看到，太湖猪表现为太湖特有的纯合位点，杜洛克在这4个位点上均为纯合但是基因型与太湖猪正好相反，而姜曲海猪则为杂合介于二者之间。

为确定具体作用的SNP位点，将杜洛克猪的这个4个SNP依次突变为太湖猪特有的位点，分别为chr8:134,093,159、chr8:134,093,231、chr8:134,093,257和chr8:134,093,418，将这些SNP分别与pGL4.10载体构建质粒，在Hela细胞中进行转染。图13中可以看到将构建好的质粒全部进行转染(太湖猪和杜洛克猪均为3个生物学重复)，双荧光的结果显示只有单独突变的太湖猪的chr8:134,093,159相比较杜洛克猪是有极显著差异的，而其它位点的结果并没有显著差异。说明在太湖猪的chr8:134,093,159位点为影响ESR1与ERE结合的SNP突变，导致了双荧光的结果有所差异。在相同条件下单独对chr8:134,093,159进行的相同的转染和双荧光的实验中，图14中可以看到太湖猪的chr8:134,093,159与ESR1结合的能力是极显著高于杜洛克猪与ESR1的结合能力。所以，确定太湖猪的chr8:134,093,159位点为导致ESR1的产物ERα与BMPR1B基因第一内含子内的ERE结合产生差异的突变位点。

实施例10：高繁殖性能猪的鉴定或检测方法

高繁殖性能猪的鉴定或检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测猪中的基因组DNA；

(2)以上述基因组DNA为模版，利用下述引物对进行PCR扩增，PCR扩增程序同实施例4；

F(5’-3’):TAAGAGCTCAACCGACCTGCGTTTTCTTTTC，

R(5’-3’):TAAGATATCTCTTCCCTTCCTACCACCCTCCT

(3)检测上述PCR扩增产物，如果扩增序列对应的8号染色体第134,093,159位的碱基为G，且基因型为GG时，表明待测猪属于高繁殖性能猪。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种与猪高繁殖性状相关的基因和SNP分子标记及应用

<130> 2018

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1239

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

tcttttcttt tttctttcta atttcacaaa tttggaaaac acgttttaag ttccaagcta 60

atccagagca gccgagtgtt tctcccataa gcagaaattg aaattggcct tctctgaaag 120

aaatgttctc tattcagtgc tctggaactg ggtttccttg ctgtgctctt gctggggtct 180

cacttgacct caggcaaaat gtcttggtgt gtttccattc atgtagcatg gccatctgag 240

aaccaccagt ggaggcaaaa ggtccatgga aggtattaat ctgcagaaaa gtgagcatgg 300

tgcagagaag ctagcgccgt gtggcacagt cagaaatggg taacaacatc aagtgggctg 360

aggagcagga ctgagtcctc cagtgaaacg tgttactcaa gataaacagt ccggcggtgt 420

tgtctttggc aattcttgag aaccttgtca tgttaatgta gttattgaaa ttgaatttgg 480

aaattgtaat gtggctctca tatttccctt aaaaacagtg ctgctaactc ccaccttgaa 540

agggatcaca tgtatctcat aagctgggca ctgctaatat tttagtaacc ccacaagaag 600

gatagtgaaa tgaaatactg tgaaaacaca accgacctgc gttttctttt cccggcttgc 660

ttgcagtgag atgcataatg taaaaataac ccactaccaa gttctctttg caaatgcacc 720

aatggtaccc attgtgtgtc agagatcacc ctgggtctct gtgaccttgg caacatttca 780

ggggttatat tttcacatgg atcaactttt ctccaatgta ttggcacaga ccagcttgtc 840

ttgaatagta agcatttata cctttttttc ccacctattt ttcctcctca caaaatttag 900

cttgtatggt cttagaaaaa agggagagag aaagaagagg gaaagggagg gaggagggtg 960

gtaggaaggg aagaggggag agaagcaaga ggagagagag agagagaaag acaggagccc 1020

cgatgtagaa gtttccactt agtgtcaggc cagtattgtc ataactgctt tttagttcat 1080

gtctttcccc tttttaaatt taaaagatgg gctctttcag gatttttctt ttgagaatag 1140

tttatgtggc ttattgcctt cacaagaatg gttcaaaaga tacttatgaa gaaggatgtg 1200

cattttcctt gacatttctc ttgattgttt ttcatatag 1239

Claims (7)

1.一种与猪高繁殖性状相关的基因，其特征在于，所述基因为BMPR1B基因，位于猪的8号染色体上，与猪高繁殖性状相关的功能区域位于BMPR1B基因的第一个内含子，该功能区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种与猪高繁殖性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于猪8号染色体第134,093,159位，此处碱基为G。

3.权利要求2所述的SNP分子标记在鉴定或检测高繁殖性能猪中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当8号染色体第134,093,159位的碱基为G，且基因型表现为GG时，表明待测猪属于高繁殖性能猪。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述SNP分子标记通过如下引物对获得：

F(5’-3’):TAAGAGCTCAACCGACCTGCGTTTTCTTTTC，

R(5’-3’):TAAGATATCTCTTCCCTTCCTACCACCCTCCT。

6.权利要求2所述的SNP分子标记在高繁殖性能猪育种中的应用。

7.一种高繁殖性能猪的鉴定或检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测猪中的基因组DNA；

(2)以上述基因组DNA为模版，利用权利要求5所述引物对进行PCR扩增；

(3)检测上述PCR扩增产物，如果扩增序列对应的8号染色体第134,093,159位的碱基为G，且基因型为GG时，表明待测猪属于高繁殖性能猪。