CN106086172A - 一种鸡保种群个体选配优化的方法 - Google Patents

一种鸡保种群个体选配优化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡保种群个体选配优化的方法，提取鸡保种群留种公、母鸡个体血液DNA，通过简化基因组测序技术进行测序，并与GenBank数据库参考鸡种进行序列比对，找到存在于不同个体上的SNP位点。通过这些SNP位点的等位基因频率和基因型频率计算出个体自身近交系数和个体间亲缘关系系数，根据统计量的值优化个体选配，避开近交系数过高个体及家系内亲缘关系系数过高交配组合，从而达到降低保种群近交水平和维持遗传多样性总量稳态的目的。通过本发明，能有效解决鸡品种资源保护过程中存在的依靠系谱信息无法进行个体精细选配的难题，能有效降低保种群近交水平，进而达到维持遗传多样性稳态，提高保种效果和保种效率的目的。

Description

一种鸡保种群个体选配优化的方法
技术领域
本发明公开了一种鸡保种群个体选配优化的方法，属于保护遗传学、分子生物学领域。
背景技术
科学地保护好我国地方鸡品种资源所承载的遗传多样性，对我国乃至世界家禽产业可持续发展意义重大。
目前，地方鸡品种资源主要由各级保种场、基因库采用小规模家系保种群进行保护，活体保存是最主要的保护方式。针对有限规模保种群，世代延续过程中，近交和遗传漂变会导致遗传多样性丢失。未来资源保护的发展趋势，是以最小的群体规模来最大限度地维持一个品种的遗传多样性稳态。因此，保种过程中必需对保种群的个体选配制度实施管理。传统的个体选配方法依靠系谱记录，即继代繁殖时根据系谱信息避开全同胞或半同胞个体，以避免近交水平的过快增加。然而，研究发现这种方法的效果并不理想，常难以实施，因为保种过程中系谱记录不完整或有错误现象普遍存在。更为关键的是，在保种群组建之初，基础群个体自身的近交系数及个体间的亲缘关系是未知的，尤其是针对那些濒危资源群体；基础群个体最初(0世代家系)人为的随机交配组合会不同程度地降低该群体的现实遗传多样性总量，而且随着世代数的增加，这种损失会愈发严重。这显然限制了系谱信息管理方式的使用。因此，有必要提供一种个体选配优化的方法，以实现保种群个体选配的精细遗传管理。
随着高通量分子标记检测技术的不断发展，全基因组标记信息的使用为鸡品种资源保护提供了新机遇。基于新一代测序技术，几乎能够在所有物种全基因组水平上高密度地检测出单核苷酸多态(SNP)标记信息。利用全基因组SNP标记信息能够显著提高群体遗传学统计量度量的准确性，而且不依赖于系谱信息，这使得保种群个体选配的精细遗传管理成为可能，已经成为目前资源保护领域的一个研究热点。
发明内容
本发明的目的针对在鸡保种过程中，依靠系谱信息无法进行个体选配的精细管理(尤其是针对濒危资源群体)，会导致保种群的遗传多样性总量不同程度地降低的问题，提供一种鸡保种群个体选配优化的方法。
本发明是这样实现的，一种鸡保种群个体选配优化的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)保种群留种公、母鸡个体血液采集；
使用医用一次性注射器采集保种群或基础群留种公、母鸡翅静脉全血0.5～1.0ml，采集后迅速注入含有2μL 0.5mol/L Na2EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用；
(2)保种群留种公、母鸡个体血液DNA提取和质量检测；
常温下吸出无酶管中保存备用的保种群留种公、母鸡个体血液0.2～0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；
(3)文库构建和简化基因组测序；
①提取后质检合格的基因组DNA 500ng，加入0.6U EcoRI、T4DNA连接酶、ATP和EcoRI接头(含区分样品的Index序列)在37℃下反应3小时，65℃退火1小时，然后加限制性内切酶NlaIII和NlaIII接头在37℃下反应3小时，反应结束后在65℃PCR仪中放置30分钟失活内切酶；
②使用琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行片段选择，选择400-600bp回收酶切产物；
③使用Qubit3.0对回收产物进行DNA定量，等量混合样品；
④使用Illumina TruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建；
(4)原始序列数据统计和过滤
测序得到的原始序列含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，对raw reads过滤，得到clean reads用于后续分析；数据过滤的步骤如下：①去除带接头的paired-end reads；②当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired-end reads；③当单端测序read中含有的低质量碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired-end reads；
(5)过滤后Clean reads序列数据比对
过滤后得到的clean reads有效测序数据比对到Gallus_gallus.WASHUC鸡参考基因组；
(6)单核苷酸多态位点SNP鉴定
根据比对结果，选取样品平均深度在5以上的group，定义ddRAD标记，进行基于样品的群体内部SNP检测；
(7)遗传学统计量计算
根据个体SNP鉴定结果，采用常规遗传学统计软件基于等位基因频率计算出个体分子近交系数F和个体间分子亲缘关系系数f；
(8)个体选配优化；
根据分子遗传学统计量结果进行个体选配优化，降低群体的总体近交水平：①剔除自身分子近交系数F>0.0625的留种公、母鸡个体，不参与保种群下一世代的繁殖；②保留的公、母鸡个体合并，并随机组建新的家系，每一家系内严格避开分子亲缘关系系数f>0.125的公、母鸡交配组合，具体家系数量根据保留的公、母鸡数量而定，公母配比一般为1:10～12。
所述步骤(2)中，琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度要求电泳条带清晰单一，无降解及RNA污染；分光光度计检测DNA的纯度要求OD260/280值>1.8。
所述步骤(7)中，常规遗传学统计软件为Coancestry或METAPOP。
本发明方法先进科学，通过本发明，简言之，包括以下步骤：(1)血液采集无酶管加入0.5mol/L Na2EDTA抗凝剂2μL收集保种群(或基础群)留种公、母鸡翅静脉血样0.5～1.0ml，4℃保存备用。(2)简化基因组测序；利用苯-酚抽提法提取个体血液DNA，进行简化基因组测序，选取Gallus_gallus.WASHUC 2.70作为序列比对参考基因组。(3)SNP位点鉴定；统计每个个体平均原始reads，过滤低深度和低完整度reads获得ddRAD标签；通过与参考基因组序列比对鉴定出位于ddRAD标签上的SNP。(4)统计量计算；根据个体SNP等位基因频率计算出个体自身分子近交系数(F)和个体间分子亲缘关系系数(f)。(5)个体选配优化；根据分子信息统计量进行个体选配优化：(1)剔除自身分子近交系数F>0.0625的留种公、母鸡个体；(2)家系内避开分子亲缘关系系数f>0.125的公、母鸡交配组合。
有益效果：
本发明结果能够实现鸡保种群个体选配的精细遗传管理，能有效降低保种群近交水平和维持遗传多样性总量稳态，是对现有保种技术方法的优化和提升。也适用于其它畜禽资源保种群个体选配的优化。
本发明，通过提取保种群鸡个体血液DNA，利用简化基因组测序技术检测基因组SNP标记，根据基因组信息统计量结果进行个体选配优化，能有效解决鸡品种资源保护过程中存在的依靠系谱信息无法进行个体精细选配的难题，能有效降低保种群近交水平，进而达到维持遗传多样性稳态，提高保种效果和保种效率的目的。
附图说明
图1为本发明的个体选配优化方案图。
具体实施方式
下面结合附图以及附图说明对本发明做进一步的说明。
本发明的目的是建立一种鸡保种群个体选配优化的方法。本发明的技术方案是：提取鸡保种群(或基础群)留种公、母鸡个体血液DNA，通过简化基因组测序技术进行测序，并与GenBank数据库参考鸡种进行序列比对，找到存在于不同个体上的SNP位点。通过这些SNP位点的等位基因频率和基因型频率计算出个体自身近交系数和个体间亲缘关系系数，根据统计量的值优化个体选配，避开近交系数过高个体及亲缘关系系数过高交配组合，从而达到降低保种群近交水平和维持遗传多样性总量稳态的目的。所采用的技术方法以及所获得的结果如下所示：
技术方法：
一种鸡保种群个体选配优化的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)保种群留种公、母鸡个体血液采集；
使用医用一次性注射器采集保种群或基础群留种公、母鸡翅静脉全血0.5～1.0ml，采集后迅速注入含有2μL 0.5mol/L Na2EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用；
(2)保种群留种公、母鸡个体血液DNA提取和质量检测；
常温下吸出无酶管中保存备用的保种群留种公、母鸡个体血液0.2～0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度(电泳条带清晰单一，无降解及RNA污染)，分光光度计检测DNA的纯度(OD260/280值>1.8)；
(3)文库构建和简化基因组测序；
①提取后质检合格的基因组DNA 500ng，加入0.6U EcoRI(NEB)、T4DNA连接酶(NEB)、ATP(NEB)和EcoRI接头(含区分样品的Index序列)在37℃下反应3小时，65℃退火1小时，然后加限制性内切酶NlaIII(NEB)和NlaIII接头在37℃下反应3小时，反应结束后在65℃PCR仪中放置30分钟失活内切酶；
②使用琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行片段选择，选择400-600bp回收酶切产物；
③使用Qubit3.0(Life Technology)对回收产物进行DNA定量，等量混合样品；
④使用Illumina TruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建；
(4)原始序列数据统计和过滤；
测序得到的原始序列(Raw Reads)含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，对raw reads过滤，得到clean reads用于后续分析；数据过滤的步骤如下：①去除带接头(adapter)的paired-end reads；②当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired-end reads；③当单端测序read中含有的低质量(Q<＝5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired-end reads；
(5)过滤后Clean reads序列数据比对；
过滤后得到的clean reads有效测序数据比对到Gallus_gallus.WASHUC鸡参考基因组；
(6)单核苷酸多态位点SNP鉴定；
根据比对结果，选取样品平均深度在5以上的group，定义ddRAD标记，进行基于样品的群体内部SNP检测；
(7)遗传学统计量计算；
根据个体SNP鉴定结果，采用常规遗传学统计软件(如Coancestry[1]或METAPOP[2])基于等位基因频率计算出个体分子近交系数F和个体间分子亲缘关系系数f；
[1]COANCESTRY:a program for simulating,estimating and analysingrelatedness and inbreeding coefficients.Molecular Ecology Resources(2011)11,141–145
[2]METAPOP:A software for the management and analysis of subdividedpopulations in conservation programs.Conservation Genetics 10:1097-1099
(8)个体选配优化；
根据分子遗传学统计量结果进行个体选配优化，降低群体的总体近交水平：①剔除自身分子近交系数F>0.0625的留种公、母鸡个体，不参与保种群下一世代的繁殖；②保留的公、母鸡个体合并，并随机组建新的家系，每一家系内严格避开分子亲缘关系系数f>0.125的公、母鸡交配组合，具体家系数量根据保留的公、母鸡数量而定，公母配比一般为1:10～12。
具体个体选配优化方案如图1所示。
结果：利用简化基因组测序和分子统计量计算，获得了鸡保种群留种公、母个体自身分子近交系数和个体间分子亲缘关系系数，通过剔除自身分子近交系数F>0.0625的留种个体及避开家系内分子亲缘关系系数f>0.125的交配组合，实现了鸡保种群个体选配的精细遗传管理，能有效降低保种群近交水平，弥补了因系谱信息不全或基础群个体最初随机交配组合所造成的现实遗传多样性总量损失，达到维持遗传多样性总量稳态，提高保种效果和保种效率的目的。此专利是对现有鸡小规模家系保种技术方法的优化和提升。

Claims (3)

1.一种鸡保种群个体选配优化的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)保种群留种公、母鸡个体血液采集；
使用医用一次性注射器采集保种群或基础群留种公、母鸡翅静脉全血0.5～1.0ml，采集后迅速注入含有2μL 0.5mol/L Na2 EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用；
(2)保种群留种公、母鸡个体血液DNA提取和质量检测；
常温下吸出无酶管中保存备用的保种群留种公、母鸡个体血液0.2～0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；
(3)文库构建和简化基因组测序；
①提取后质检合格的基因组DNA 500ng，加入0.6U EcoRI、T4 DNA连接酶、ATP和EcoRI接头在37℃下反应3小时，65℃退火1小时，然后加限制性内切酶NlaIII和NlaIII接头在37℃下反应3小时，反应结束后在65℃PCR仪中放置30分钟失活内切酶；
②使用琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行片段选择，选择400-600bp回收酶切产物；
③使用Qubit3.0对回收产物进行DNA定量，等量混合样品；
④使用Illumina TruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建；
(4)原始序列数据统计和过滤
测序得到的原始序列含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，对rawreads过滤，得到clean reads用于后续分析；数据过滤的步骤如下：①去除带接头的paired-end reads；②当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired-end reads；③当单端测序read中含有的低质量碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired-end reads；
(5)过滤后Clean reads序列数据比对
过滤后得到的clean reads有效测序数据比对到Gallus_gallus.WASHUC鸡参考基因组；
(6)单核苷酸多态位点SNP鉴定
根据比对结果，选取样品平均深度在5以上的group，定义ddRAD标记，进行基于样品的群体内部SNP检测；
(7)遗传学统计量计算
根据个体SNP鉴定结果，采用常规遗传学统计软件基于等位基因频率计算出个体分子近交系数F和个体间分子亲缘关系系数f；
(8)个体选配优化
根据分子遗传学统计量结果进行个体选配优化，降低群体的总体近交水平：①剔除自身分子近交系数F>0.0625的留种公、母鸡个体，不参与保种群下一世代的繁殖；②保留的公、母鸡个体合并，并随机组建新的家系，每一家系内严格避开分子亲缘关系系数f>0.125的公、母鸡交配组合，具体家系数量根据保留的公、母鸡数量而定，公母配比一般为1:10～12。
2.根据权利要求1所述的一种鸡保种群个体选配优化的方法，其特征是，所述步骤(2)中，琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度要求电泳条带清晰单一，无降解及RNA污染；分光光度计检测DNA的纯度要求OD260/280值>1.8。
3.根据权利要求1所述的一种鸡保种群个体选配优化的方法，其特征是，所述步骤(7)中，常规遗传学统计软件为Coancestry或METAPOP。
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