CN109295238A - 东乡绿壳蛋鸡基因组snp分子标记的筛选方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及遗传学领域，具体而言，提供了一种东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法及其应用。该筛选方法包括：通过高通量测序检测，然后计算遗传统计量，再分析东乡绿壳蛋鸡与其他鸡种群体的遗传差异，最后筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记。该筛选方法具有高效快速筛选出东乡绿壳蛋鸡分子标记的技术效果，筛选得到东乡绿壳蛋鸡的受选择基因作为鉴定东乡绿壳蛋鸡种质的分子标记，成本低，数据量丰富，检测精度高，缓解了目前东乡绿壳蛋鸡遗传分化鉴定中缺少高效的分子生物学方法和遗传标记导致的遗传分化研究成本高精确度低的技术问题，其应用缓解了东乡绿壳蛋鸡的遗传分化研究中缺少高效的分子生物学标记的技术问题。

Description

东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及遗传学领域，具体而言，涉及一种东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法及其应用。
背景技术
东乡绿壳蛋鸡(Dongxiang Blue-Eggshell Chicken)，属蛋用型品种，2001年被《江西畜禽品种志》收录，2004年被列入中国畜禽遗传资源名录，2014年被列入国家级畜禽遗传资源名录。东乡绿壳蛋鸡饲养历史悠久，在长期的选择和驯化过程中形成了与其它地方鸡品种截然不同的的蛋壳颜色特征，蛋品质量好，具有较强的抗逆性，是我国家禽库极其宝贵的遗传资源，也是目前市场上开发利用较好的地方鸡种资源。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入形成的遗传标记，具有数量大、多态性丰富和遗传稳定的优点。虽然从理论上来看SNP位点可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2:1。
全基因组关联分析(genome-wide association analysis，GWAS)是指在全基因组范围内，利用高通量测序技术，找出存在的序列变异，即SNP进行分型，并利用生物信息学的方法，从中筛选出与复杂疾病或者可测形状的SNP位点的方法，是当前用于功能基因发掘的最常用手段，然而，其仅针对单个性状，且需要建立分离群体，并不适于品种特性的全面评价。
自然选择和人工选择作用会在动物基因组上留下选择信号(selection signal)，对这些选择信号进行分析是发掘品种特性功能基因的最有效技术手段，通过多种不同类型品种基因组的比较，可在全基因组水平上对单个品种资源的特性有充分、全面的认识。
品种资源的保护目标是尽可能地保持品种的特征、特性不丢失，因此开展品种资源保护的前提是充分认识品种的特征特性。目前，微卫星标记及线粒体DNA序列变异已被广泛应用于地方鸡种(包括东乡绿壳蛋鸡)的遗传多样性、遗传结构及起源分析，然而这些DNA标记在整个鸡基因组中的覆盖范围是极其微小的，如鸡微卫星标记仅有约30个，鸡线粒体DNA的D-loop区域全长也仅约1200bp，其所代表的基因组遗传变异信息量非常有限。现阶段，东乡绿壳蛋鸡保种效果的评价主要依赖于常规表型性状记录、系谱记录和低密度DNA分子标记信息，通量低，精确度差，不能客观的评价东乡绿壳蛋鸡保种效果如何；也限制了东乡绿壳蛋鸡品种资源的开发利用。因此，快速高效低成本的筛选出能够评价东乡绿壳蛋鸡遗传多样性的分子标记是目前有待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供了一种东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法，缓解了现有技术中由于缺少能够评价东乡绿壳蛋鸡遗传多样性的分子标记导致的对东乡绿壳蛋鸡遗传分化研究成本高精确度低的技术问题。
本发明的第二目的在于提供了东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的应用，缓解了现有技术中存在的东乡绿壳蛋鸡的遗传分化研究缺少分子生物学标记的技术问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法，包括：通过高通量测序检测，然后计算遗传统计量，再分析东乡绿壳蛋鸡与其他鸡种群体的遗传差异，最后筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记。
优选地，所述的高通量测序采用简化基因组测序方法，优选采用RAD-seq。
优选地，所述的RAD-seq测序样本采用ddRAD建库方式构建pair-end文库；
优选地，所述文库长度范围在300-500bp。
优选地，所述高通量测序检测的质控条件为：Q20>95％、ddRAD depth>60％、在所有鸡种群体中的SNP Call rate>70％、在单个鸡种中SNP Call rate>90％和MAF>0.05。
优选地，所述计算遗传统计量包括观察杂合度Ho值、核苷酸多样度Pi值、近交系数Fis值、群体分化系数Fst值、平均基因流Nm和群体θπ值。
优选地，所述分析方法包括连锁不平衡分析、群体聚类分析、选择消除分析和基因功能富集分析。
优选地，所述基因功能富集分析是基于GO和KEGG的富集分析方法。
优选地，所述其他鸡种群体包括：文昌鸡、大围山微型鸡、藏鸡、安义瓦灰鸡、河南斗鸡、固始鸡、仙居鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、边鸡、狼山鸡、白耳黄鸡、瓢鸡、惠阳胡须鸡、金湖乌凤鸡、茶花鸡、大骨鸡、北京油鸡、隐性白羽肉鸡和安卡红鸡。
优选地，筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记主要富集的生物学通路包括：离子及碳酸盐转运生物学通路、适应性免疫生物学通路和昼夜节律调节生物学通路。
本发明还提供了上述筛选方法在如下a)-e)中的一种或多种的应用：a)家系管理；b)个体识别；c)遗传多态性位点分析；d)种质资源鉴定；e)新品系选育。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法包括：通过高通量测序检测，然后计算遗传统计量，再分析东乡绿壳蛋鸡与其他鸡种群体的遗传差异，最后筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记。该方法可对东乡绿壳蛋鸡进行全面有效的种质分析，筛选得到东乡绿壳蛋鸡的受选择基因作为鉴定东乡绿壳蛋鸡种质的分子标记，成本低，数据量丰富，检测精度高，为后续的东乡绿壳蛋鸡的种质特性评价、品种资源保护及开发利用提供科学依据。并且利用品种特异性的分子标记来开展鸡种资源遗传进化研究和评价这一品种的保护状况，而不受常规的形态学标记手段及环境因素的影响，也便于对东乡绿壳蛋鸡这一宝贵的品种资源进行开发利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的东乡绿壳蛋鸡SNP在染色体上的分布图；
图2为本发明实施例1提供的东乡绿壳蛋鸡和其它品种LD随距离增长的衰减图；
图3为本发明实施例1提供的东乡绿壳蛋鸡及其他鸡种聚类图；
图4为本发明实施例1提供的东乡绿壳蛋鸡受选择的基因GO注释分类统计图；
图5为本发明实施例1提供的东乡绿壳蛋鸡受选择基因的KEGG通路注释统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供了一种东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法，包括：通过高通量测序检测，然后计算遗传统计量，再分析东乡绿壳蛋鸡与其他鸡种群体的遗传差异，最后筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记。
该方法可对东乡绿壳蛋鸡进行全面有效的种质分析，筛选得到东乡绿壳蛋鸡的受选择基因作为鉴定东乡绿壳蛋鸡种质的分子标记，成本低，数据量丰富，检测精度高，为后续的东乡绿壳蛋鸡的种质特性评价、品种资源保护及开发利用提供科学依据。
在一些可选的实施方式中，所述的高通量测序采用简化基因组测序方法，优选采用RAD-seq。其中，所述的RAD-seq测序样本采用ddRAD建库方式构建pair-end文库，所文库长度范围优选在300-500bp。
简化基因组测序(reduced-representation sequencing)是在新一代测序基础上发展起来的一种新型测序方法，该方法利用限制性内切酶对基因组进行酶切，只选取基因组特定区域进行测序，从而降低了基因组的复杂程度。限制性酶切位点关联DNA测序技术(restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-seq)是在二代测序技术基础上发展起来的一种简化基因组技术。RAD测序文库构建是对基因组DNA片段进行酶切和随机打断，选取一端带有酶切位点，另一端为随机打断点的片段进行建库测序。RAD-seq不仅实验操作简单，性价比高，更为重要的是它并不依赖参考基因组的信息，一次测序即可获得数以万计的多态性遗传标记。
单酶切RAD建库为利用单一的限制性内切酶和随机打断对基因组进行切割，由于单酶切缺少方向性导致的酶切位点两边相邻的100bp序列都可能被测出，因此序列分散度高而准确性低。在本申请优选的实施方式中采用ddRAD双酶切系统对基因组进行切割并且辅以对酶切后产物大小的选择，可以把序列固定在两端为不同酶切位点并且长度为500bp左右。采用ddRAD双酶切建库的方式，得到的文库长度大小适中，测序效率高，具有不易测出过多的接头序列导致的数据质量低和由于文库片段过长导致的文库中间部分测序不充分，数据流失的缺点，能够在改善测序效率的同时减少试验成本。
在一个优选的实施方式中，高通量测序检测的质控条件包括如下：Q20>95％、ddRAD depth>60％、在所有鸡种群体中的SNP Call rate>70％、在单个鸡种中SNP Callrate>90％和MAF>0.05。
需要说明的是，Q20表示正确率99％的碱基数目比例；ddRAD depth表示SNP的测序深度；SNP call rate表示核酸多态性检出率；MAF表示最小等位基因频率。
在一个优选的实施方式中，计算遗传统计量包括观察杂合度Ho值、核苷酸多样度Pi值、近交系数Fis值、群体分化系数Fst值、平均基因流Nm和群体θπ值。在一个优选的实施方式中，所述分析方法包括连锁不平衡分析、群体聚类分析、选择消除分析和基因功能富集分析。
连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)是指在某一群体中，不同座位上某两个基因同时遗传的频率明显高于预期的随机频率的现象。一般来说，在连锁不平衡分析中，野生种的LD值较低，而驯化种由于受到了正选择的作用，LD值就会偏大，优选采用Haploview软件分析东乡绿壳蛋鸡的LD。
群体聚类分析技术是目前基因表达分析研究的主要计算技术之一。它能将功能相关的基因按表达谱的相似程度归纳成共同表达类别，有助于对基因功能、基因调控、细胞过程及细胞亚型等进行综合研究。优选采用MEGA软件NJ聚类法进行聚类分析。
选择消除分析就是基因组某区域由于受到了选择而消除多态性。选择消除分析是正向选择在物种基因组上留下的印迹。与野生祖先相比，栽培或驯化的物种发生选择消除的区域遗传多样性显著降低，这是驯化区域的典型特征。在一些优选的实施方中优选使用PLINK软件检测选择信号，进行选择消除分析，选择信号检测条件优选为以100kb为窗口，10kb为step进行滑动的θπ值和Fst分布计算，0≤Fst≤1，Fst越接近1表示亚种群间的种群分化越明显。。
基因功能富集分析中的基因功能指的是众多代表一定的基因功能特征和生物过程的基因功能集。由这些基因功能集构成的常用基因功能数据库有GO和KEGG，因此优选基于GO数据库和KEGG数据库进行基因富集分析。
基因本体数据库(gene ontology，GO)涵盖了基因生物学过程、分子功能和细胞组分三个方面，GO数据库通过控制注释词汇的层次结构从不同层面查询和使用基因注释信息，从整体上看，GO注释系统是一个有向无环图结构，包含基因生物学过程、分子功能和细胞组分三个节点，注释系统中每一个节点都是对基因或蛋白质的描述，因此，一个基因可以从三个方面得到注释。京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia of genesand genomes，KEGG)是系统分析基因功能和基因组信息的数据库，整合了基因组学、生物化学以及功能组学的信息，KEGG提供了整合代谢途径查询，包括碳水化合物、核苷酸、氨基酸等代谢及有机生物的降解。
在一个优选的实施方式中，其他鸡种群体包括：文昌鸡、大围山微型鸡、藏鸡、安义瓦灰鸡、河南斗鸡、固始鸡、仙居鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、边鸡、狼山鸡、白耳黄鸡、瓢鸡、惠阳胡须鸡、金湖乌凤鸡、茶花鸡、大骨鸡、北京油鸡、隐性白羽肉鸡和安卡红鸡。上述各种类鸡囊括蛋用型、肉用型、兼用型、观赏、药用型地方品种和国外标准鸡种，广泛分布于我国黄土高原区、青藏高原区、蒙新高原区、西南山地区、黄淮海区、东北区、东南区等地理生态区域，能够充分代表鸡的差异化品种类型，因此能够准确地鉴定出东乡绿壳蛋鸡品种的特异性分子标记。
在一个优选地实施方式中，东乡绿壳蛋鸡群体与其他鸡种群体相比较，通过Fst和θπ检验，在东乡绿壳蛋鸡中鉴定出20个受选择区域、108个受选择基因。GO和KEGG分析表明筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记主要富集的生物学通路包括：离子及碳酸盐转运生物学通路、适应性免疫生物学通路和昼夜节律调节生物学通路。
本发明还提供了上述筛选方法在如下a)-e)中的一种或多种的应用：a)家系管理；b)个体识别；c)遗传多态性位点分析；d)种质资源鉴定；e)新品系选育。
为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。其中建库测序部分由南京集思慧远生物科技有限公司完成；试剂全部为市售常规试剂；东乡绿壳蛋鸡保种群体与其他品种保种群体来自于江苏省家禽科学研究所的国家级地方鸡种基因库。
实施例1东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选
(a)血液样品采集：东乡绿壳蛋鸡保种群体及对照组18个地方鸡品种(狼山鸡、安义瓦灰鸡、固始鸡、仙居鸡、白耳黄鸡、河南斗鸡、金湖乌凤鸡、文昌鸡、大围山微型鸡、藏鸡、茶花鸡、瓢鸡、惠阳胡须鸡、大骨鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、边鸡和北京油鸡)和2个引入鸡品种(隐性白羽肉鸡和安卡红鸡)自于江苏省家禽科学研究所的国家级地方鸡种基因库，每个群体按照家系选择30个个体(10公、20母)，并且个体间无亲缘关系。样品为翅静脉血1mL-1.5mL，抗凝剂选用柠檬酸钠(ACD)，样品于-20℃保存备用。
(b)DNA样品获取：常规酚-氯仿法提取所有品种基因组DNA。将获得的DNA进行质检，包括Nanodrop初步检测DNA样品浓度；电泳检测DNA的完整性，包括DNA有无降解，是否存在蛋白质和RNA等其他杂质污染；Qubit 2.0对DNA样品进行准确定量，选取质量≥1ug的样品。将合格样品置于-80℃保存，以备建库测序使用。
(c)建库测序：质检合格的样品采用ddRAD建库的方式构建长度范围在300-500bp的pair-end文库，然后进行RAD-seq简化基因组测序。将得到的raw reads数据进行过滤得到clean reads，过滤标准为：①去除接头污染的reads；②去除质量值小于5的碱基占整条reads比例超过50％的reads；③去掉测为N的碱基占整条reads比例超过10％的reads。
(e)SNP的检测主要使用GATK和samtools软件工具包实现。质控条件包括Q20>95％、ddRAD depth>60％、在所有鸡种群体中的SNP Call rate>70％、在单个鸡种中的SNPCall rate>90％和MAF>0.05。通过数据质控，在东乡绿壳蛋鸡群体中鉴定出SNP 294605个，SNP数量与染色体长度呈正相关，大染色体上SNP分布较多，其中1～7号及Z染色体上SNP数量均超过10,000个，小染色体上SNP分布较少，结果如下表1和图1所示。
表1东乡绿壳蛋鸡SNP在染色体上的分布图
(f)利用PLINK软件对所有品种进行连锁不平衡(LD)分析发现在总体范围内，东乡绿壳蛋鸡群体和其它地方鸡种群体各等位基因不存在强烈的连锁不平衡现象，结果如图2所示。
(g)PopGen软件计算近交系数Fis、核苷酸多样度Pi、群体分化指数Fst和观察杂合度Ho，得到东乡绿壳蛋鸡群体近交系数Fis为0.1674，核苷酸多样度Pi为0.2152，观察杂合度Ho为0.1792，与其他18个地方鸡种相比遗传多样性相对匮乏，东乡绿壳蛋鸡的平均遗传分化系数Fst为0.1739，在以引入品种为外群的系统发育树中形成一个独立的分支。
(h)利用MEGA软件NJ聚类法进行群体聚类分析，结果表明，东乡绿壳蛋鸡与河南斗鸡之间的遗传分化系数Fst最高(0.2354)，其次为北京油鸡(0.2025)和固始鸡(0.1948)，相对应的基因流Nm分别为0.8118、0.9848和1.0335。以隐性白羽肉鸡、安卡红鸡做外群构建的NJ聚类结果表明，东乡绿壳蛋鸡DJ形成了一个相对独立的分支结果如图3所示。
附图中缩写表示：BE-白耳黄鸡；ZZ-藏鸡；CH-茶花鸡；XJ-仙居鸡；GS-固始鸡；DG-大骨鸡；BY-北京油鸡；DX-东乡绿壳蛋鸡；HX-惠阳胡须鸡；JH-金湖乌凤鸡；LS-狼山鸡；XS-萧山鸡；WH-瓦灰鸡；WX-大围山微型鸡；WC-文昌鸡；PJ-瓢鸡；DJ-斗鸡；LY-鹿苑鸡；BJ-边鸡；RW-隐性白羽肉鸡；AK-安卡红鸡。
(i)选择信号检测采用PLINK软件，以100kb为窗口，10kb为step进行滑动的θπ值和Fst分布计算。
(j)对受选择的基因进行GO和KEGG注释，确定受选择的基因与东乡绿壳蛋鸡群生物学特性的关系，结果如图4和图5所示，结合核苷酸多样度θπ比率和遗传分化系数Fst的选择信号分析发现20个染色体区域受到选择，108个受选择基因。功能分析结果表明，筛选出的能够鉴定东乡绿壳蛋鸡品种特性的分子标记主要富集的功能区域包括：离子及碳酸盐转运，适应性免疫，昼夜节律调节等生物学通路。
一是绿壳性状的形成。绿壳是东乡绿壳蛋鸡最显著的品种特征，是由胆绿素沉积在蛋壳中形成的。SLCO基因编码有机离子转运蛋白(OATP)家族成员，具有胆盐跨膜运输功能。本文发现多个OATP家族成(SLCO4C1、SLCO2A1、SLCO1C1和SLCO1A2)受到选择。另外，发现与血红素(胆绿素形成的前体物)结合和转运相关的基因SLC48A1、JAK2、TPO等也受到了选择。在绿壳蛋鸡群体中，即使所有个体蛋壳颜色均为绿色，其颜色的深浅仍存在较大变异。这些受选择基因决定了蛋壳颜色的深浅程度。
二是蛋壳的钙化和昼夜节律调节。蛋壳对于禽类的繁殖至关重要，可以保护禽蛋免受外力破损和微生物侵入，在孵化过程中调节新陈代谢水分和气体交换、为胚胎发育提供钙质和矿物质。蛋壳的这些生物学特性是长期进化形成的。在本实施例中检测到多个与蛋壳钙化相关的基因受到了选择，包括(1)钙离子转运蛋白基因(Na+/Ca2+转运体SLC24A2、Na+/HCO3-转运体SLC4A4、碳酸盐转运SLC26A6、碳酸酐酶CA9、瞬时性受体电位通道家族TRPM6等；(2)成骨细胞与破骨细胞转换基因(维生素D3受体B RORB、RYK)，髓质骨是雌禽在性成熟后骨髓腔内形成的独特骨结构，髓质骨表面存在大量的成骨细胞和破骨细胞，为蛋壳钙化提供充足的钙源，并伴随产蛋周期通过吸收与重建保持蛋鸡体内钙离子的动态平衡。(3)激素基因，雌(雄)激素代谢基因HSD17B4、甲状腺激素生成基因FOXE3受到了选择，研究已证实雌(雄)激素刺激性成熟后和产蛋期的髓质骨形成，甲状腺激素能调控钙代谢平衡进而影响蛋壳钙化及蛋壳品质。同时，发现SOX14等昼夜节律调控基因也受到了选择，这与髓质骨周期、产蛋周期的调节密切相关。这些受选择基因的作用使得东乡绿壳蛋鸡具有较强的钙离子活性，形成了蛋壳厚和蛋壳强度高的特征，进而有助于产蛋性能的选育提高和骨质疏松症发生的预防。
三是适应性免疫。受选择基因(PELI2、RAB3C)广泛参与了适应性免疫的多个方面，包括炎症反应、抗原递呈、B细胞、NK-T细胞、Toll样细胞，白细胞介素、胸腺发育及抗菌等，这些基因的选择作用使得东乡绿壳蛋鸡具有较强的抗病力。
实施例2东乡绿壳蛋鸡分子标记的应用
(a)东乡绿壳蛋鸡保种群个体血液采集：使用医用一次性注射器采集保种群随机选留公、母鸡翅静脉全血0.5-1.0ml(公鸡不少于10只，母鸡不少于20只)，采集后迅速注入含有2μL 0.5mol/L Na2EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用。
(b)DNA提取和质量检测：常温下吸出无酶管中保存备用的公、母鸡个体血液0.2-0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；将合格样品置于-80℃保存，以备SNP检测使用。
(c)东乡绿壳蛋鸡品种特异性基因的SNP标记检测
引物设计：对筛选得到的东乡绿壳蛋鸡品种特性基因的SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位点的一段序列。利用鸡基因组DNA作为模板，使用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增。
PCR扩增和检测：PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板，其浓度为100ng/μL，2μL10×PCRBuffer，1.5μLdNTP，浓度为10mmol/L，上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL，Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL，ddH2O13.3μL；PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用；把PCR产物送入上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。
(d)东乡绿壳蛋鸡保种效果的评价，结果如下表2所示：
表2东乡绿壳蛋鸡保种效果的评价
本发明采用计算机模拟方法研究了一对基因在群体内的实际频率和假设不同基因频率和不同群体规模闭锁群体内单个双等位基因座位的遗传漂变，发现不同初始基因频率下4种群体规模100次重复模拟中等位基因A发生丢失的概率。可以看出：无论在何种初始频率下，等位基因A固定的次数均随着群体规模的降低而升高，且A发生固定的概率受其初始频率的影响较为明显。当初始频率为0.1时，规模为100只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为4.4％和1.49％，当初始频率为0.5时，100只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为2.4％和0.8％。即使到了20世代，规模为400只的群体发生A的丢失或固定仅为1.2％。当初始频率为0.9时，100只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为0.4％和0.1％。这表明，初始频率过低将会加速基因在群体中的丢失(见表3)。
表3不同基因频率和群体规模下1对等位基因固定概率的数学模型理论预测结果
本申请将东乡绿壳蛋鸡品种特性记基因的等位基因频率75％作为临界点，大于75％的基因频率代表东乡绿壳蛋鸡保种效果较好(主要的种质特性不丢失、不下降)，由上表2可知在保种过程中未发生较强的遗传漂变。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种东乡绿壳蛋鸡基因组SNP分子标记的筛选方法，其特征在于，包括：通过高通量测序检测，然后计算遗传统计量，再分析东乡绿壳蛋鸡与其他鸡种群体的遗传差异，最后筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的高通量测序采用简化基因组测序方法，优选采用RAD-seq。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的RAD-seq测序样本采用ddRAD建库方式构建pair-end文库；
优选地，所述文库长度范围在300-500bp。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述高通量测序检测的质控条件为：Q20>95％、ddRAD depth>60％、在所有鸡种群体中的SNP Call rate>70％、在单个鸡种中SNP Call rate>90％和MAF>0.05。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述计算遗传统计量包括观察杂合度Ho值、核苷酸多样度Pi值、近交系数Fis值、群体分化系数Fst值、平均基因流Nm和群体θπ值。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述分析方法包括连锁不平衡分析、群体聚类分析、选择消除分析和基因功能富集分析。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述基因功能富集分析是基于GO和KEGG的富集分析方法。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述其他鸡种群体包括：文昌鸡、大围山微型鸡、藏鸡、安义瓦灰鸡、河南斗鸡、固始鸡、仙居鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、边鸡、狼山鸡、白耳黄鸡、瓢鸡、惠阳胡须鸡、金湖乌凤鸡、茶花鸡、大骨鸡、北京油鸡、隐性白羽肉鸡和安卡红鸡。
9.根据权利要求1-8任一项所述的筛选方法，其特征在于，筛选出东乡绿壳蛋鸡SNP分子标记主要富集的生物学通路包括：离子及碳酸盐转运生物学通路、适应性免疫生物学通路和昼夜节律调节生物学通路。
10.如权利要求1-9任一项所述的筛选方法在如下a)-e)中的一种或多种的应用：
a)家系管理；
b)个体识别；
c)遗传多态性位点分析；
d)种质资源鉴定；
e)新品系选育。
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